張蔡喆，楊套偉，周俊平，鄭俊賢，徐美娟，張顯，饒志明

江南大學 生物工程學院, 江蘇 無錫 214122

L-2-氨基丁酸 (L-ABA) 是一種非天然氨基酸，可以作為重要的前體物質(zhì)合成多種手性藥物，包括用于結核病治療的乙胺丁醇和布瓦西坦，以及抗癲癇藥物左乙拉西坦[1]。目前已開發(fā)出諸多L-ABA的生物合成途徑[2-4]，主要通過脫氫酶或者轉氨酶來催化制備，但不對稱還原反應需要等當量的輔酶參與，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (即還原型輔酶Ⅰ，NADH)是氧化還原反應中重要的輔酶[5]，作為電子供體，1分子NADH可以提供2個電子用于羰基等基團的還原，由于輔酶價格昂貴，限制了其在工業(yè)水平的應用，所以需要另一種底物和酶偶聯(lián)對輔酶進行再生循環(huán)，以解決輔酶限制[6-7]。常用的酶偶聯(lián)法NAD(P)H輔酶循環(huán)體系有兩種[8]。一種是甲酸/FDH再生NADH體系。甲酸脫氫酶 (Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH) 是一種廣泛存在于甲醇利用型的細菌及酵母中的酶，也是目前還原 NAD+的脫氫酶中國內(nèi)外研究最多的酶之一[9]。FDH可以使甲酸氧化生成 CO2，同時將氧化態(tài)的輔酶 NAD+還原為 NADH。另一種是葡萄糖/GDH再生 NAD(P)H體系，葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase，GDH) 是一種氧化還原酶，催化D-葡萄糖得到D-葡萄糖酸，同時將氧化態(tài)的輔酶NAD+或NADP+還原為NADH或NADPH。在某些情況下，NAD+作為輔酶時，GDH的酶促效率相比NADPH作為輔酶時要低[10]。多數(shù)研究采用基因工程技術對 GDH進行克隆和在大腸桿菌中過表達來解決野生菌中酶活水平不高的問題，實現(xiàn)氧化還原酶輔酶循環(huán)再生[11]。

例如Galkin等以2-酮丁酸為底物，通過偶聯(lián)亮氨酸脫氫酶 (LDH) 和輔酶 (NADH) 循環(huán)再用酶生甲酸脫氫酶 (FDH)，最終獲得36 g/L的L-ABA，產(chǎn)物得率為88%[12]；Tao等以L-蘇氨酸為底物，利用L-蘇氨酸脫氨酶、亮氨酸脫氫酶、甲酸脫氫酶一鍋法轉化L-蘇氨酸產(chǎn)L-2-氨基丁酸，在50 L規(guī)模上30 mol L-蘇氨酸轉化為 29.2 mol L-ABA，實現(xiàn)了97.3%的得率，產(chǎn)率達到了6.37 g/(L·h)，此方法在工業(yè)化生產(chǎn)L-ABA有較大潛力[13]。多數(shù)報道均以酶法轉化為基礎，需要細胞破碎等繁瑣步驟，并且需要外源添加一定數(shù)量的輔酶 (NAD+等)。本文構建了包括輔酶原位再生的偶聯(lián)酶反應的途徑，以L-蘇氨酸為底物，D-葡萄糖為輔底物，以LTD和LDH一起構建包括輔酶NADH循環(huán)再生的多酶催化體系，全細胞轉化聯(lián)產(chǎn) L-ABA和 D-葡萄糖酸 (圖 1)。其中的偶聯(lián)反應產(chǎn)物D-葡萄糖酸及其系列衍生物 (如葡萄糖酸鹽、葡萄糖酸 δ-內(nèi)酯) 是一類多用途的重要有機產(chǎn)品，在食品工業(yè)中被廣泛用作酸味劑、發(fā)酵劑、防腐劑、營養(yǎng)增補劑、色調(diào)保持劑、蛋白質(zhì)凝固劑等[14]。

