朱豐曉，張鳳雪，張智俊，吳林軍

浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 臨安 311300

脫氧辛糖酸-8-磷酸合酶 (3-Deoxy-D-mannooctulosonate 8-phosphate synthase，KDO8PS) [EC:2.5.1.55]是 2-酮基-3-脫氧-D-甘露辛酮糖酸(CMP-KDO) 合成途徑中的一種關(guān)鍵酶[1]，其基因表達(dá)及酶活性高低直接影響到革蘭氏陰性菌Gˉ細(xì)胞壁的合成，對于植物細(xì)胞壁合成同樣重要，可對植物花粉管、芽的生長、伸長等有重要調(diào)控作用[2]。

KDO8PS屬于醛縮酶超家族蛋白，分布于革蘭氏陰性菌Gˉ及植物細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)催化磷酸烯醇式丙酮酸與 α-阿拉伯糖-5-磷酸產(chǎn)生 2-酮-3-脫氧辛糖8磷酸 (KDO8P)，并釋放無機(jī)磷酸 (Pi)。其中產(chǎn)物 2-酮-3-脫氧辛糖-8-磷酸是 2-酮-3-脫氧辛糖酸 (KDO) 的前體[3-5]。研究表明在已知眾多致病革蘭氏陰性菌中，Lipid A是內(nèi)毒素的物質(zhì)基礎(chǔ)，其O-抗原的多樣性決定了Gˉ表面抗原決定簇的多樣性，這也是致病菌產(chǎn)生抗藥性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[6]。而KDO是脂多糖 (LPS) 組分中必需的八碳糖，它連接類脂 A (Lipid A) 與O-特異側(cè)鏈共同嵌入細(xì)胞壁的外膜上[7]。通常Lipid A與兩個 KDO殘基組成的脂多糖 (LPS)構(gòu)成革蘭氏陰性菌外膜的外殼，這種外殼對革蘭氏陰性菌細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性及侵染至關(guān)重要?；谶@種 Gˉ細(xì)胞壁的構(gòu)成特點，如阻斷KDO的生物合成，能破壞Gˉ的細(xì)胞壁合成，并避免致病菌產(chǎn)生耐藥性。因此，基于 Gˉ細(xì)菌KDOPS開展相關(guān)抑制劑篩選，進(jìn)而開發(fā)新的抗生素藥物是目前KDO8PS的研究熱點[8]。同樣，在植物細(xì)胞中，KDO8PS所催化的終產(chǎn)物KDO主要是高等植物細(xì)胞壁以及一些綠色藻類植物細(xì)胞壁果膠多糖鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(RG-Ⅱ) 的重要組分[9-10]。因此，了解植物KDO8PS的結(jié)構(gòu)與功能，不僅有助于完善植物細(xì)胞壁生物合成的代謝途徑，而且對于未來新型抗Gˉ菌農(nóng)藥的開發(fā)也具有重要應(yīng)用價值。但植物KDO8PS相關(guān)研究尚處于起步階段，阻礙了該酶的進(jìn)一步應(yīng)用。

截止到目前尚未有植物KDO8PS結(jié)構(gòu)的報道，查詢PDB數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，植物中KDO8PS晶體結(jié)構(gòu)還尚未解析[11]，但已有多個微生物來源的KDO8PS晶體結(jié)構(gòu)被解析，從其晶體學(xué)結(jié)構(gòu)可以看到該酶是一個同源四聚體，其中每個單體都含有(β/α)8桶狀折疊。依據(jù)結(jié)構(gòu)的活性位點特性分析，單體中 PEP與 A5P被預(yù)測結(jié)合于KDO8PS的磷酸位點13 ?部分[3,5-6,12-13]。微生物來源的KDO8PS酶依據(jù)催化是否需金屬離子參與，分為金屬依賴性和非金屬依賴性 2類，但其催化機(jī)制基本相同。KDO8PS發(fā)生催化反應(yīng)需 2個底物，該酶與底物結(jié)合的順序首先是PEP的靠近以及定向結(jié)合在酶的結(jié)合位點，釋放產(chǎn)生 1分子無機(jī)磷酸，并引起酶構(gòu)象的改變形成一個過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，然后此過渡態(tài)結(jié)構(gòu)再同A5P結(jié)合，完成催化最終產(chǎn)生KDO8P[14-17]。

