劉柏岑 +潘衛(wèi)東 +婁華勇 晏文濤++吳翱蘭+劉杰麟

摘要：研究戴氏蟲草菌絲體抑制腫瘤細胞增殖活性有效部位的化學成分及其抑制腫瘤細胞活性。采用液體深層發(fā)酵制備戴氏蟲草菌絲體，MTT法篩選其抑制腫瘤細胞增殖活性的有效部位，反復正相柱層析，Sephadex LH-20等方法分離純化其有效部位中的化學成分，利用EI、ESI及1D-NMR等技術對其結構進行鑒定；并研究他們對腫瘤細胞增殖的抑制活性。結果顯示，戴氏蟲草菌絲體石油醚、乙酸乙酯萃取部位為抑制腫瘤細胞增殖活性部位，并從中分離得到6個化合物，分別為反式-16-十八碳烯酸（化合物1）、壬二酸（化合物2）、5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇（化合物3）、亞油酸甲酯（化合物4）、亞油酸（化合物5）和十七-烷醇（化合物6）?；钚詸z測表明，化合物2對舌癌Tca-8113細胞增殖具有較高的抑制活性，IC50值為31.90 μmol/L，化合物3對乳腺癌MDA-MB-435細胞和BT474細胞具有較高的細胞增殖抑制活性，IC50值分別為25.57、26.31 μmol/L。從戴氏蟲草菌絲體抑制腫瘤細胞增殖的活性部位中分離到6個化合物，化合物1～2、4～6為首次從該菌絲體中分離得到。化合物2、3分別選擇性地對 Tca-8113 細胞和MDA-MB-435細胞、BT474細胞有較強的細胞增殖抑制活性，可能為戴氏蟲草菌絲體抑制腫瘤細胞增殖的有效成分。

關鍵詞：戴氏蟲草；菌絲體；單體化合物；MTT法；抑制腫瘤細胞增殖

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0174-04

戴氏蟲草（Cordyceps taii）及其無性型戴氏綠僵菌（Metahizium taii）是從貴州省都勻市茶場分離到的一種蟲草菌屬真菌[1]，屬于子囊菌綱肉座菌目麥角菌科蟲草菌屬，與中國傳統(tǒng)名貴中藥冬蟲夏草、蟬花、蛹蟲草等是同屬真菌，當?shù)孛耖g常將其作藥用和保健食品。戴氏蟲草多糖（CDP）可誘導紅白血病K562細胞與早幼粒白血病HL60細胞分別向紅細胞系和粒細胞系方向分化[2]。戴氏蟲草菌絲體的有效部位能明顯影響小鼠免疫器官指數(shù)，抑制腫瘤組織血管形成，并抑制惡性黑色素瘤細胞B16向肺轉移[3]。這提示戴氏蟲草菌絲體有潛力作為腫瘤治療的生物反應調節(jié)劑和癌化學預防藥物。迄今，對戴氏蟲草菌絲體在開發(fā)利用方面仍缺乏系統(tǒng)研究，有關其藥理活性物質基礎的報道甚少。本試驗通過對戴氏蟲草菌絲體95%乙醇提取物的石油醚和乙酸乙酯萃取部位進行抑瘤活性導向分離、純化，共得到6個化合物。其中，5個化合物均為首次從該真菌菌絲體中分離得到，并通過MTT法對這些化合物進行抑制腫瘤細胞增殖活性研究，以期為戴氏蟲草菌絲體的深入研究與開發(fā)利用提供科學依據。

1材料與方法

[HTK]1.1主要試劑與儀器[HT]

