望瀟文，向臘，徐婷，盧爭(zhēng)輝，張桂敏

湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源綠色轉(zhuǎn)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430062

苧麻纖維不僅是纖維中最長(zhǎng)、最堅(jiān)韌和最絲滑的，還具有潤(rùn)濕性好、不易縮水、易印染和可以抵抗霉菌、細(xì)菌及昆蟲等優(yōu)良的特性[1]，因此被普遍應(yīng)用于紡織和造紙行業(yè)中。然而，苧麻纖維中含有20%?30%由果膠和半纖維素組成的膠質(zhì)，當(dāng)其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，這些膠質(zhì)必須被去除[2]。在傳統(tǒng)的化學(xué)脫膠中，由于大量堿的使用和能量的消耗，引起了嚴(yán)重的環(huán)境污染，需要使用大量的人力物力來處理廢水、廢氣[3]。因此，利用微生物或其酶類來進(jìn)行生物脫膠成為一種研究趨勢(shì)[4]。另外，棉織物前處理中的煮練是去除棉織物表面大部分天然雜質(zhì)如果膠質(zhì)、蠟質(zhì)和殘留的漿料，從而改進(jìn)織物的外觀，提高潤(rùn)濕性，以利于印染等后加工。傳統(tǒng)工藝是在高溫強(qiáng)堿條件下去除纖維素共生物，除了對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重外，對(duì)纖維的損傷大，失重大。堿性果膠酶作為一種天然蛋白質(zhì)易于生物降解，不會(huì)污染環(huán)境與紡織品，具有保護(hù)纖維、提高精煉效率、降低能耗和污染等優(yōu)勢(shì)[5]。

果膠酶可以催化水解果膠分子中的α-1,4糖苷鍵，將其分解為半乳糖醛酸等物質(zhì)[6]。果膠酶可以從多種微生物中分離得到，比如芽孢桿菌[7]、鏈霉菌[8]和放線菌[9]等。堿性果膠酶主要是由芽孢桿菌產(chǎn)生，然而芽孢桿菌會(huì)分泌出對(duì)纖維有害的內(nèi)源性纖維素酶，因此在工業(yè)生產(chǎn)中芽孢桿菌并不是一個(gè)非常適合分泌表達(dá)堿性果膠酶的宿主。而畢赤酵母Pichia pastoris作為外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)一直被廣泛應(yīng)用[10]，它不產(chǎn)生內(nèi)源纖維素酶，具有醇氧化酶 (AOX1) 強(qiáng)啟動(dòng)子，可以嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)，且表達(dá)的蛋白還可以被糖基化從而提高蛋白的熱穩(wěn)定性，以甲醇作為誘導(dǎo)物，生產(chǎn)成本較低，非常適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。以最典型的分泌型表達(dá)載體pPIC9K為例，它具有醇氧化酶基因 5?AOX1啟動(dòng)子、3?AOX1終止子，能胞外分泌表達(dá)的信號(hào)肽序列MFα，并以HIS4基因重組互補(bǔ)作為選擇標(biāo)記[11]。

本研究前期將來源于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis中的堿性果膠酶基因pel168首先在大腸桿菌里表達(dá)[12]，測(cè)定了其所產(chǎn)堿性果膠酶 PEL168E最適溫度為 55 ℃，最適 pH為 9.5，比酶活為353 U/mg，然后將pel168進(jìn)行密碼優(yōu)化后，利用載體pHBM905A在畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)得到 PEL168P，其最適反應(yīng)條件和比酶活與PEL168E保持一致，但是發(fā)生了糖基化，在60 ℃的熱穩(wěn)定性顯著高于 PEL168E，說明糖基化可以提高該酶的熱穩(wěn)定性。pHBM905A是在pPIC9K的基礎(chǔ)上把卡那霉素Kan抗性基因表達(dá)盒插入到多克隆位點(diǎn)并在其上下游加上限制酶CpoⅠ和NotⅠ識(shí)別位點(diǎn)，并且將元件“Ampr+Ori”插入到HIS4基因序列中得到[13]。將該堿性果膠酶用于苧麻脫膠，發(fā)現(xiàn)其可以有效地去除苧麻纖維表面的果膠，但是構(gòu)建的工程菌所表達(dá)的酶活僅為54 U/mL，導(dǎo)致應(yīng)用成本過高。