1　材料與方法

1.1　菌株和質(zhì)粒

pMD18-T克隆載體購自 TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；pET28a(+) 表達載體購自Novagen公司；大腸桿菌BL21(DE3) 購自Invitrogen公司。

1.2　主要試劑和儀器

分子生物學工具酶、DNA markers購自TaKaRa寶生物工程 (大連) 有限公司。L-蘇氨酸、L-ABA、D-葡萄糖酸標準樣品購自Sigma公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；引物合成與核酸序列測定由上海生工生物工程公司完成；其他試劑均購自國藥集團。

圖1　全細胞轉化合成途徑[13]Fig. 1 Scheme of the reaction catalyzed by the whole-cell catalyst[13].

高速冷凍離心機購自HITACHI公司；高效液相色譜、氨基酸柱、有機酸柱購自Agilent公司；酶標儀購自Thermo公司；超聲破碎儀購自SONICS公司；PCR儀購自Bio-Rad公司；5 L發(fā)酵罐購自上海保興生物設備工程有限公司。

1.3　重組質(zhì)粒構建

根據(jù)已報道的 L-蘇氨酸脫氨酶基因ltd序列[15](GenBank登錄號：948287) 設計引物T1和T2 (文中所用引物見表1)，上游引物T1的5′端引入BamHⅠ酶切位點，下游引物T2的5′端引入Hind Ⅲ 酶切位點。

根據(jù)已報道的蠟樣芽孢桿菌的亮氨酸脫氫酶基因ldh序列[16](GenBank登錄號：1206507) 設計引物F1和F2，上游引物F1的5′端引入BamHⅠ酶切位點，下游引物F2的5′端引入SacⅠ酶切位點。

根據(jù)已報道的枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因gdh序列[17](GenBank登錄號：938261) 設計引物R1和R2，上游引物R1的5′端引入BamHⅠ酶切位點，下游引物R2的5′端引入Hind Ⅲ 酶切位點。

分別以大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過試劑盒純化后，分別按酶切位點進行雙酶切，回收片段，連接到克隆載體pMD18-T，隨后再連接到表達載體pET28a(+)，轉化入菌株E. coliBL21(DE3)，利用卡那霉素篩選重組質(zhì)粒 pET28a(+)-ltd、pET28a(+)-ldh、pET28a(+)-gdh，然后再設計串聯(lián)引物G1和G2，上游引物G1的5′端引入酶切位點SphⅠ，下游引物G2的5′端引入酶切位點BglⅡ。

表1　本研究所用PCR擴增引物Table 1 Primers for PCR amplication used in this study

以重組質(zhì)粒pET28a(+)-gdh為模板，進行PCR擴增，按酶切位點進行雙酶切，回收片段，與雙酶切重組質(zhì)粒pET28a(+)-ldh連接，轉化入菌株E. coliBL21(DE3)中，利用卡那霉素篩選重組質(zhì)粒pET28a(+)-ltd/gdh。

將上述重組質(zhì)粒進行酶切驗證，且通過上海生工生物完成測序，驗證正確后表明重組質(zhì)粒構建成功。

1.4　培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g/L，酵母提取物8 g/L，K3PO44 g/L，NaCl 3 g/L，一水合檸檬酸2.1 g/L，檸檬酸鐵銨0.3 g/L，甘油10 g/L，(NH4)2SO42.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

種子液培養(yǎng)：甘油菌以1%比例接種于5 mL種子培養(yǎng)基，卡那霉素終濃度100 μg/L，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)10 h。

發(fā)酵罐二級種子培養(yǎng)：將種子液按1%比例接種到150 mL LB培養(yǎng)基中，卡那霉素終濃度100 μg/L，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)6 h。