Sephadex LH-20（Amersham Biosciences公司），柱層析用硅膠（300～400、200～300、40～80目）、GF254薄層層析板（青島海洋化工廠），10%磷鉬酸顯色劑，二甲基亞砜（DMSO，Solarbio公司），高糖DMEM細胞培養(yǎng)基（Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青公司），0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司），青霉素鏈霉素混合液雙抗，臺盼藍（美國Sigma公司），順鉑凍干粉（齊魯制藥有限公司），甲基噻唑藍MTT（范博公司）。所用有機溶劑均為工業(yè)級試劑經重蒸純化處理。RZJ-APJ100L機械攪拌不銹鋼發(fā)酵罐（南京潤澤生物工程），INOVA-400 MHz核磁共振儀、WNMR-I 500 MHz核磁共振波譜儀（中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所），惠普HP-1200紫外分光光度測定儀，HP-5973型質譜儀（HP，美國），通用酶標儀（美國BIOTEK公司）。

1.2菌株培養(yǎng)

試驗用戴氏蟲草的無性型——戴氏綠僵菌菌株（GZ201206）保存于貴州醫(yī)科大學組織工程與干細胞實驗中心。種子/發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖25 g，酵母浸膏5 g，水1 L，pH自然。菌種培養(yǎng)條件：（28±0.5）℃，100 r/min，600 L/h溶氧量。

1.3細胞培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-435細胞（法國醫(yī)學科學研究院陸核教授饋贈），人乳腺癌BT474細胞和人舌癌Tca-8113細胞保存于貴州醫(yī)科大學組織工程與干細胞實驗中心細胞庫。復蘇細胞，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)孵箱中培養(yǎng)，2～3 d換液傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行試驗。

[HTK]1.4提取[HT]

戴氏蟲草發(fā)酵菌絲體3.4 kg，95%食用乙醇回流提取3次，每次1.5 h，合并過濾提取液，減壓濃縮得到食用乙醇提取浸膏。加適量水進行溶解浸膏，利用液液兩相萃取方法用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收得各萃取層浸膏，并用MTT法對3個萃取部位的抑制腫瘤細胞增殖活性進行研究。

[HTK]1.5戴氏蟲草菌絲體萃取部位抑制腫瘤細胞增殖活性的篩選方法[HT]

MDA-MB-435細胞以每孔10 000個接種于96孔培養(yǎng)板中，24 h后，于96孔板中加入已配制好的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇浸膏溶液各100 μL，其中每個浸膏的濃度依次為0.01、0.10、1.00 g/L，每組設3個復孔，3次獨立重復試驗，待加藥完畢后，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)；48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT液20 μL，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h；棄掉96孔板中的液體，每孔加入150～200 μL DMSO，室溫充分振蕩，使紫色結晶充分溶解，選擇490 nm波長測定各孔D值，計算細胞生長抑制率。

[JZ]腫瘤細胞生長抑制率=（1-D加藥組/D對照組）×100%。

式中：D對照組為不加藥品只加細胞液培養(yǎng)后的吸光度，D加藥組為細胞液和藥品共同培養(yǎng)后的吸光度。

[HTK]1.6戴氏蟲草菌絲體抑制腫瘤細胞增殖活性部位分離與純化[HT]

根據腫瘤細胞增殖抑制活性結果，對石油醚和乙酸乙酯浸膏（184.85 g）進行硅膠柱層析，其洗脫劑比例為石油醚 ∶[KG-*3]乙酸乙酯（100 ∶[KG-*3]1，50 ∶[KG-*3]1，10 ∶[KG-*3]1，5 ∶[KG-*3]1，4 ∶[KG-*3]1，2 ∶[KG-*3]1，1 ∶[KG-*3]1，0 ∶[KG-*3]1），乙酸乙酯 ∶[KG-*3]甲醇（10 ∶[KG-*3]1，5 ∶[KG-*3]1，1 ∶[KG-*3]1，0 ∶[KG-*3]1）梯度洗脫，得到混合組分13個，分別對組分Fr.4，F(xiàn)r.5，F(xiàn)r.10，F(xiàn)r.15進行反復正相硅膠柱層析，凝膠純化，重結晶等方法，借助TLC檢識，質譜、1H-NMR、13C-NMR數(shù)據與現(xiàn)有文獻的數(shù)據進行對比，分離得到化合物1（反式-16-十八碳烯酸[4]，30 mg）、化合物2（壬二酸[5-6]，25 mg）、化合物3（5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇[7-8]，15 mg）、化合物4（亞油酸甲酯[9-10]，5 mg），化合物5（亞油酸[11]，20 mg）、化合物6（十七-烷醇[12-13]，8 mg）。