植物來源的KDO8PS研究在擬南芥中首先獲得突破，已成功分離鑒定出2個編碼KDO8PS的旁系同源基因AtKDSA1和AtKDSA2，經(jīng)熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)在成熟的花中，負(fù)責(zé)合成KDO8PS的AtKDSA2基因的表達(dá)量明顯增高，推測其對花粉管的生長和伸長具有一定的作用[2]。盡管酶催化活性位點氨基酸保守，植物KDO8PS催化作用機(jī)制與微生物的類似，但不同來源的KDO8PS酶，一級結(jié)構(gòu)序列間差異顯著，會導(dǎo)致酶空間結(jié)構(gòu)的變化，則相應(yīng)的酶催化活性、熱穩(wěn)定性、催化反應(yīng)pH等存在何種功能差異仍需深入研究。

本研究在毛竹KDO8PS基因克隆的基礎(chǔ)上，著重進(jìn)行KDO8PS的原核表達(dá)、蛋白純化，溶液中酶的狀態(tài)及酶學(xué)性質(zhì)研究，研究結(jié)果不僅為后續(xù)植物來源KDO8PS基因功能及晶體學(xué)結(jié)構(gòu)解析奠定了基礎(chǔ)，而且對于今后植物八碳糖的生物合成及新型植物農(nóng)藥研發(fā)具有重要應(yīng)用價值。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　菌株與試劑

大腸桿菌Escherichia coli菌株 DH5α和BL21(DE3)、原核表達(dá)載體pET-HTT均由本實驗室保存；RNA提取試劑/Trigol購自北京鼎國生物公司；AMV酶反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BamHⅠ、EcoR Ⅰ、T4 DNA連接酶和 pMD18-T simple vector購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工公司。A5P與PEP購自Sigma (美國)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2　儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌器 (SANYO MLS-3750)、PCR儀 (Gene Amp?PCR System 9700)、離心機(jī)(Himac CF 16RX versatile Compact Centrifuge)、PYX-DH350恒溫培養(yǎng)箱、GL-25M 高速冷凍離心機(jī) (上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、AKTA純化儀器、酶標(biāo)儀、Beckman/Coulter XL-A分析超速離心 (AUC) 儀。

1.2　方法

1.2.1　PeKDO8PS基因克隆及序列分析

采用Trigol試劑盒提取毛竹新鮮實生苗的總RNA，所得RNA用AMV酶反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA置于–80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

通過 NCBI數(shù)據(jù)庫獲得雙子葉植物擬南芥Arabidopsis thaliana、單子葉植物水稻 (Oryza sativa) KDSA基因序列 (GenBank Accession No.NM_001035978.2, XM_015763128.1)，根據(jù)該基因的保守序列設(shè)計PCR引物。上游引物A: 5′-CG GGATCCATGGATGCTTCGTCC-3′BamHⅠ酶切位點，下游引物 B: 5′-GGAATTCTCATTCCTGGA ATGGAGTGAGGT-3′EcoRⅠ酶切位點，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。以毛竹實生苗cDNA為模板，采用PCR上游和下游引物配對進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×緩沖液2 μL，上游引物 (10 μmol/L) 1 μL，反向引物(10 μmol/L) 1 μL，dNTPs (各 2.5 mmol/L) 1 μL，cDNA (0.05 μg/L) 1 μL，rTaq酶 (5 U/μL) 0.2 μL，加水至總體積為20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共 32 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物電泳分析后經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收，將回收的DNA片段連接到pMD18-T simple vector載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)菌液PCR檢測，陽性克隆測序驗證。