本研究中用的表達(dá)載體 pHBM905BDM 是在pHBM905A 的基礎(chǔ)上將 5?AOX1啟動(dòng)子替換成d1+2×201AOX1，信號(hào)肽由MFα替換成MF4I-SS[14]。三種載體pPIC9K、pHBM905BDM和pHBM905A都是穿梭質(zhì)粒，所不同的是，pPIC9K含有組氨醇脫氫酶基因 (HIS4) 篩選標(biāo)記和G418抗性篩選標(biāo)記；另外兩個(gè)只含有HIS4篩選標(biāo)記。本研究先構(gòu)建了重組質(zhì)粒pHBM905A-pels和pHBM905BDM-pels，檢測(cè)載體上啟動(dòng)子和信號(hào)肽的不同對(duì)蛋白表達(dá)量的影響；然后利用pHBM905BDM上的HIS4篩選標(biāo)記，將 pHBM905BDM-pels電轉(zhuǎn)化 GS115酵母感受態(tài)，得到的轉(zhuǎn)化子通過果膠底物平板功能篩選獲得堿性果膠酶多拷貝菌株。同時(shí)構(gòu)建重組質(zhì)粒 pPIC9K-pels，電轉(zhuǎn)化通過功能篩選得到的酵母多拷貝菌株，并利用G418篩選重組子，以期得到表達(dá)量更高的菌株，從而進(jìn)一步降低堿性果膠酶的生產(chǎn)成本。最后將得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，檢測(cè)其在小型發(fā)酵罐中的產(chǎn)酶水平。

1　材料與方法

1.1　材料與配方

菌株：大腸桿菌Escherichia coliXL10-Gold克隆菌株、大腸桿菌Rossset Blue(DE3) 表達(dá)菌株購自 Transgene公司，畢赤酵母 GS115購自Invitrogen公司。

質(zhì)粒：pPIC9K購自 Invitrogen公司，pHBM905A[13]、pHBM905BDM[14]均為本實(shí)驗(yàn)室改造。

培養(yǎng)基：

YPD：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1.5%瓊脂 (固體)。

LB：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5%NaCl，1.5%瓊脂 (固體)。

BMGY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，0.34%YNB，1% (NH4)2SO4，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液 (pH 6.0)，1%甘油。

BMMY：同BMGY，無甘油。

MD：0.34% YNB，1% (NH4)2SO4，2%葡萄糖，1.5%瓊脂 (固體)。

果膠底物培養(yǎng)基：1%果膠，1.5%瓊脂，其余同BMMY，pH 7.0。

甘油分批發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油40 g/L，K2SO418 g/L，KOH 4.13 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，85% H3PO427 mL/L，CaSO40.93 g/L，微量元素溶液(PTM1) 4 mL/L[15]。

生長(zhǎng)補(bǔ)料培養(yǎng)基：含12 mL/L PTM1的50%(V/V) 的甘油溶液。

誘導(dǎo)補(bǔ)料培養(yǎng)基：含12 mL/L PTM1的100%的甲醇溶液 (分析純)。

1.2　畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

將來源于Bacillus subtilis168的堿性果膠酶基因pel根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性進(jìn)行優(yōu)化后得到基因pels，以引物F-P1和R-P1 (表1) 得到目的基因 PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后用T4DNA聚合酶和dTTP在12 ℃處理20 min，得到兩端分別是CpoⅠ和NotⅠ的粘性末端，處理好的基因片段pels分別與經(jīng)雙酶切的載體pHBM905A和pHBM905BDM連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10-Gold得到的正確重組質(zhì)粒分別命名為pHBM905A-pels和 pHBM905BDM-pels。由引物F-P2和R-P2 (表1) 得到的目的基因和表達(dá)載體pPIC9K同時(shí)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行酶切，處理好的基因片段與載體酶連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 XL10-Gold得到的正確重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-pels。

