番茄沉默轉(zhuǎn)基因植株的獲得及功能初探

劉斯超+許濤+董秀芬+付欣+鄭鵬靖+李兵

摘要：Aux/IAA（auxin/indole-3-acetic acid）作為生長(zhǎng)素早期響應(yīng)因子，其蛋白產(chǎn)物能夠特異性地結(jié)合生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（auxin response factor，ARF），從而調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)，在整個(gè)植物生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究通過(guò)構(gòu)建沉默載體，在高效遺傳轉(zhuǎn)化體系下獲得轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)利用Gateway克隆技術(shù)將番茄生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因 Domain Ⅱ區(qū)部分序列連入具有正反2個(gè)attr區(qū)域并連接1個(gè)內(nèi)含子的pB7GWIWG2（Ⅰ）載體，可在植株體內(nèi)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)導(dǎo)致植物基因沉默，成功構(gòu)建基因沉默表達(dá)載體名為SlIAA RNAi；此外，抗生素噴施和PCR擴(kuò)增以及實(shí)時(shí)定量檢測(cè)進(jìn)一步鑒定，共獲得12棵 RNAi陽(yáng)性植株。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步明確SlIAA的生物學(xué)功能和闡明生長(zhǎng)素的作用機(jī)理提供參考。

關(guān)鍵詞：番茄；生長(zhǎng)素；；載體構(gòu)建；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： Q785；Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0029-04

生長(zhǎng)素（IAA）在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育中起著重要的作用，它不僅可以作用于細(xì)胞膜引起細(xì)胞的快速反應(yīng)，而且還能夠在分子水平上特異性地調(diào)控基因表達(dá)[1-2]。Aux/IAA作為生長(zhǎng)素信號(hào)反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)控因子，已經(jīng)在擬南芥、番茄等模式植物中進(jìn)行了廣泛的研究[3]。Aux/IAA基因?qū)儆诙嗷蚣易?，目前在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)有29個(gè)Aux/IAA家族基因，水稻和玉米中均有31個(gè)成員，黃瓜中有28個(gè)，棉花上有10個(gè)，馬鈴薯中有27個(gè)，蘋果中有40個(gè)，草莓、高粱和番茄中有26個(gè)Aux/IAA家族成員[4-10]。

通過(guò)對(duì)擬南芥功能獲得性突變體的研究，發(fā)現(xiàn)多數(shù)都是由Aux/IAA蛋白Domain Ⅱ核心區(qū)（VGWPP）的某個(gè)氨基酸的改變引起的，如Aux/IAA基因的突變會(huì)引起生長(zhǎng)素反應(yīng)因子（ARF）功能的紊亂，使植株出現(xiàn)生長(zhǎng)素相關(guān)的異常表型，對(duì)生長(zhǎng)素敏感性出現(xiàn)升高或降低

目前有關(guān)番茄基因在生長(zhǎng)發(fā)育中的作用尚無(wú)詳盡報(bào)道。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段獲得 RNAi植株，在對(duì)呈現(xiàn)的表型進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，探討調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的作用機(jī)制，這有利于深化對(duì)Aux/IAA功能的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步了解生長(zhǎng)素及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制，指導(dǎo)我們?cè)谏a(chǎn)實(shí)踐中利用生長(zhǎng)素及轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)節(jié)植株生長(zhǎng)與發(fā)育、果實(shí)成熟及產(chǎn)量提升等[9]。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，供試番茄品種為中蔬6號(hào)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。供試植物總DNA及RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒等購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Prime STAR、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA marker及反轉(zhuǎn)錄藥品等購(gòu)自寶生物工程淵有限公司，其他常規(guī)藥品為國(guó)產(chǎn)分析純。pENTRTM/D-TO[JP2]PO Cloning Kit 和Gateway LR Clonase Enzyme Mix為 Invitrogen 公司產(chǎn)品。以除草劑bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的植物表達(dá)載體Pb7GWIWG2（I） （ http：//gateway.psb.ugent.be/vector/show/pB7GWIWG2%281%29/search/index/silencing/any）、[JP]大腸桿菌菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌LBA4404為筆者所在實(shí)驗(yàn)室留存。

1.2方法

1.2.1SlIAA沉默載體的構(gòu)建

根據(jù)已經(jīng)獲得的cDNA全長(zhǎng)，按照RNAi原理，設(shè)計(jì)引物F：5′-CACCGGGAATGAACTGGAATCG-3′，R：5′-CCGCTTTAGAGGCCGTGG-3′。PCR擴(kuò)增干擾片段并膠回收純化；TOPO Cloning及熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌；堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA。