序列分析及引物設(shè)計使用 VectorNTI軟件完成。

1.2.2　PeKDO8PS原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

將含有目的基因的pMD18-T載體質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ限制性雙酶切，回收876 bp的目的 DNA片段。插入經(jīng)同樣酶切后的pET-HTT表達(dá)載體，得到一個C-末端含有6個His親和標(biāo)簽的重組子。將重組質(zhì)粒經(jīng)熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌RosettaTM(DE3) 和BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定陽性克隆，并測序驗證。挑取單克隆，接入LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)，當(dāng)菌體OD600達(dá)到0.5時，加入0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，37 ℃搖床上誘導(dǎo)14 h，收集菌體。超生裂解不同溫度收集的菌體，SDS-PAGE檢測蛋白可溶表達(dá)情況。

1.2.3　PeKDO8PS酶分離純化

將菌體重懸在25 mL PBS裂解緩沖液 (含30 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0，200 mmol/L NaCl)，加入 50%甘油至終濃度 5%，超生破碎 (on/off 8 s/8 s、總時間 15 min、功率 40%)，4 ℃、17000 r/min離心30 min，將上清轉(zhuǎn)移至預(yù)先平衡過的鎳，4 ℃結(jié)合 30 min后，用 Buffer A (30 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0，200 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑) 洗雜蛋白，1倍體積Buffer B (30 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0，200 mmol/L NaCl，200 mmol/L咪唑) 洗脫目的蛋白。將洗脫的目的蛋白溶液在10 kDa濃縮柱中濃縮后進(jìn)行分子篩層析。分子篩使用Superose 1210/300 GL柱，用Buffer C(30 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0，200 mmol/L NaCl)洗脫，根據(jù)出峰的大小順序，在目標(biāo)蛋白峰處每500 μL收集一管，SDS-PAGE檢測每管的純度，將蛋白濃縮到5 mg/mL，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4　PeKDO8PS戊二醛交聯(lián)檢測

戊二醛與相鄰的蛋白分子上的氨基反應(yīng)，而產(chǎn)生交聯(lián)形成穩(wěn)定的共價鍵。為了檢測PeKDO8PS蛋白的體外同源互作，本實驗以PBS緩沖液 (pH 8.0) 作為交換溶液去除KDO8PS中的Tris-HCl，將 KDO8PS稀釋到500 μg/mL，同時將戊二醛稀釋到2.4 mmol/L。KDO8PS與戊二醛以 1∶6的摩爾比混合置于室溫中，此混合液依據(jù)交聯(lián)時間的不同分為交聯(lián)0、10、30、90 min組，此反應(yīng)由1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 終止，其中Tris-HCl的最終濃度為500 mmol/L，終止時間為 10 min。分別取20 μL樣品加入5 μL的5×蛋白上樣緩沖液，煮沸 10 min后點樣 10%SDS-PAGE，分析蛋白交聯(lián)情況。

1.2.5　PeKDO8PS分析超速離心AUC檢測

用 30 mmol/L Tris (pH 8.0)，200 mmol/L NaCl混合液稀釋目的蛋白光吸收 (OD260) 至0.4，選擇An60Ti轉(zhuǎn)子，置于 Beckman/Coulter XL-A，20 ℃、50000 r/min離心8 h，分析酶多聚類型。對沉降速度數(shù)據(jù)參照 C(S) 即沉降系數(shù)函數(shù)模型利用Sedfit擬合推算待測樣品分子質(zhì)量。