1.3　畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化

將線性化的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)條件為：電壓 1.5 kV，電擊時(shí)間4 ms。電擊后，立即加入1 mL冰預(yù)冷的1 mol/L山梨醇溶液，用移液器輕柔吸打混勻后，涂布于MD平板上，28 ℃培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

1.4　平板篩選高拷貝菌株

1.4.1　果膠底物平板

當(dāng)插入到畢赤酵母基因組上的異源基因拷貝數(shù)越多，則表達(dá)量應(yīng)該越高，因此對(duì)應(yīng)的堿性果膠酶的酶活越高。將MD平板上的轉(zhuǎn)化子接種于果膠底物平板上28 ℃培養(yǎng)，每隔12 h加適量的甲醇于平板蓋上進(jìn)行誘導(dǎo)。2–3 d后，在平板表面覆蓋一層 1%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) 溶液并靜置 10 min左右觀察水解圈的形成，水解圈越大代表對(duì)應(yīng)菌株產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

1.4.2　G418抗生素平板

將電轉(zhuǎn)后的產(chǎn)物涂布于含0.5 mg/mL G418的MD平板上，待轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后將其逐步接種于含1、2、3和4 mg/mL G418的YPD平板上，觀察酵母菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)，理論上生長(zhǎng)越快越好的菌株含有目的基因拷貝數(shù)越高，從而產(chǎn)酶量越高。

1.5　堿性果膠酶在畢赤酵母里的誘導(dǎo)表達(dá)和酶活測(cè)定

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.6　qPCR測(cè)定轉(zhuǎn)錄水平對(duì)蛋白表達(dá)的影響

RNA提取的方法參照TRIzol?Reagent kit，根據(jù) RNA (mg/mL)=40×OD260×稀釋倍數(shù)來計(jì)算RNA的量，取相同量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA的第一條鏈。反轉(zhuǎn)錄的方法參照 TaKaRa PrimeScriptTM1st strand kit。相對(duì)定量PCR的方法參照TaKaRa SYBR?Green I kit。進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析一般采用的是操作簡(jiǎn)便的2–ΔΔCt法，內(nèi)參基因選用的是 GS115內(nèi)源的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因GAP，但是目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率都必須接近100%，并且相互之間的效率偏差也必須在5%以內(nèi)。

表1　文中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.7　qPCR檢測(cè)目的基因的拷貝數(shù)

1.7.1　畢赤酵母總DNA的抽提

總 DNA抽提的方法參照 Easy-DNA? kit(Invitrogen)，測(cè)定總 DNA的濃度及純度，當(dāng)A260/A280高于1.8時(shí)可用于下一步的分析。

1.7.2　絕對(duì)定量

1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以畢赤酵母 GS115菌株的基因組為模板，F(xiàn)-P3和 R-P3為引物 (表 1)，PCR擴(kuò)增GAP基因；以pHBM905A-pels為模板，F(xiàn)-P1和R-P1 (表1) 為引物，PCR擴(kuò)增pels基因?；厥占兓腉AP和pels片段分別與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，得到正確的重組質(zhì)粒 pMD18T-GAP和pMD18T-pels，測(cè)定濃度并根據(jù)質(zhì)粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和阿伏伽德羅常數(shù)[16-17]，利用如下公式計(jì)算出每微升質(zhì)粒溶液中所含質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

將質(zhì)粒溶液稀釋成 104、105、106、107、108個(gè)拷貝/μL的DNA溶液，分別以1 μL各濃度質(zhì)粒溶液作為模板，以引物F-P4/R-P4和 F-P5/R-P5(表1) 進(jìn)行熒光定量PCR。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶軟件給出的Ct值作為縱坐標(biāo)，模板中質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR的效率由標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算出，公式為E=10–1/slope–1。

2)pels基因拷貝數(shù)的測(cè)定

以含有pels基因的畢赤酵母菌株基因組DNA為模板，分別用引物F-P4/R-P4和F-P5/R-P5 (表1) 進(jìn)行熒光定量PCR。將得到的Ct值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求出 DNA樣品中GAP基因和pels基因的起始模板拷貝數(shù)。GAP基因在畢赤酵母的基因組中以單拷貝的形式存在，因此可以用GAP基因的拷貝數(shù)表征模板中基因組的起始拷貝數(shù)。pels基因起始模板拷貝數(shù)與GAP基因起始模板拷貝數(shù)的比值即為pels基因在畢赤酵母基因組中的拷貝數(shù)。

