周軍+朱暖飛+邵啟運(yùn)+黃夢(mèng)璐+張禎+吳向陽
摘要:采用制備的鄰苯二甲酸二丁酯多克隆抗體建立可檢測(cè)環(huán)境水體中痕量鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫(ELISA)分析方法,對(duì)各種參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后,在最優(yōu)條件下本方法具有較高的靈敏度(檢測(cè)限為 66.6 ng/mL)、較寬的檢測(cè)范圍(70~1 600 ng/mL)、較好的準(zhǔn)確度(回收率82.8%~104.0%)。利用此高通量分析方法對(duì)鎮(zhèn)江部分河流中水樣、底泥進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)江市區(qū)幾處河流,DBP普遍檢出,水樣中DBP濃度為76.5~140.4 ng/mL,底泥中DBP濃度可達(dá)114.6~248.7 ng/g。
關(guān)鍵詞:鄰苯二甲酸二丁酯;酶聯(lián)免疫;抗體;水體;鎮(zhèn)江
中圖分類號(hào):X824文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1002-1302(2017)05-0289-03
鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)(phthalateesters,PAEs)是一類大量應(yīng)用于塑料及一次性塑料消費(fèi)品(食品包裝材料、容器、醫(yī)療用品)的增塑劑,還可以作為原料用于香味劑、化妝品和冷凝劑,這類化合物的使用,造成了全球性的污染[1]。其中,鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)在被檢出的PAEs樣品中分布最為廣泛[2],F(xiàn)atoki等對(duì)南非East London港中DBP濃度進(jìn)行了分析,其含量可達(dá)2.8~121.9 ng/mL[3];Adeniyi等報(bào)道稱尼日利亞的河水中DBP的含量為202.5~270.5 ng/mL[4];陸繼龍等對(duì)第二松花江中下游中DBP濃度進(jìn)行了測(cè)定,其平均濃度高達(dá)717.24 ng/mL[5]。同時(shí),研究表明,DBP具有明顯的生殖毒性:可以引起染色體丟失或斷裂等畸變,阻礙正常精子的生成[6];可導(dǎo)致雄性兔與大鼠生殖道畸形,睪丸萎縮,從而造成其生殖系統(tǒng)損傷[7]。因此,建立簡(jiǎn)單、快速高通量的分析方法,對(duì)水體中此類污染物進(jìn)行分析極其必要。DBP分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。
目前報(bào)道的有關(guān)分析DBP的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、液相色譜法[9]、LC-MS/MS[10-11]等儀器方法,然而,由于這類方法存在測(cè)試成本高、分析時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)所需樣品量大(通常大于500 mL)及前處理步驟繁瑣等不足,無法在較大范圍內(nèi)系統(tǒng)、全面、快速分析環(huán)境水體中DBP的含量。與此相比,酶聯(lián)免疫法(ELISA)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、適合高通量分析的優(yōu)勢(shì)。因此,本研究利用自主制備的DBP多克隆抗體,建立了高靈敏的ELISA方法,優(yōu)化了影響方法靈敏度與準(zhǔn)確度的各種因素,并以此方法對(duì)鎮(zhèn)江地區(qū)部分小型淺水河流中DBP的污染狀況進(jìn)行了調(diào)查。
1材料和方法
1.1材料和試劑
DBP抗原抗體,由江蘇大學(xué)環(huán)境科學(xué)團(tuán)隊(duì)制備;鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸乙酯、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、四甲基聯(lián)胺,均購自美國(guó)Sigma公司;Tween-20、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、碳酸鈉(Na2CO3)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、濃硫酸(H2SO4)等,均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,且均為分析純;酶標(biāo)板,購自丹麥NUNC公司。
碳酸鹽包被緩沖液CB:0.05 mol/L、pH值為9.6;封閉液:含1%明膠的CB液;洗滌液PBST:0.01 mol/L、pH值為7.4、含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-20的PBS液;抗體稀釋液:0.01 mol/L、pH值為7.4、0.01% Tween-20、0.1%明膠的PBS液;顯色液:10 mg鄰苯二胺、25 mL檸檬酸鈉緩沖液、5 μL 30%過氧化氫,用時(shí)混合;終止液:2 mol/L H2SO4。