1.2.6　PeKDO8PS主要酶學(xué)特性分析

取 50 μL 含 3 mmol/L PEP，3 mmol/L A5P以及100 mmol/L Tris/acetate緩沖液，加入終濃度100 nmol/L的酶液。分別測定酶催化的最適反應(yīng)溫度及pH。最適反應(yīng)溫度測定：將反應(yīng)溫度控制在20?80 ℃范圍內(nèi)，每間隔10 ℃下進(jìn)行酶促反應(yīng) (pH 8.0)，然后測定酶活，酶活測定方法參照比色測定法[18](具體方法略)。最高酶活性設(shè)為100%，用來計算相對酶活性的變化。最適pH測定：在37 ℃條件下，pH 4.0?9.0范圍內(nèi)每隔0.5測定酶活，每個樣品設(shè)3個平行組，結(jié)果取平均值。以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。金屬離子及酶抑制劑對酶活性的影響：分別取濃度為100 mmol/L的Cu2+、Zn2+、Se2+、Li+、Na+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、K+、Fe3+、Co2+等11種金屬離子及金屬蛋白酶抑制劑EDTA分別與酶液混合，使離子終濃度為5 mmol/L，以未經(jīng)處理的酶液的酶活力為 100%作對照，在最適反應(yīng)條件下測定酶活。以上3組類型實驗每個樣品均為3次重復(fù)處理，利用EXECL繪制相關(guān)曲線及柱形圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　PeKDO8PS基因克隆及序列分析

以毛竹總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，經(jīng) PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物在 1%的瓊脂糖凝膠(含EB) 中電泳后，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析在900 bp左右有1條亮帶，與預(yù)測的基因片段大小相符。將此片段回收與pMD18-T simple連接后，經(jīng)菌液PCR驗證后的陽性菌落測序，結(jié)果表明插入片段為876 bp，含有一個完整ORF，編碼291個氨基酸，氨基酸序列Blast分析發(fā)現(xiàn)毛竹KDO8PS屬于脫氧辛糖酸-8-磷酸合酶超家族，其中與水稻、擬南芥、大腸桿菌 KODO8PS序列的一致性分別達(dá)到 95%、84%和 43%，第260?270位為脫氧辛糖酸-8-磷酸合酶保守區(qū)，等電點為7.7，分子量為32 kDa。

2.2　PeKDO8PS重組蛋白的表達(dá)純化

重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株 RosettaTM(DE3) 和BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破碎，分別取上清、沉淀，加入上樣緩沖液，95 ℃變性后，SDS-PAGE變性膠電泳分析，在電泳圖譜32 kDa處發(fā)現(xiàn)一條明顯的表達(dá)條帶，并且對比分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)菌株 RosettaTM(DE3) 較 BL21(DE3)在37 ℃培養(yǎng)溫度下表達(dá)量相對高些，故在后續(xù)試驗中確定表達(dá)菌株RosettaTM(DE3) 在 37 ℃為重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳宿主菌株 (圖1)。SEC洗脫峰在 66 kDa 位置出現(xiàn)明顯的二聚體峰，132 kDa處出現(xiàn)較弱四聚體峰。說明KDO8PS在洗脫溶液 (30 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，200 mmol/L NaCl) 中主要以二聚體形式存在 (圖 2A)。經(jīng)分子篩 (SEC) 層析純化后純度90%以上 (圖2B)，可用于后續(xù)酶特性實驗分析。

2.3　PeKDO8PS水溶液中多聚狀態(tài)存在形式

2.3.1　戊二醛體外交聯(lián)

戊二醛有2個醛基，可以同蛋白分子上的氨基反應(yīng)，產(chǎn)生交聯(lián)形成穩(wěn)定的共價鍵，產(chǎn)生不同多聚體狀態(tài)。PeKDO8PS經(jīng)戊二醛交聯(lián)，SDS-PAGE檢測后發(fā)現(xiàn)，在33、65、100和130 kDa左右均發(fā)現(xiàn)條帶，依據(jù)單體分子量 (理論值32 kDa) 推斷，交聯(lián)后可形成二聚體、三聚體及四聚體蛋白 (圖3)。另外，隨著交聯(lián)反應(yīng)時間酶單體的量逐漸減少，二聚體、三聚體、四聚體的量明顯增加。說明戊二醛作用下，PeKDO8PS存在的不同蛋白聚合體形式均有機(jī)會發(fā)生。

圖2　PeKDO8PS分子篩層析 (A) 及SDS-PAGE檢測 (B)Fig. 2 The purification of PeKDO8PS by size exclusion chromatography (A) and identification by SDS-PAGE (B).

