番茄沉默轉基因植株的獲得及功能初探

劉斯超+許濤+董秀芬+付欣+鄭鵬靖+李兵

摘要：Aux/IAA（auxin/indole-3-acetic acid）作為生長素早期響應因子，其蛋白產物能夠特異性地結合生長素響應因子（auxin response factor，ARF），從而調控生長素響應基因的表達，在整個植物生長素信號轉導過程中發(fā)揮著重要的作用，進而影響植物的生長發(fā)育。本研究通過構建沉默載體，在高效遺傳轉化體系下獲得轉基因植株，發(fā)現(xiàn)利用Gateway克隆技術將番茄生長素早期響應基因 Domain Ⅱ區(qū)部分序列連入具有正反2個attr區(qū)域并連接1個內含子的pB7GWIWG2（Ⅰ）載體，可在植株體內形成發(fā)卡結構導致植物基因沉默，成功構建基因沉默表達載體名為SlIAA RNAi；此外，抗生素噴施和PCR擴增以及實時定量檢測進一步鑒定，共獲得12棵 RNAi陽性植株。本研究結果將為進一步明確SlIAA的生物學功能和闡明生長素的作用機理提供參考。

關鍵詞：番茄；生長素；；載體構建；基因表達

中圖分類號： Q785；Q786文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0029-04

生長素（IAA）在植物的生長和發(fā)育中起著重要的作用，它不僅可以作用于細胞膜引起細胞的快速反應，而且還能夠在分子水平上特異性地調控基因表達[1-2]。Aux/IAA作為生長素信號反應中的關鍵調控因子，已經在擬南芥、番茄等模式植物中進行了廣泛的研究[3]。Aux/IAA基因屬于多基因家族，目前在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)有29個Aux/IAA家族基因，水稻和玉米中均有31個成員，黃瓜中有28個，棉花上有10個，馬鈴薯中有27個，蘋果中有40個，草莓、高粱和番茄中有26個Aux/IAA家族成員[4-10]。

通過對擬南芥功能獲得性突變體的研究，發(fā)現(xiàn)多數(shù)都是由Aux/IAA蛋白Domain Ⅱ核心區(qū)（VGWPP）的某個氨基酸的改變引起的，如Aux/IAA基因的突變會引起生長素反應因子（ARF）功能的紊亂，使植株出現(xiàn)生長素相關的異常表型，對生長素敏感性出現(xiàn)升高或降低

目前有關番茄基因在生長發(fā)育中的作用尚無詳盡報道。本研究通過轉基因手段獲得 RNAi植株，在對呈現(xiàn)的表型進行分析的基礎上，探討調控植物生長發(fā)育的作用機制，這有利于深化對Aux/IAA功能的認識，進一步了解生長素及其信號轉導的分子機制，指導我們在生產實踐中利用生長素及轉基因技術調節(jié)植株生長與發(fā)育、果實成熟及產量提升等[9]。

1材料與方法

1.1材料

試驗在沈陽農業(yè)大學蔬菜實驗基地進行，供試番茄品種為中蔬6號，由中國農業(yè)科學院提供。供試植物總DNA及RNA 提取試劑盒、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒等購自北京天根生化科技有限公司；Prime STAR、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶、DNA marker及反轉錄藥品等購自寶生物工程淵有限公司，其他常規(guī)藥品為國產分析純。pENTRTM/D-TO[JP2]PO Cloning Kit 和Gateway LR Clonase Enzyme Mix為 Invitrogen 公司產品。以除草劑bar基因為篩選標記的植物表達載體Pb7GWIWG2（I） （ http：//gateway.psb.ugent.be/vector/show/pB7GWIWG2%281%29/search/index/silencing/any）、[JP]大腸桿菌菌株DH5α、根癌農桿菌LBA4404為筆者所在實驗室留存。

1.2方法

1.2.1SlIAA沉默載體的構建

根據(jù)已經獲得的cDNA全長，按照RNAi原理，設計引物F：5′-CACCGGGAATGAACTGGAATCG-3′，R：5′-CCGCTTTAGAGGCCGTGG-3′。PCR擴增干擾片段并膠回收純化；TOPO Cloning及熱激法轉化大腸桿菌；堿裂解法小量提取質粒DNA。

1.2.2番茄植株 RNAi的遺傳轉化

將構建好的質粒用電擊法導入農桿菌LBA4404，用農桿菌介導遺傳轉化方法轉化番茄，待轉化植株根系達到5 cm 時，將其移栽盆缽。

1.2.3陽性植株的篩選

通過Blast搜索bar基因序列，設計引物。序列為F：5′-GATAATCATCGCAAGACC-3′；R：5′-TCGACCGTGTACGTCTC-3′。以未轉化的中蔬6號植株的基因組DNA作為陰性對照，遺傳轉化 RNAi載體質粒作為陽性對照，擴增目的片段。PCR擴增程序參照bar基因引物及酶的擴增條件等來設定。