1.2.2番茄植株 RNAi的遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的質(zhì)粒用電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化番茄，待轉(zhuǎn)化植株根系達(dá)到5 cm 時(shí)，將其移栽盆缽。

1.2.3陽(yáng)性植株的篩選

通過(guò)Blast搜索bar基因序列，設(shè)計(jì)引物。序列為F：5′-GATAATCATCGCAAGACC-3′；R：5′-TCGACCGTGTACGTCTC-3′。以未轉(zhuǎn)化的中蔬6號(hào)植株的基因組DNA作為陰性對(duì)照，遺傳轉(zhuǎn)化 RNAi載體質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增目的片段。PCR擴(kuò)增程序參照bar基因引物及酶的擴(kuò)增條件等來(lái)設(shè)定。

2結(jié)果與分析

2.1 RNAi表達(dá)載體PCR及酶切檢測(cè)

將測(cè)序成功的克隆重新提取質(zhì)粒，采用質(zhì)粒PCR的方法檢測(cè)終載體，挑去若干個(gè)單克隆，同時(shí)以空載體質(zhì)粒作為對(duì)照，用特異性引物進(jìn)行PCR。結(jié)果表明pB7G-IAA16表達(dá)載體已成功構(gòu)建，初步驗(yàn)證整合進(jìn)入目的載體。

對(duì)RNAi載體進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證SlIAA片段整合的正確性，特別是RNAi載體中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。選用了EcoRⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ這3種酶對(duì)構(gòu)建的RNAi載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用這3種酶切LR反應(yīng)前的載體pB7GWIWG2分別能切出3 237、3 180、2 167 bp的片段；LR反應(yīng)之后的載體用Hind Ⅲ酶切可以切出196 bp的片段以及另外2個(gè)大小的片段，這3個(gè)片段總長(zhǎng)為2 148 bp，因?yàn)楸具B入片段分別在第293、488 bp有該酶的酶切位點(diǎn)，XbaⅠ可以切出584 bp長(zhǎng)度的片段，而EcoRⅠ酶切位點(diǎn)位于ccdB基因上，因此LR反應(yīng)后不能切出片段。

2.2電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌檢測(cè)

將大腸桿菌中提取的 RNAi表達(dá)載體質(zhì)粒電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，利用含有壯觀霉素及利福平的YEP固體培養(yǎng)基平板篩選，并挑選單菌落PCR（酶切方法）檢測(cè)挑選陽(yáng)性克隆，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.3 RNAi植株的遺傳轉(zhuǎn)化

本試驗(yàn)所用的植物雙元載體pB7GWIWG2（[KG-*5]Ⅰ[KG-*5]）含有bar 基因（圖4），所以在整個(gè)過(guò)程中始終保持0.5 mg/L 草銨膦的抗性篩選，并建立了轉(zhuǎn)基因植株的再生體系，成功地獲得了再生植株。

2.4陽(yáng)性植株的篩選

2.4.1草銨膦（PPT）噴施篩選轉(zhuǎn)基因植株

對(duì)無(wú)草銨膦抗性的番茄幼苗，進(jìn)行草銨膦抗性噴施。噴施10 d后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)草銨膦濃度為 15 mg/L 時(shí)，幼苗生長(zhǎng)良好，下部葉片僅出現(xiàn)少量褐斑點(diǎn)；濃度為3 mg/L時(shí)，下部葉片出現(xiàn)黃化，仍能正常生長(zhǎng)；濃度為 6 mg/L 時(shí)，植株葉片黃化，生長(zhǎng)勢(shì)降低（圖6-a）。說(shuō)明篩選轉(zhuǎn)基因苗最佳濃度為6 mg/L。

[JP2]對(duì)轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)行6 mg/L的草銨膦噴施，4 d后觀察發(fā)現(xiàn)，不具有草銨膦抗性的轉(zhuǎn)基因植株真葉的葉邊緣開始黃化，葉片腐軟，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，黃化現(xiàn)象開始向整株葉片擴(kuò)散，生長(zhǎng)點(diǎn)灼傷，甚至出現(xiàn)植株死亡；而有草銨膦抗性的植株則無(wú)明顯變化（圖6-b、圖6-c）。通過(guò)噴施篩選得到33棵抗性植株。[JP]