圖3　PeKDO8PS戊二醛交聯(lián)檢測Fig. 3 The cross-linking of KDO8PS with glutaraldehyde.M: protein standard marker; Line1: monomer; Line 2–4:glutaraldehyde cross-linking of KDO8PS with 10 min,30 min and 90 min.

2.3.2　AUC分析

AUC分析超速離心技術(shù)主要用于生物大分子的相對分子質(zhì)量測定，估算樣品的純度和檢測生物大分子構(gòu)象的變化等。根據(jù)AUC分析獲得PeKDO8PS蛋白的沉降系數(shù)，通過Sedfit軟件擬合后可知，在超高速離心力作用下，酶分子沉降過程中存在多種聚體形式，且不同蛋白聚合形式得以有效分離。從圖 4可知，6S左右的沉降系數(shù)所對應(yīng)的分子量大小在120 kDa左右，推斷為KDO8PS的四聚體 (Tetramer, T)，其余為少量二聚體 (Dimer, D) 和單體 (Monomer, M)。另外，6S所占的比例最大，說明PeKDO8PS在溶液中主要以四聚體存在。

2.4　PeKDO8PS酶學(xué)性質(zhì)

酶活性測定結(jié)果表明該酶最適溫度為60 ℃，在 25–65 ℃范圍內(nèi)酶活力較高，65–80 ℃酶活力急劇下降，而在25 ℃時仍保持在60%以上 (圖5)；溫度為55 ℃時，測定該酶最適pH為8.0，屬于弱堿性酶。在 pH 6.0?8.0范圍酶活快速升高，pH 7.0?8.5之間酶的活性穩(wěn)定在80%以上 (圖6)，超出這一范圍，則酶活迅速下降。

各種金屬陽離子及金屬蛋白酶抑制劑EDTA對KDO8PS酶活影響結(jié)果顯示 (圖7)，各種金屬離子對酶活性存在不同程度的抑制作用。其中以Fe3+對酶活的抑制作用最強(qiáng)；Cu2+、Se2+抑制作用較弱。而EDTA對酶活性有一定激活作用，分析認(rèn)為EDTA是通過其螯合作用減弱了金屬離子對酶活性的影響，從而對酶活性起到激活作用。

圖4　PeKDO8PS分析超速離心的沉降分布曲線Fig. 4 The sedimentation distribution profile from the AUC experiment for PeKDO8PS. The sedimentation coefficient positions corresponding to the monomer(M), dimers (D) and tetramer (T) are indicated.

圖5　溫度對KDO8PS酶活性的影響Fig. 5 Effect of temperature on activities of Phyllostachys edulis KDO8PS. Error bars representfor three determinations.

圖6　pH對KDO8PS酶活性的影響Fig. 6 Effect of pH on activities of Phyllostachys edulis KDO8PS. The maximum activity was taken as 100%. Error bars represent for three determinations.

圖 7 金屬陽離子及金屬蛋白酶抑制劑 EDTA對KDO8PS酶活影響Fig. 7 Effcet of different metal ions and EDTA on KDO8PS activity. Activity of KDO8PS as isolated was measured at 37 ℃ in the presence of various metal or EDTA (100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 3 mmol/L PEP,3 mmol/L A5P, 5 mmol/L metal or EDTA). Error bars represent for three determinations.