2結果與分析

2.1 RNAi表達載體PCR及酶切檢測

將測序成功的克隆重新提取質粒，采用質粒PCR的方法檢測終載體，挑去若干個單克隆，同時以空載體質粒作為對照，用特異性引物進行PCR。結果表明pB7G-IAA16表達載體已成功構建，初步驗證整合進入目的載體。

對RNAi載體進行限制性內切酶酶切驗證SlIAA片段整合的正確性，特別是RNAi載體中的發(fā)夾結構。選用了EcoRⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ這3種酶對構建的RNAi載體進行酶切驗證，結果發(fā)現(xiàn)，用這3種酶切LR反應前的載體pB7GWIWG2分別能切出3 237、3 180、2 167 bp的片段；LR反應之后的載體用Hind Ⅲ酶切可以切出196 bp的片段以及另外2個大小的片段，這3個片段總長為2 148 bp，因為本連入片段分別在第293、488 bp有該酶的酶切位點，XbaⅠ可以切出584 bp長度的片段，而EcoRⅠ酶切位點位于ccdB基因上，因此LR反應后不能切出片段。

2.2電擊轉化農桿菌檢測

將大腸桿菌中提取的 RNAi表達載體質粒電激轉化農桿菌LBA4404，利用含有壯觀霉素及利福平的YEP固體培養(yǎng)基平板篩選，并挑選單菌落PCR（酶切方法）檢測挑選陽性克隆，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.3 RNAi植株的遺傳轉化

本試驗所用的植物雙元載體pB7GWIWG2（[KG-*5]Ⅰ[KG-*5]）含有bar 基因（圖4），所以在整個過程中始終保持0.5 mg/L 草銨膦的抗性篩選，并建立了轉基因植株的再生體系，成功地獲得了再生植株。

2.4陽性植株的篩選

2.4.1草銨膦（PPT）噴施篩選轉基因植株

對無草銨膦抗性的番茄幼苗，進行草銨膦抗性噴施。噴施10 d后發(fā)現(xiàn)，當草銨膦濃度為 15 mg/L 時，幼苗生長良好，下部葉片僅出現(xiàn)少量褐斑點；濃度為3 mg/L時，下部葉片出現(xiàn)黃化，仍能正常生長；濃度為 6 mg/L 時，植株葉片黃化，生長勢降低（圖6-a）。說明篩選轉基因苗最佳濃度為6 mg/L。

[JP2]對轉基因幼苗進行6 mg/L的草銨膦噴施，4 d后觀察發(fā)現(xiàn)，不具有草銨膦抗性的轉基因植株真葉的葉邊緣開始黃化，葉片腐軟，隨著時間延長，黃化現(xiàn)象開始向整株葉片擴散，生長點灼傷，甚至出現(xiàn)植株死亡；而有草銨膦抗性的植株則無明顯變化（圖6-b、圖6-c）。通過噴施篩選得到33棵抗性植株。[JP]

2.4.2PCR篩選轉基因植株

選取已經通過PPT篩選的轉基因植株12株，PCR法檢測發(fā)現(xiàn)條帶一致且純度較高的可以認為DNA無降解，可用于下一步PCR檢測。在轉基因沉默植株中可以檢測到750 bp的PCR產物條帶，轉化植株的條帶與質粒擴增的條帶大小一致，大約都為750 bp。

利用RNA提取試劑盒提取總RNA，發(fā)現(xiàn)18S、28S條帶清晰，可用于cDNA的合成（圖8-a）。對目的基因的表達量進行實時定量分析，發(fā)現(xiàn) 沉默植株22-01、22-05、22-17、22-03、22-14、22-10、22-07的表達量均顯著低于正常植株，分別降低75%、70%、60%、60%、55%、50%、50%（圖8-b）。這進一步驗證了前面篩選獲得的轉基因植株是陽性植株，依據(jù)數(shù)據(jù)結果，主要選擇22-01轉基因株系作為主要研究對象。

2.6組織特異性表達分析

在qRT-PCR分析中，全部以功能葉為對照。在番茄的莖和花中表達較高，分別是對照的3倍和2.5倍，在果實中的表達相對較少（圖9-a）。在葉片不同部位的表達。結果顯示，在葉基和幼苗中的表達水平顯著高于對照，分別是對照的7倍和11倍（圖9-b）。在幼葉含量較高，在花蕾中表達水平很高，推測其主要存在于幼嫩部位，對早期發(fā)育有重要的調控作用（圖9-c）。在果實不同發(fā)育時期，其中在綠熟期階段，表達水平較高，隨著果實的不斷成熟，其表達水平逐漸降低，推測其