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵：二級種子液以5%比例接種于2.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基中。初始溫度為37 ℃，pH為7.0，轉速200 r/min，通氣量1vvm，發(fā)酵過程中pH調(diào)控采用50%氨水自動流加。當溶氧下降時上調(diào)轉速，保持溶氧在20%以上。3 h后轉速逐漸升至600 r/min，溶氧停止下降，此時開始補料，補料培養(yǎng)基為甘油400 g/L，胰蛋白胨25 g/L，酵母提取物50 g/L，通過補料使溶氧控制在 10%以上。當OD600大于 18時，加入0.2 mmol/L IPTG進行誘導，溫度降低至28 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)15 h。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液經(jīng)低溫離心 (8000 r/min，15 min)，然后–20 ℃保存。

1.5　酶活性的測定

離心后的菌體用無菌水洗滌兩次后，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液重新懸浮，然后在4 ℃下用勻漿儀進行細胞破碎，離心取上清得到粗酶液。LTD、LDH、GDH的酶活性測定分別參考Umbarger和Brown[18]、Ansorge和 Kula[19]、Fujita[20]等的報道。

1.6　全細胞催化條件

在搖瓶中進行全細胞催化條件優(yōu)化，轉速為180 r/min，溫度為30 ℃，pH控制在7.5，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，曲拉通x-100濃度0.3% (V/V)，濕菌體量為40 g/L，工程菌BL21-LDH與BL21-LDH/GDH配比為1：5，底物L-蘇氨酸與D-葡萄糖添加比例為1：1 (mol/mol)，即 L-蘇氨酸 15 g/L，D-葡萄糖 22.7 g/L，反應體積為50 mL。

2　結果與分析

2.1　重組菌的構建與表達

按前述方法構建得到了重組菌株 BL21-LTD和BL21-LDH/GDH，分別攜帶重組質(zhì)粒pET28a(+)-ltd，pET28a(+)-ldh/gdh，測序驗證正確后表明重組質(zhì)粒構建成功。BL21-LTD和BL21-LDH/GDH的蛋白電泳圖譜如圖2A、B所示，LTD、LDH、GDH蛋白分子量分別為56.2、39.9、28.1 kDa。

2.2　全細胞轉化聯(lián)產(chǎn)L-ABA和D-葡萄糖酸條件優(yōu)化

2.2.1　溫度與pH對催化效率的影響

首先考察了溫度對偶聯(lián)反應的影響。溫度是影響酶反應的重要因素，同時高溫也會對酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生負面影響[21]。如圖3A所示，考察了25–50 ℃下的全細胞轉化反應，反應條件為pH 7.5，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，曲拉通x-100濃度0.3% (V/V)，濕菌體量為40 g/L，工程菌BL21-LTD與BL21-LDH/GDH配比為1：5，底物L-蘇氨酸與D-葡萄糖添加比例為1：1 (mol/mol)，即 L-蘇氨酸 15 g/L，D-葡萄糖 22.7 g/L，反應體積為50 mL。發(fā)現(xiàn)最優(yōu)反應溫度為30 ℃，80 min時底物完全轉化。

眾所周知，每一種酶在單獨作為生物催化劑時都有一個最佳催化效果的pH值，但是在多酶催化的體系中，每一種酶的最優(yōu)pH值不同，所以需要綜合考慮pH對轉化反應的影響。以單位時間內(nèi)反應轉化率為衡量標準進行考察。如圖3B所示，考察了pH 6.5–8.0下的全細胞轉化反應，其他反應條件同上?？梢钥闯?，最優(yōu)反應pH為7.5。

圖2　蛋白電泳圖 (A: BL21-LTD; B: BL21-LDH/GDH)Fig. 2 SDS-PAGE analysis of BL21-LTD (A) and BL21-LDH/ GDH (B). M: marker; C: control; 1: LTD purified by IMAC; 2: soluble fraction of LTD; 3: co-expressing of LDH and GDH.

圖3　溫度 (A) 和pH (B) 對轉化反應的影響Fig. 3 Effect of reaction temperature (A) and buffer pH (B) on the whole-cell catalyst. (B) Effect of buffer pH on whole-cell catalyst.