1.8　高密度發(fā)酵

將高產(chǎn)菌株接種于100 mL YPD 培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，至OD600為20左右。將種子培養(yǎng)液按10%接種量接入5 L發(fā)酵罐中，初始培養(yǎng)條件為：裝料量2 L，攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min，通氣量為4 vvm。生長(zhǎng)階段溫度為28 ℃，采用流加25%的濃氨水控制pH為5.5。當(dāng)甘油耗盡時(shí) (DO迅速上升至60%以上)，采用與溶氧偶聯(lián)方式使 DO維持在 (30±5)%并補(bǔ)加50% (V/V) 的甘油。當(dāng)OD600為300左右時(shí)，停止流加甘油，待甘油再次耗盡 (DO迅速上升至60%以上)，開始流加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并將培養(yǎng)溫度降低至25 ℃，同樣采用與溶氧偶聯(lián)方式流加。每12 h取樣測(cè)定堿性果膠酶酶活。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同表達(dá)載體對(duì)果膠酶酵母表達(dá)的影響

表達(dá)載體 pHBM905BDM 具有比 pHBM905A更好的啟動(dòng)子和信號(hào)肽，因此用pHBM905BDM載體的菌株分泌表達(dá)產(chǎn)物的能力理論上應(yīng)該更強(qiáng)。挑取了在底物平板上水解圈最小的畢赤酵母重組菌株 GS115-pHBM905A-pels和 GS115-pHBM905BDM-pels同時(shí)進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)發(fā)酵，每隔24 h取樣測(cè)定酶活。結(jié)果 (圖1) 發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)第3天時(shí)，含兩種載體的菌株所產(chǎn)的酶活同時(shí)達(dá)到最高，利用載體pHBM905A表達(dá)的堿性果膠酶酶活為68 U/mL，利用載體pHBM905BDM的酶活為100 U/mL，提高了47%。

2.2　qPCR從轉(zhuǎn)錄水平分析兩種載體的表達(dá)

由于 pHBM905BDM 表達(dá)載體具有更強(qiáng)的啟動(dòng)子和胞外分泌的信號(hào)肽，為了研究啟動(dòng)子的優(yōu)化對(duì)PEL168S的表達(dá)影響，通過qPCR來從轉(zhuǎn)錄水平上分析蛋白的表達(dá)。抽提兩種菌株GS115-pHBM905A-pels和GS115-pHBM905BDM-pels的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再進(jìn)行qPCR，根據(jù)相對(duì)定量 2–ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析。結(jié)果表明 (圖2)，利用pHBM905BDM表達(dá)的堿性果膠酶的 mRNA表達(dá)水平比用pHBM905A的提高了 27%。由于胞外表達(dá)酶活提高了47%，因此推測(cè)pHBM905BDM上的信號(hào)肽對(duì)堿性果膠酶 PEL168S的表達(dá)促進(jìn)程度比pHBM905A要高約20%。

圖1　兩種載體表達(dá)堿性果膠酶的搖瓶表達(dá)酶活Fig. 1 The comparison of enzyme activities expressed by two different vectors.

2.3　果膠底物平板篩選高拷貝菌株

由于當(dāng)pels基因利用載體 pHBM905BDM在畢赤酵母里的表達(dá)量更好，因此選用重組質(zhì)粒pHBM905BDM-pels來進(jìn)行后面的工作，該質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，將得到的轉(zhuǎn)化子點(diǎn)在果膠底物平板上，如圖 3所示，將篩選出的最大水解圈對(duì)應(yīng)菌株命名為 GS115-pHBM905BDM-pels4，經(jīng)搖瓶發(fā)酵檢測(cè)該菌株所產(chǎn)的堿性果膠酶酶活提高至536 U/mL。

圖2　兩種載體表達(dá)堿性果膠酶mRNA表達(dá)水平比較Fig. 2 The comparison of the mRNA transcription levels of alkaline pectate lyase based on the vectors pHBM905A and pHBM905BDM.