[HTK]1.7單體化合物的抑制腫瘤細胞增殖活性的測定方法[HT]

MDA-MB-435細胞，BT474細胞，Tca-8113細胞，分別以每孔調整細胞8 000、7 000、10 000個接種于96孔培養(yǎng)板中，24 h后，于96孔板中加入已配制好的化合物2和化合物3各100 μL，其中每個藥物的濃度依次為3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μmol/L，每組設3個復孔，3次獨立重復試驗，后續(xù)操作參照“1.5”節(jié)，其中IC50用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2結果與分析

[HTK]2.1戴氏蟲草菌絲體不同萃取部位抑制腫瘤細胞增殖的活性[HT]

通過MTT法測定了戴氏蟲草菌絲體的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位不同濃度對乳腺癌MDA-MB-435細胞增殖的抑制活性，表1抑瘤活性評價結果提示，與未加藥組比較，石油醚、乙酸乙酯萃取部位均對MDA-MB-435細胞有較明顯增殖抑制活性，且在濃度1 g/L時，抑制作用最為明顯，其抑制率分別為（83.79±0.42）%、（76.84±1.55）%。正丁醇萃取部位對MDA-MB-435細胞抑制作用不明顯。隨著戴氏蟲草菌絲體的石油醚、乙酸乙酯萃取物濃度升高，抑制作用成劑量相關性。因此對該有效部位所含化學成分進行系統(tǒng)分離純化。

2.3戴氏蟲草菌絲體單體化合物的抑制腫瘤細胞增殖活性[HT]

通過MTT法檢測從戴氏蟲草菌絲體的腫瘤細胞增殖抑制活性部位中分離得到的小分子化合物：壬二酸（化合物2）和5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇（化合物3）對乳腺癌MDA-MB-435細胞、乳腺癌BT474細胞、舌癌Tca-8113細胞的增殖抑制活性（表2和表3）。結果所示，溶劑對照組DMSO在0.3%、0.2%、0.1%體積分數(shù)時，對腫瘤細胞無[CM（25]明顯增殖抑制活性。化合物2和化合物3對MDA-MB-[CM）]

[FK（W22][TPLBC1.tif][FK）]

435細胞、BT474細胞、Tca-8113細胞有不同程度的抑制活性。與未加藥組相比，具有顯著性差異（P<0.05）。其中，化合物2對舌癌Tca-8113細胞增殖具有較高的抑制活性，在濃度3.125～50 μmol/L時，呈較好劑量依賴關系，抑制率為（2.43±2.09）%、（14.81±0.20）%、（30.81±6.36）%、（38.56±0.84）%、（62.678±0.84）%，IC50值為 31.90 μmol/L；5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇對乳腺癌MDA-MB-435細胞和BT474細胞具有較高的抑制細胞增殖活性，在濃度3.125～50 μmol/L時，呈較好劑量依賴關[CM（25]系，抑制率分別