3討論與結論

將番茄基因Domain Ⅱ區(qū)部分序列連入pB7GWIWG（Ⅱ）載體，載體特點為具有2個連續(xù)倒置的序列片段并且中間含有內含子，以形成發(fā)卡結構導致基因沉默，成功構建沉RNAi表達載體名為SlIAA RNAi表達載體。在構建載體過程中本研究采用的方法是在傳統(tǒng)的基礎上略加改進的載體構建方式，即利用最新的入門克隆載體，該載體上已經連入attL序列，這樣就跳過了BP反應，直接將純化回收后的PCR產物通過TOPO克隆反應連入入門克隆載體就可以進行LR反應了，與傳統(tǒng)BP加LR反應相比更加方便快捷。在選擇入門克隆的時候要注意入門克隆載體與目的載體的抗性，二者的抗性要求是不同的，這樣在后續(xù)篩選陽性克隆時也更加方便，本試驗構建的RNAi載體的入門克隆在片段連入時對連入的方向也進行了選擇，所以在設計引物時在前引物的5′端增加了CACC 這4個堿基。利用Gateway技術構建的載體是1種二元載體，因此能直接用于農桿菌介導的植物轉化，從而為利用RNA干涉技術大規(guī)模、高通量的研究植物特異和未知基因功能打開方便之門。

轉基因植株的檢測作為植物基因工程中的重要一環(huán)，越來越成為人們研究的重點。在本試驗中，對沉默植株的檢測，主要通過外源噴施、PCR檢測、RT-PCR檢測等方法相互結合，來進一步減少轉基因植株的假陽性。雖然，組培篩選及葉片噴施篩選也存在一定的局限性，如葉片噴施草甘膦容易造成植株的大量減產，組培篩選也會因為在時間的把握上存在差別而對草甘膦的反應可能不敏感[15，18]。因此，這就需要在試驗中盡量把握好種子萌發(fā)過程中草甘膦的濃度及處理時間，重點觀察幼嫩葉片對外源噴施篩選的反應情況。

參考文獻：

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劉斯超 許濤 董秀芬 付欣 鄭鵬靖 李兵

摘要：Aux/IAA（auxin/indole-3-acetic acid）作為生長素早期響應因子，其蛋白產物能夠特異性地結合生長素響應因子（auxin response factor，ARF），從而調控生長素響應基因的表達，在整個植物生長素信號轉導過程中發(fā)揮著重要的作用，進而影響植物的生長發(fā)育。本研究通過構建沉默載體，在高效遺傳轉化體系下獲得轉基因植株，發(fā)現(xiàn)利用Gateway克隆技術將番茄生長素早期響應基因 Domain Ⅱ區(qū)部分序列連入具有正反2個attr區(qū)域并連接1個內含子的pB7GWIWG2（Ⅰ）載體，可在植株體內形成發(fā)卡結構導致植物基因沉默，成功構建基因沉默表達載體名為SlIAA RNAi；此外，抗生素噴施和PCR擴增以及實時定量檢測進一步鑒定，共獲得12棵 RNAi陽性植株。本研究結果將為進一步明確SlIAA的生物學功能和闡明生長素的作用機理提供參考。

關鍵詞：番茄；生長素；；載體構建；基因表達

中圖分類號： Q785；Q786文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0029-04

生長素（IAA）在植物的生長和發(fā)育中起著重要的作用，它不僅可以作用于細胞膜引起細胞的快速反應，而且還能夠在分子水平上特異性地調控基因表達[1-2]。Aux/IAA作為生長素信號反應中的關鍵調控因子，已經在擬南芥、番茄等模式植物中進行了廣泛的研究[3]。Aux/IAA基因屬于多基因家族，目前在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)有29個Aux/IAA家族基因，水稻和玉米中均有31個成員，黃瓜中有28個，棉花上有10個，馬鈴薯中有27個，蘋果中有40個，草莓、高粱和番茄中有26個Aux/IAA家族成員[4-10]。

通過對擬南芥功能獲得性突變體的研究，發(fā)現(xiàn)多數(shù)都是由Aux/IAA蛋白Domain Ⅱ核心區(qū)（VGWPP）的某個氨基酸的改變引起的，如Aux/IAA基因的突變會引起生長素反應因子（ARF）功能的紊亂，使植株出現(xiàn)生長素相關的異常表型，對生長素敏感性出現(xiàn)升高或降低