圖3　果膠底物平板篩選轉(zhuǎn)化子Fig. 3 Screening of the transformants with the activity of pectate lyase on the plate containing pectin. (A) The size of transformants as control. (B) The halo formation.C: GS115 as negative control.

2.4　G418抗性篩選高拷貝菌株

將 2.3中篩選出的高拷貝菌株 GS115-pHBM905BDM-pels4制作成感受態(tài)，導(dǎo)入經(jīng)SacⅠ線性化的重組質(zhì)粒 pPIC9K-pels，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含0.5 mg/mL G418的MD平板上，然后將長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子點(diǎn)在G418濃度逐漸提高的YPD平板上，于28 ℃培養(yǎng)5–8 d并經(jīng)常觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)狀況。最終當(dāng)G418的濃度提高至4 mg/mL，如圖4所示篩選得到一株生長(zhǎng)最好的轉(zhuǎn)化子，命名為GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1，經(jīng)搖瓶發(fā)酵檢測(cè)，該菌株所產(chǎn)堿性果膠酶酶活提高至770 U/mL。

圖4　抗生素G418篩選轉(zhuǎn)化子Fig. 4 Screening of the transformants on the plate with the antibiotics G418. (A) The initial size of transformants as control. (B) The size of transformants after 6 days. C: GS115-pHBM905BDM-pels as negative control.

2.5　qPCR檢測(cè)畢赤酵母基因組中目的基因拷貝數(shù)

將含有pels基因的畢赤酵母基因組同樣進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出pels基因在畢赤酵母基因組中的拷貝數(shù)。畢赤酵母GAP基因Ct值與起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值的回歸方程為：y=–3.5262x+42.204，PCR 效率為 1.744，pels基因Ct值與起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值的回歸方程為：y=–3.5039x+42.179，PCR效率為1.738，可以看出做出標(biāo)準(zhǔn)曲線的兩個(gè) PCR效率幾乎是一致的。由表 2里的Ct值經(jīng)計(jì)算得菌株 GS115-pHBM905BDM-pels4中pels的拷貝數(shù)為5，菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1中pels的拷貝數(shù)為7。

2.6　高密度發(fā)酵

由于菌株 GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1的表達(dá)量最高，將其進(jìn)行高密度發(fā)酵使堿性果膠酶的表達(dá)量進(jìn)一步提高。發(fā)酵誘導(dǎo)周期為120 h左右，每 12 h取樣測(cè)菌體干重和上清酶活，結(jié)果如圖 5所示。當(dāng)誘導(dǎo)到 96 h時(shí)，酶活達(dá)到最大值2271 U/mL，約為搖瓶發(fā)酵所得堿性果膠酶酶活的 3倍，但是未達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)。同時(shí)用SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)期間每12 h取得的上清液，發(fā)現(xiàn)108 h時(shí)的樣品目的條帶變小了，推測(cè)目的蛋白可能被降解。為了分析發(fā)生降解的原因，通過網(wǎng)站 (https://prosper.erc.monash.edu.au/) 預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)該堿性果膠酶的氨基酸序列中存在畢赤酵母GS115的內(nèi)源蛋白酶Prb1的酶切位點(diǎn)。另外由圖 6第 5、6泳道可以看出誘導(dǎo) 96 h和108 h的樣品多出一條帶，且濃度呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，將該蛋白帶 (黑框表示) 進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)是醇氧化酶AOX1，由于AOX1是胞內(nèi)酶，說明在誘導(dǎo)過程中酵母細(xì)胞出現(xiàn)死亡裂解的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致內(nèi)源蛋白酶的釋放降解了部分目的蛋白，酶活未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

表2　qPCR測(cè)定目的基因拷貝數(shù)的Ct值和拷貝數(shù)Table 2 The Ct values and copy numbers of two strains measured through qPCR

圖5　高表達(dá)果膠酶畢赤酵母的高密度發(fā)酵Fig. 5 High-density fermentation of P. pastoris with high yield pectate lyase.

圖6　SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)酵上清Fig. 6 SDS-PAGE measurement of fermentation supernatant. 1: 48 h; 2: 60 h; 3: 72 h; 4: 84 h; 5: 96 h; 6:108 h; M: marker.