1.2儀器設(shè)備
電子分析天平,購自重慶CoiC公司;恒溫培養(yǎng)箱,上海精密科學(xué)儀器有限公司;酶標(biāo)儀,購自美國(guó)Thermo公司。
1.3間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA)的建立
采用方陣滴定法,確定抗原最佳包被濃度、抗體最佳包被濃度,為達(dá)到最佳檢測(cè)條件,對(duì)孵育條件、封閉時(shí)間、一抗競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間、二抗稀釋倍數(shù)、pH值、離子強(qiáng)度等影響因素進(jìn)行優(yōu)化。
具體ic-ELISA操作步驟為:(1)包被:用包被液將稀釋的包被原加至酶標(biāo)板,100 μL/孔,4 ℃過夜孵育;(2)洗滌:傾去孔內(nèi)液體,用洗滌液洗3遍,200 μL/孔,在吸水紙上拍干;(3)封閉:加入150 μL/孔封閉液,37 ℃孵育1 h;(4)洗滌:傾去孔內(nèi)液體,用200 μL洗滌液洗1遍,在吸水紙上拍干;(5)加樣:每孔加入50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和適當(dāng)稀釋的待檢血清,37 ℃孵育30 min;(6)洗滌:傾去孔內(nèi)液體,用洗液洗3遍,200 μL/孔,在吸水紙上拍干;(7)加酶辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗:加入 100 μL/孔 HRP-羊抗兔IgG,37 ℃孵育 30 min;(8)洗滌:傾去孔內(nèi)液體,用洗液洗5遍,200 μL/孔,在吸水紙上拍干;(9)顯色:加入新鮮配制的TMB底物溶液,100 μL/孔,避光顯色10 min;(10)終止:加入終止液,50 μL/孔;(11)測(cè)定:用酶標(biāo)儀讀取各孔D450 nm值。
1.4建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及數(shù)據(jù)分析
根據(jù)以上優(yōu)化的結(jié)果,按照“1.3”節(jié)中的方法建立DBP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以零標(biāo)準(zhǔn)品D450 nm值為B0值,相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品抑制時(shí)的D450 nm值為B值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以B/B0為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定10份空白樣,取測(cè)定平均值減3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差,標(biāo)準(zhǔn)曲線上其對(duì)應(yīng)的濃度值即為檢測(cè)限(limit of detection,LOD)。
1.5交叉反應(yīng)率的測(cè)定
選擇與鄰苯二甲酸二丁酯具有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(benzyl butyl phthalate,BBP)、鄰苯二甲酸單乙酯(monoethyl phthalate,MEP)、鄰苯二甲酸單丁酯(monobutyl phthalate,MBP)、鄰苯二甲酸單乙基己基酯(monoethylhexyl phthalate,MEHP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(di-n-octyl phthalate,DnOP)、鄰苯二甲酸二異辛酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DiOP],測(cè)定得到各藥物的IC50值(抑制中點(diǎn)即抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度),按公式(1)計(jì)算交叉反應(yīng)率。
[JZ(]交叉反應(yīng)率=DBP的 IC50值/相似結(jié)構(gòu)物的IC50值×100%。
1.6樣品前處理及添加回收率的測(cè)定
各取2 mL(或2 mg泥土,自然陰干)的樣品,加入4 mL正己烷,振蕩搖勻后使用高速離心機(jī)6 000 r/min離心 10 min,取上清,并用氮吹儀吹干。最終樣品用2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)復(fù)溶。
取空白樣本,添加一定體積的DBP標(biāo)準(zhǔn)液,每個(gè)水平設(shè)3個(gè)平行。將混合物在漩渦混合器上渦動(dòng)1 min,然后靜置 15 min。按建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定,檢測(cè)時(shí)每份樣品做3個(gè)平行重復(fù)孔。將各樣品測(cè)得的D450 nm值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出樣品中的藥物濃度,并根據(jù)公式(2)計(jì)算回收率。