目前有關番茄基因在生長發(fā)育中的作用尚無詳盡報道。本研究通過轉基因手段獲得 RNAi植株，在對呈現(xiàn)的表型進行分析的基礎上，探討調控植物生長發(fā)育的作用機制，這有利于深化對Aux/IAA功能的認識，進一步了解生長素及其信號轉導的分子機制，指導我們在生產實踐中利用生長素及轉基因技術調節(jié)植株生長與發(fā)育、果實成熟及產量提升等[9]。

1材料與方法

1.1材料

試驗在沈陽農業(yè)大學蔬菜實驗基地進行，供試番茄品種為中蔬6號，由中國農業(yè)科學院提供。供試植物總DNA及RNA 提取試劑盒、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒等購自北京天根生化科技有限公司；Prime STAR、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶、DNA marker及反轉錄藥品等購自寶生物工程淵有限公司，其他常規(guī)藥品為國產分析純。pENTRTM/D-TO[JP2]PO Cloning Kit 和Gateway LR Clonase Enzyme Mix為 Invitrogen 公司產品。以除草劑bar基因為篩選標記的植物表達載體Pb7GWIWG2（I） （ http：//gateway.psb.ugent.be/vector/show/pB7GWIWG2%281%29/search/index/silencing/any）、[JP]大腸桿菌菌株DH5α、根癌農桿菌LBA4404為筆者所在實驗室留存。

1.2方法

1.2.1SlIAA沉默載體的構建

根據(jù)已經獲得的cDNA全長，按照RNAi原理，設計引物F：5′-CACCGGGAATGAACTGGAATCG-3′，R：5′-CCGCTTTAGAGGCCGTGG-3′。PCR擴增干擾片段并膠回收純化；TOPO Cloning及熱激法轉化大腸桿菌；堿裂解法小量提取質粒DNA。

1.2.2番茄植株 RNAi的遺傳轉化

將構建好的質粒用電擊法導入農桿菌LBA4404，用農桿菌介導遺傳轉化方法轉化番茄，待轉化植株根系達到5 cm 時，將其移栽盆缽。

1.2.3陽性植株的篩選

通過Blast搜索bar基因序列，設計引物。序列為F：5′-GATAATCATCGCAAGACC-3′；R：5′-TCGACCGTGTACGTCTC-3′。以未轉化的中蔬6號植株的基因組DNA作為陰性對照，遺傳轉化 RNAi載體質粒作為陽性對照，擴增目的片段。PCR擴增程序參照bar基因引物及酶的擴增條件等來設定。

2結果與分析

2.1 RNAi表達載體PCR及酶切檢測

將測序成功的克隆重新提取質粒，采用質粒PCR的方法檢測終載體，挑去若干個單克隆，同時以空載體質粒作為對照，用特異性引物進行PCR。結果表明pB7G-IAA16表達載體已成功構建，初步驗證整合進入目的載體。

對RNAi載體進行限制性內切酶酶切驗證SlIAA片段整合的正確性，特別是RNAi載體中的發(fā)夾結構。選用了EcoRⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ這3種酶對構建的RNAi載體進行酶切驗證，結果發(fā)現(xiàn)，用這3種酶切LR反應前的載體pB7GWIWG2分別能切出3 237、3 180、2 167 bp的片段；LR反應之后的載體用Hind Ⅲ酶切可以切出196 bp的片段以及另外2個大小的片段，這3個片段總長為2 148 bp，因為本連入片段分別在第293、488 bp有該酶的酶切位點，XbaⅠ可以切出584 bp長度的片段，而EcoRⅠ酶切位點位于ccdB基因上，因此LR反應后不能切出片段。

2.2電擊轉化農桿菌檢測

將大腸桿菌中提取的 RNAi表達載體質粒電激轉化農桿菌LBA4404，利用含有壯觀霉素及利福平的YEP固體培養(yǎng)基平板篩選，并挑選單菌落PCR（酶切方法）檢測挑選陽性克隆，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.3 RNAi植株的遺傳轉化

本試驗所用的植物雙元載體pB7GWIWG2（[KG-*5]Ⅰ[KG-*5]）含有bar 基因（圖4），所以在整個過程中始終保持0.5 mg/L 草銨膦的抗性篩選，并建立了轉基因植株的再生體系，成功地獲得了再生植株。