3　討論

KDO8PS在KDO合成途徑中是唯一的合成酶，可催化兩種底物 A5P和磷酸烯醇式酸 PEP發(fā)生共價鍵結(jié)合形成八碳糖骨架，這為最終八碳糖的KDO產(chǎn)生奠定了關(guān)鍵的物質(zhì)基礎(chǔ)。其酶活性的高低將直接影響植物細(xì)胞壁果膠類RG-II多糖的合成，最終影響細(xì)胞的生長發(fā)育相關(guān)的一系列代謝活動。KDO8PS催化反應(yīng)途徑與3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶 (DAH7P synthase)相似。3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAH7P synthase)可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP) 與赤蘚糖-4-磷酸產(chǎn)生3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸，還發(fā)現(xiàn)這兩種酶的底物結(jié)合位點也是相似的[14,19]，說明KDO8PS與DAH7PS的起源采用相同的合成催化機(jī)理，但兩者結(jié)構(gòu)上的具體差異，還需進(jìn)一步結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的比較研究。

在PeKDO8PS酶的分離純化過程中，本研究通過兩步法快速獲得了該蛋白的純酶液，純度達(dá)90%以上。SEC結(jié)果顯示，毛竹KDO8PS在 30 mmol/L Tris-HCI (pH 8.0)、200 mmol/L NaCl溶液條件下，主要以二聚體形式存在[20]，而微生物KDO8PS晶體學(xué)結(jié)構(gòu)顯示為四聚體形式存在[23]，初步認(rèn)為這可能與它們之間的序列差異性有關(guān)。進(jìn)一步分析超速離心 (AUC) 實驗驗證表明溶液中該酶主要為四聚體構(gòu)象。相比較SEC結(jié)果而言，AUC分析蛋白質(zhì)復(fù)合物寡聚物的結(jié)果更為精準(zhǔn)。而兩者出現(xiàn)分歧的原因可能是蛋白溶液中的濃度差異造成的，推測KDO8PS在高濃度的情況下易發(fā)生二聚體向四聚體的轉(zhuǎn)變，這一推論在AUC峰圖上也得到驗證，即除了四聚體外，存在少量單體和二聚體。在添加戊二醛交聯(lián)劑的情況下，出現(xiàn)了單體和不同類型的寡聚物，說明KDO8PS在溶液中出現(xiàn)不同的構(gòu)象形式是完全可能的，也體現(xiàn)出KDO8PS分子同其他蛋白類似，水溶液中具有柔性。至于還有何種外界環(huán)境因素和內(nèi)在結(jié)構(gòu)影響酶構(gòu)象的變化，還需進(jìn)一步深入研究。

PeKDO8PS經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)測定，該蛋白的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，最適pH 8.0，與已報道的擬南芥酶特性類似，但酶催化的溫度及pH作用范圍較大腸桿菌KDO8PS更寬泛[21-22]，推測這與酶序列差異及結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度有關(guān)。通過多序列比對發(fā)現(xiàn)，KOO8PS序列除在催化活性位點、GNRxQ模體和KANRS模體非常保守外，毛竹、擬南芥KOO8PS同微生物來源的KOO8PS序列相似度只有40%左右[23-24]，在Loop區(qū)差異較大。這些區(qū)域的序列實際差異，除了可能影響酶聚合物狀態(tài)外，還會影響酶催化特性、穩(wěn)定性等功能[25]，并最終影響毛竹細(xì)胞壁的生物合成。當(dāng)溶液中存在各種金屬陽離子時均對酶活性有不同程度的抑制作用，其中 Cu2+、Zn2+對酶活性的抑制作用較弱，而 Fe3+對酶活性的抑制作用最強(qiáng)。這說明KDO8PS具有較差的三價金屬離子耐受性。盡管目前尚未得到植物來源KDO8PS的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)，但本文開展的酶分離純化、酶特性相關(guān)研究結(jié)果可為今后該蛋白的空間結(jié)構(gòu)與功能研究奠定基礎(chǔ)，同時也為八碳糖保健食品和植物新型農(nóng)藥的研發(fā)提供十分重要的參考。

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