[JZ(]回收率=實(shí)測(cè)值/添加值×100%。
2結(jié)果與分析
2.1間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立與優(yōu)化
為達(dá)到最佳的檢測(cè)效果,本研究對(duì)影響方法的各種參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,包括抗原稀釋度、抗體稀釋度、孵育條件、封閉時(shí)間、一抗競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間、HRP稀釋度、pH值、離子強(qiáng)度。在最優(yōu)條件下(部分?jǐn)?shù)據(jù)如表1所示),分別為:抗原稀釋度1 ∶[KG-*3]5 000、抗體稀釋度1 ∶[KG-*3]30 000、孵育條件4 ℃過夜、封閉時(shí)間1.5 h、一抗競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間30 min、HRP稀釋度1 ∶[KG-*3]2 000、pH值7.0、離子強(qiáng)度0.15 mol/L,以DBP濃度的LOG值為橫坐標(biāo),抑制百分比(B/B0)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2),其抑制程度與DBP的濃度具有明顯的線性關(guān)系(70~1 600 ng/mL),IC50值為421 ng/mL,檢測(cè)限可達(dá)66.6 ng/mL。
2.2交叉反應(yīng)率測(cè)定
在最佳反應(yīng)條件下,測(cè)定7種DBP的類似結(jié)構(gòu)物,其中對(duì)BBP的交叉反應(yīng)率為22.5%,對(duì)DEP的交叉反應(yīng)率為 1.08%,其余5種均小于0.01%,從而可推斷該檢測(cè)體系所用的DBP抗體具有較強(qiáng)的特異性。根據(jù)免疫學(xué)的基本原理[12]:抗體傾向于識(shí)別距離偶聯(lián)段最遠(yuǎn)的基團(tuán)(主導(dǎo)的抗原決定簇)。對(duì)于所測(cè)定的7種PAEs,只有BBP在距離偶聯(lián)段最遠(yuǎn)處,和DBP有相似的正丁基官能團(tuán),而其他PAEs均無。
2.3樣本添加回收試驗(yàn)
[JP2]DBP在樣品中的添加回收率、變異系數(shù)如表2所示。結(jié)果表明,其添加回收率均值在82.8%~104.0%之間,變異系數(shù)均小于20%,顯示該方法的準(zhǔn)確度和精確度均符合檢測(cè)要求。
2.4鎮(zhèn)江市內(nèi)小型淺水河流水體和底泥的檢測(cè)
表3為鎮(zhèn)江市部分小型淺水河流中DBP在水體、底泥中的含量。由表3可知,DBP作為一種常見增塑劑在環(huán)境水體中普遍存在。4條河流中,除玉帶河未檢測(cè)到(玉帶河離市區(qū)較遠(yuǎn),且河道定期清淤,故水質(zhì)較好),其余3條河流水體中DBP的含量介于76.5~140.4 ng/mL之間,顯著高于臺(tái)灣河(1.0~13.5 ng/mL)[13]、意大利淡水(ND~0.028 ng/mL)[14]和加拿大False Creek港(9.32~63.9 ng/mL)[15]中DBP的含量,而且超過《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)中DBP的標(biāo)準(zhǔn)限值(3 ng/mL)[16]。顯然,DBP在3條市區(qū)河流中污染嚴(yán)重,這可能與河流周邊附近工業(yè)廢水的排放、固體廢棄物的堆放和雨水淋洗以及PVC塑料的緩慢釋放有關(guān);另外下游的DBP含量明顯高于中游,可推斷出隨河流沿程增加,帶入水體中的污染物呈增加趨勢(shì),導(dǎo)致DBP含量也隨之升高。
3結(jié)論
本研究建立了環(huán)境水體中DBP間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法。通過條件優(yōu)化,本方法的IC50值可達(dá)421 ng/mL,線性范圍為70~1 600 ng/mL,檢測(cè)限為66.6 ng/mL。同時(shí),本方法具有較高的準(zhǔn)確度與精確度(回收率為82.8%~104.0%,變異系數(shù)為3.25%~10.20%)。利用此方法對(duì)鎮(zhèn)江市部分小型淺水河流進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果表明市區(qū)內(nèi)水體中DBP污染較為嚴(yán)重。本研究為DBP在鎮(zhèn)江區(qū)域的污染狀況調(diào)查、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了一定的技術(shù)支持。
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