2.2.2　細胞通透劑對轉化速率的影響

此反應為兩種工程菌混合進行全細胞轉化，底物L-蘇氨酸先由BL21-LTD轉化為2-酮丁酸，2-酮丁酸再進入BL21-LDH/GDH轉化為L-ABA，故細胞通透性的改變可能會影響轉化反應的效率。為了克服由于細胞壁、細胞膜存在而形成的滲透壁障，可以通過物理、化學等方法改變細胞壁、膜的通透性。通過處理后的細胞通常仍保持其形態(tài)上的完整性，但由于其細胞壁、膜受到了一定的破壞，其對低分子量物質(zhì)的滲透障礙被部分或完全解除。改變細胞通透性的方法很多，其中去污劑是一種較常用的方法[22]。由于去污劑分子可穿透活性細胞細胞膜，可作為細胞膜的通透劑，所以選取曲拉通 x-100、CTAB、吐溫-80進行研究。首先在不同濃度下測試這3種通透劑的效果，可以看出曲拉通x-100作為細胞通透劑效果最好，吐溫-80和CTAB在0.2%濃度下催化效率最高，但都不如曲拉通x-100 (圖4A)。然后考察了0–0.6% (V/V) 曲拉通x-100濃度的全細胞轉化反應?？梢钥闯銮?x-100的最優(yōu)濃度為0.3% (圖4B)，不添加細胞通透劑會影響細胞間物質(zhì)交換，導致轉換率過低；同時過高的濃度會使膜蛋白從細胞膜裂解，破壞細胞導致酶的穩(wěn)定性下降。

2.2.3　菌體量配比及不同菌體量濃度對轉化的影響

由于是混菌轉化，所以要對兩種重組菌BL21/pET28a-ltd與BL21/pET28a-ldh/gdh的菌體量進行合適的配比，以便達到合適的酶活比例，提高生產(chǎn)效率。通過測量一定菌體量下對L-蘇氨酸/2-酮丁酸的轉化速率來確定，兩種工程菌分別進行全細胞轉化，菌體量為30 g/L (濕重)。轉化效率如圖5A所示，工程菌BL21-LTD對L-蘇氨酸的每小時轉化效率約為25 g/L，BL21-LDH/GDH轉化2-酮丁酸為L-ABA的每小時效率約為5 g/L，故菌體量配比定為 1：5 (LTD、LDH、GDH三種酶的酶活比為12：10：25)。

單位體積內(nèi)酶活與菌體濃度成正比，但轉化效率并不會隨菌體濃度的增加而一直增加，為了體現(xiàn)高效經(jīng)濟性，需要得知在達到最高轉化效率時的菌體量?？疾炝?–60 g/L的濕細胞濃度的全細胞轉化反應，其他反應條件同上。如圖5B所示，濕菌體濃度為40 g/L (酶量為分別為4800、4000、10000 U/L)時，可以達到最高轉化效率。隨著細胞濃度的繼續(xù)增加，轉化效率也不再提高。

圖4　不同細胞通透劑 (A) 和不同濃度曲拉通x-100 (B) 對轉化反應的影響Fig. 4 Effect of different permeabilization medium (A) and different concentration of triton x-100 (B) on whole-cell catalyst.

圖5　BL21-LTD和BL21-LDH/GDH的轉化效率 (A) 和菌體量濃度對轉化反應的影響 (B)Fig. 5 The catalytic efficiency of LTD and LDH/GDH (A) and effect of wet cells amount on the reaction (B).