2.4陽性植株的篩選

2.4.1草銨膦（PPT）噴施篩選轉基因植株

對無草銨膦抗性的番茄幼苗，進行草銨膦抗性噴施。噴施10 d后發(fā)現(xiàn)，當草銨膦濃度為 15 mg/L 時，幼苗生長良好，下部葉片僅出現(xiàn)少量褐斑點；濃度為3 mg/L時，下部葉片出現(xiàn)黃化，仍能正常生長；濃度為 6 mg/L 時，植株葉片黃化，生長勢降低（圖6-a）。說明篩選轉基因苗最佳濃度為6 mg/L。

[JP2]對轉基因幼苗進行6 mg/L的草銨膦噴施，4 d后觀察發(fā)現(xiàn)，不具有草銨膦抗性的轉基因植株真葉的葉邊緣開始黃化，葉片腐軟，隨著時間延長，黃化現(xiàn)象開始向整株葉片擴散，生長點灼傷，甚至出現(xiàn)植株死亡；而有草銨膦抗性的植株則無明顯變化（圖6-b、圖6-c）。通過噴施篩選得到33棵抗性植株。[JP]

2.4.2PCR篩選轉基因植株

選取已經通過PPT篩選的轉基因植株12株，PCR法檢測發(fā)現(xiàn)條帶一致且純度較高的可以認為DNA無降解，可用于下一步PCR檢測。在轉基因沉默植株中可以檢測到750 bp的PCR產物條帶，轉化植株的條帶與質粒擴增的條帶大小一致，大約都為750 bp。

利用RNA提取試劑盒提取總RNA，發(fā)現(xiàn)18S、28S條帶清晰，可用于cDNA的合成（圖8-a）。對目的基因的表達量進行實時定量分析，發(fā)現(xiàn) 沉默植株22-01、22-05、22-17、22-03、22-14、22-10、22-07的表達量均顯著低于正常植株，分別降低75%、70%、60%、60%、55%、50%、50%（圖8-b）。這進一步驗證了前面篩選獲得的轉基因植株是陽性植株，依據(jù)數(shù)據(jù)結果，主要選擇22-01轉基因株系作為主要研究對象。

2.6組織特異性表達分析

在qRT-PCR分析中，全部以功能葉為對照。在番茄的莖和花中表達較高，分別是對照的3倍和2.5倍，在果實中的表達相對較少（圖9-a）。在葉片不同部位的表達。結果顯示，在葉基和幼苗中的表達水平顯著高于對照，分別是對照的7倍和11倍（圖9-b）。在幼葉含量較高，在花蕾中表達水平很高，推測其主要存在于幼嫩部位，對早期發(fā)育有重要的調控作用（圖9-c）。在果實不同發(fā)育時期，其中在綠熟期階段，表達水平較高，隨著果實的不斷成熟，其表達水平逐漸降低，推測其

3討論與結論

將番茄基因Domain Ⅱ區(qū)部分序列連入pB7GWIWG（Ⅱ）載體，載體特點為具有2個連續(xù)倒置的序列片段并且中間含有內含子，以形成發(fā)卡結構導致基因沉默，成功構建沉RNAi表達載體名為SlIAA RNAi表達載體。在構建載體過程中本研究采用的方法是在傳統(tǒng)的基礎上略加改進的載體構建方式，即利用最新的入門克隆載體，該載體上已經連入attL序列，這樣就跳過了BP反應，直接將純化回收后的PCR產物通過TOPO克隆反應連入入門克隆載體就可以進行LR反應了，與傳統(tǒng)BP加LR反應相比更加方便快捷。在選擇入門克隆的時候要注意入門克隆載體與目的載體的抗性，二者的抗性要求是不同的，這樣在后續(xù)篩選陽性克隆時也更加方便，本試驗構建的RNAi載體的入門克隆在片段連入時對連入的方向也進行了選擇，所以在設計引物時在前引物的5′端增加了CACC 這4個堿基。利用Gateway技術構建的載體是1種二元載體，因此能直接用于農桿菌介導的植物轉化，從而為利用RNA干涉技術大規(guī)模、高通量的研究植物特異和未知基因功能打開方便之門。

轉基因植株的檢測作為植物基因工程中的重要一環(huán)，越來越成為人們研究的重點。在本試驗中，對沉默植株的檢測，主要通過外源噴施、PCR檢測、RT-PCR檢測等方法相互結合，來進一步減少轉基因植株的假陽性。雖然，組培篩選及葉片噴施篩選也存在一定的局限性，如葉片噴施草甘膦容易造成植株的大量減產，組培篩選也會因為在時間的把握上存在差別而對草甘膦的反應可能不敏感[15，18]。因此，這就需要在試驗中盡量把握好種子萌發(fā)過程中草甘膦的濃度及處理時間，重點觀察幼嫩葉片對外源噴施篩選的反應情況。

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