3討論

戴氏蟲草是1991年由我國學者梁宗琦教授等在貴州省首次發(fā)現(xiàn)、鑒定并命名的蟲草真菌。據文獻報道，Liu等對戴氏蟲草菌絲體的氯仿萃取部位進行了體外抑瘤活性檢測，該萃取部位對人肺癌A549細胞和胃癌SGC-7901細胞有較顯著的抑制活性[14]。也有相關文獻報道，與戴氏蟲草有種屬親緣關系的蛹蟲草的菌絲體乙醇提取物可阻滯人類大腸癌RKO細胞的G2/M細胞周期，誘導細胞凋亡[15]。多數(shù)蟲草的抗腫瘤部位集中在氯仿、醇提取物中，而本研究通過MTT法對戴氏蟲草菌絲體的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位進行初步抑制腫瘤細胞增殖活性研究，篩選出石油醚、乙酸乙酯萃取部位具有抑制腫瘤細胞增殖活性；并通過反復硅膠柱層析對抑制腫瘤細胞增殖活性部位進行提取、分離和凝膠純化，共分離得到6個單體化合物。分別為反式-16-十八碳烯酸（化合物1）、壬二酸（化合物2）、5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇（化合物3）、亞油酸甲酯（化合物4）、亞油酸（化合物5）和十七-烷醇（化合物6）。李小剛等在戴氏蟲草[16]、王剛等在蛹蟲草[17]中也檢測到化合物3的存在；在東北天南星[18]和三葉青[19]中也檢測到化合物2的存在；在商陸[20]和甘蔗葉[21]中也檢測到化合物4的存在；在北蟲草中[22]也檢測到化合物5的存在；在粉條兒菜[12]和天山雪蓮[13]中也檢測到化合物6的存在，查閱中外文獻，未發(fā)現(xiàn)化合物1、2、4、5、6在戴氏蟲草菌絲體中分離得到。因此，除5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇外，其余5種單體化合物是首次在戴氏蟲草菌絲體中發(fā)現(xiàn)和鑒定。

從海洋鏈格孢屬真菌[WTBX][STBX]Alternaria[WTBZ][STBZ] sp.MNP801菌體中曾分離到化合物3，并表明該化合物對肺癌H460細胞、大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞、淋巴癌U973細胞具有強的抑制活性，其IC50值分別為119.77、20.33、34.11 μmol/L[23]；在鮑姆氏層孔菌Phellinus baumii子實體中也分離到該化合物，對慢性骨髓性白血病K562細胞具有抑制活性，其IC50值為 164.9 μmol/L[24]。本研究通過MTT方法測定5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇對乳腺癌MDA-MB-435細胞、乳腺癌BT474細胞、舌癌Tca-8113細胞的增殖抑制活性，結果表明該化合物對3株癌細胞具有一定的增殖抑制活性，其中，該化合物對MDA-MB-435細胞和BT474細胞抑制作用較為明顯，IC50分別為（25.57±0.20）、（26.31±0.71）μmol/L。

另有相關報道顯示，化合物2在一定濃度范圍內對小鼠和人黑色素瘤細胞的增殖和細胞活力的抑制作用呈劑量和時間依賴性，其機制是抑制腫瘤的DNA合成和纖維蛋白溶酶原激活物活性，引起線粒體腫脹和空泡[25]。從壬二酸（AA）結構修飾得到二乙基壬二酸酯（DA）和壬二酸-β-環(huán)糊精復合物（AACD），以長春新堿作為陽性對照，采用MTT法比較AA、DA、AACD對宮頸癌細胞（HeLa），口腔表皮樣癌KB細胞和鼠黑色素瘤B16F10細胞的抗增殖活性，結果表明AA抗癌效率低于長春新堿，并且DA和AACD比AA抑制癌細胞更有效[26]。本研究通過MTT方法測定壬二酸對乳腺癌 MDA-MB-435細胞、乳腺癌BT474細胞、舌癌Tca-8113細胞的增殖抑制活性，結果表明壬二酸對3株癌細胞具有一定的增殖抑制活性，其中，該化合物對Tca-8113細胞抑制作用較為明顯，其IC50為（31.90±1.15）μmol/L。

在抑制腫瘤細胞增殖活性試驗中，戴氏蟲草菌絲體來源的單體化合物2和化合物3對乳腺癌MDA-MB-435細胞、乳腺癌BT474細胞、舌癌Tca-8113細胞有一定的抑制細胞增殖活性，說明化合物2和化合物3有可能是戴氏蟲草菌絲體抗腫瘤的重要物質基礎，可能具有潛在的抗癌藥物開發(fā)價值，其抑瘤機制和其余幾種單體化合物的作用還有待進一步研究。

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