2.3　在 5 L發(fā)酵罐上進行全細胞轉化聯(lián)產(chǎn)L-ABA與D-葡萄糖酸

經(jīng)過上述條件優(yōu)化，最終反應條件為溫度30 ℃，pH 7.5，曲拉通x-100濃度0.3% (V/V)，濕菌體量為40 g/L，工程菌BL21-LTD與BL21-LDH/GDH配比為1：5，在0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液中反應，反應體積為2 L，轉速為200 r/min，采取分批補料，每小時添加L-蘇氨酸15 g/L，D-葡萄糖23 g/L (8 h后逐漸減少補料量)。反應20 h后，反應體系中L-ABA濃度達141.6 g/L，D-葡萄糖酸濃度達269.7 g/L，底物轉化率>99% (圖6)。

生物法合成L-ABA的同類工作見表2，其中Tao等[13]同樣利用LTD、LDH和GDH，以L-蘇氨酸、D-葡萄糖為底物進行轉化并完成輔酶循環(huán)，也獲得了較高的產(chǎn)量 (124.8 g/L)，但其用細胞破碎液進行轉化，并添加20 mg/L的NAD+，本研究使用全細胞進行轉化，省去了細胞破碎工藝；另外，在一般生長條件下，大腸桿菌胞內(nèi)NAD+和NADH的濃度大約為 0.4 mmol/L[23-24]，在此濃度下不需額外添加輔酶NAD+，并且獲得更高的產(chǎn)量和得率。

由表3可知，Tao等采用FDH以甲酸為底物進行輔因子循環(huán)生產(chǎn)L-ABA，其副產(chǎn)物是二氧化碳，其優(yōu)點是產(chǎn)物分離方便；但是甲酸一般對酶具有較強的毒害作用，造成酶失活速率較快，從而造成生產(chǎn)延續(xù)性較差，L-ABA最大產(chǎn)量只有100 g/L，生產(chǎn)效率為6.9 g/(L·h)，該結果顯著低于本研究獲得的結果 (141.6 g/L，7.08 g/(L·h))；另外，在工業(yè)化生產(chǎn)方面，以甲酸為原料需要建設防爆車間，可能會存在安全隱患和增加生產(chǎn)成本，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究采用 GDH和葡萄糖進行輔因子循環(huán)生產(chǎn)L-ABA，同時獲得共產(chǎn)物葡萄糖酸，雖然在分離提取方面會造成一定的困難，但是所添加底物葡萄糖對酶基本沒有毒害作用，有利于生產(chǎn)的持續(xù)性，這也是本研究結果較為理想的重要原因，另外，葡萄糖酸本身是一種重要的原料，廣泛利用于食品及醫(yī)藥行業(yè)，同時沒有二氧化碳的產(chǎn)生，減少了工業(yè)化生產(chǎn)過程中對溫室效益的危害。

3　結論

本研究成功構建了一種基于脫氫酶的生物轉化途徑，并在大腸桿菌中偶聯(lián)了NADH再生系統(tǒng)，共表達LDH與GDH，首次報道實現(xiàn)了全細胞轉化L-蘇氨酸、D-葡萄糖聯(lián)產(chǎn)L-ABA與D-葡萄糖酸。通過優(yōu)化轉化條件，采用分批補料策略，164 g/L的L-蘇氨酸和248 g/L的D-葡萄糖轉化為141.6 g/L的L-ABA和269.4 g/L的D-葡萄糖酸，時空得率分別達到 7.1 g/(L·h)和 13.5 g/(L·h)，得率超過 99%。

盡管全細胞轉化和酶法轉化一樣，都存在長時間使用下酶活性下降的問題，但在相同的條件下全細胞內(nèi)的催化系統(tǒng)依舊比酶法更加穩(wěn)定[24]。不僅如此，相比酶法轉化需要額外添加昂貴的輔因子(NAD+、NADP+等)，無需輔因子的全細胞系統(tǒng)在高產(chǎn)的同時更具價格吸引力[25]，所以本研究構建的全細胞轉化系統(tǒng)更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

圖6　5 L發(fā)酵罐上進行全細胞轉化聯(lián)產(chǎn)L-ABA與D-葡萄糖酸Fig. 6 Whole-cell catalyst production of L-ABA and D-gluconic acid on 5 L fermenter.

表2　生物合成L-ABA同類工作對比Table 2 Comparison between this work and other reported biosynthesis of L-ABA

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