2.4.2PCR篩選轉(zhuǎn)基因植株

選取已經(jīng)通過(guò)PPT篩選的轉(zhuǎn)基因植株12株，PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)條帶一致且純度較高的可以認(rèn)為DNA無(wú)降解，可用于下一步PCR檢測(cè)。在轉(zhuǎn)基因沉默植株中可以檢測(cè)到750 bp的PCR產(chǎn)物條帶，轉(zhuǎn)化植株的條帶與質(zhì)粒擴(kuò)增的條帶大小一致，大約都為750 bp。

利用RNA提取試劑盒提取總RNA，發(fā)現(xiàn)18S、28S條帶清晰，可用于cDNA的合成（圖8-a）。對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，發(fā)現(xiàn) 沉默植株22-01、22-05、22-17、22-03、22-14、22-10、22-07的表達(dá)量均顯著低于正常植株，分別降低75%、70%、60%、60%、55%、50%、50%（圖8-b）。這進(jìn)一步驗(yàn)證了前面篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株是陽(yáng)性植株，依據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果，主要選擇22-01轉(zhuǎn)基因株系作為主要研究對(duì)象。

2.6組織特異性表達(dá)分析

在qRT-PCR分析中，全部以功能葉為對(duì)照。在番茄的莖和花中表達(dá)較高，分別是對(duì)照的3倍和2.5倍，在果實(shí)中的表達(dá)相對(duì)較少（圖9-a）。在葉片不同部位的表達(dá)。結(jié)果顯示，在葉基和幼苗中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照，分別是對(duì)照的7倍和11倍（圖9-b）。在幼葉含量較高，在花蕾中表達(dá)水平很高，推測(cè)其主要存在于幼嫩部位，對(duì)早期發(fā)育有重要的調(diào)控作用（圖9-c）。在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期，其中在綠熟期階段，表達(dá)水平較高，隨著果實(shí)的不斷成熟，其表達(dá)水平逐漸降低，推測(cè)其

3討論與結(jié)論

將番茄基因Domain Ⅱ區(qū)部分序列連入pB7GWIWG（Ⅱ）載體，載體特點(diǎn)為具有2個(gè)連續(xù)倒置的序列片段并且中間含有內(nèi)含子，以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)導(dǎo)致基因沉默，成功構(gòu)建沉RNAi表達(dá)載體名為SlIAA RNAi表達(dá)載體。在構(gòu)建載體過(guò)程中本研究采用的方法是在傳統(tǒng)的基礎(chǔ)上略加改進(jìn)的載體構(gòu)建方式，即利用最新的入門克隆載體，該載體上已經(jīng)連入attL序列，這樣就跳過(guò)了BP反應(yīng)，直接將純化回收后的PCR產(chǎn)物通過(guò)TOPO克隆反應(yīng)連入入門克隆載體就可以進(jìn)行LR反應(yīng)了，與傳統(tǒng)BP加LR反應(yīng)相比更加方便快捷。在選擇入門克隆的時(shí)候要注意入門克隆載體與目的載體的抗性，二者的抗性要求是不同的，這樣在后續(xù)篩選陽(yáng)性克隆時(shí)也更加方便，本試驗(yàn)構(gòu)建的RNAi載體的入門克隆在片段連入時(shí)對(duì)連入的方向也進(jìn)行了選擇，所以在設(shè)計(jì)引物時(shí)在前引物的5′端增加了CACC 這4個(gè)堿基。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建的載體是1種二元載體，因此能直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化，從而為利用RNA干涉技術(shù)大規(guī)模、高通量的研究植物特異和未知基因功能打開方便之門。

轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)作為植物基因工程中的重要一環(huán)，越來(lái)越成為人們研究的重點(diǎn)。在本試驗(yàn)中，對(duì)沉默植株的檢測(cè)，主要通過(guò)外源噴施、PCR檢測(cè)、RT-PCR檢測(cè)等方法相互結(jié)合，來(lái)進(jìn)一步減少轉(zhuǎn)基因植株的假陽(yáng)性。雖然，組培篩選及葉片噴施篩選也存在一定的局限性，如葉片噴施草甘膦容易造成植株的大量減產(chǎn)，組培篩選也會(huì)因?yàn)樵跁r(shí)間的把握上存在差別而對(duì)草甘膦的反應(yīng)可能不敏感[15，18]。因此，這就需要在試驗(yàn)中盡量把握好種子萌發(fā)過(guò)程中草甘膦的濃度及處理時(shí)間，重點(diǎn)觀察幼嫩葉片對(duì)外源噴施篩選的反應(yīng)情況。

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