3　討論

本研究構(gòu)建了重組質(zhì)粒pHBM905A-pels和pHBM905BDM-pels，其中pHBM905BDM-pels具有更強(qiáng)的啟動(dòng)子與信號(hào)肽，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 pHBM905BDM分泌表達(dá)目的蛋白的能力的確更強(qiáng)，因此選用該載體表達(dá)目的基因。然后利用HIS4選擇標(biāo)記，將pHBM905BDM-pels電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，并通過果膠底物平板功能性篩選得到整合了多拷貝果膠酶基因pels的菌株。在此基礎(chǔ)上，將pPIC9K-pels電轉(zhuǎn)化上述菌株制備的感受態(tài)細(xì)胞，利用G418篩選和搖瓶發(fā)酵成功得到了產(chǎn)量進(jìn)一步提高的高產(chǎn)菌株。本研究的結(jié)果證實(shí)了利用HIS4營養(yǎng)缺陷型和G418抗性的雙選法篩選堿性果膠酶高產(chǎn)工程菌是可行的，利用這個(gè)策略，果膠酶的產(chǎn)量從68 U/mL提高至770 U/mL，提高了10倍多，為定向獲得多拷貝整合的酵母高產(chǎn)菌株提供了新的思路。

近十幾年來，來源于歐文氏菌Erwinia[18]、放線菌Actinomycetes[9]和芽孢桿菌Bacillus[19]等的堿性果膠酶基因已通過基因工程技術(shù)得到了表達(dá)，這些表達(dá)主要以E.coli為表達(dá)宿主，IPTG作為誘導(dǎo)劑，表達(dá)產(chǎn)量較低且大多屬于內(nèi)分泌型，考慮到IPTG和破菌的成本，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。本研究采用的是真核表達(dá)系統(tǒng)——巴斯德畢赤酵母，除了具有細(xì)胞生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)、遺傳操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)外，還可以對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工、修飾和分泌等。畢赤酵母已基本成為較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)勢(shì)有：含有特有的醇氧化酶啟動(dòng)子，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)；易于高密度發(fā)酵，以更廉價(jià)的甲醇代替IPTG作為誘導(dǎo)物，生產(chǎn)成本較低，細(xì)胞干重可以很快達(dá)到很高的濃度 (120 g/L以上)，利于工業(yè)化生產(chǎn)；外源基因通過整合型質(zhì)粒整合于畢赤酵母染色體基因組上，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；能使產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化，自身分泌的蛋白質(zhì)非常少，便于產(chǎn)物純化[20]。畢赤酵母已廣泛作為宿主菌株成功表達(dá)了很多外源重組蛋白，例如應(yīng)用于工業(yè)上的木聚糖酶 (178 mg/L)[21]、纖維素酶(65 mg/L)[22]、脂肪酶 (630 mg/L)[23]和植酸酶(63 mg/L)[24]等；用畢赤酵母生產(chǎn)用于生物醫(yī)藥上的蛋白時(shí)，所產(chǎn)的蛋白效價(jià)高且沒有細(xì)菌內(nèi)毒素或潛在的病毒污染，例如可用于生產(chǎn)胰島素前體 (1.5 g/L)[25]、人血清白蛋白 (6 g/L)[26]和腫瘤壞死因子 (10 g/L)[27]等，通過不斷優(yōu)化表達(dá)載體上的信號(hào)肽和啟動(dòng)子，外源蛋白的表達(dá)量可進(jìn)一步提高[28]。

然而，在畢赤酵母里表達(dá)的堿性果膠酶并不多，且表達(dá)量也較低。最早表達(dá)的是來源于真核生物腐皮鐮孢霉Fusarium solanif. sp.pisi[29]中的pelB和pelC，近幾年研究較多的是來源于Bacillus subtilisWSHB04-02的堿性果膠酶在GS115中的表達(dá)[30]，并經(jīng)過一系列發(fā)酵優(yōu)化策略，例如調(diào)節(jié)甲醇和菌體濃度比率[31]、表達(dá)階段采用低溫[32]、在菌體生長(zhǎng)階段采用甘油指數(shù)流加、在誘導(dǎo)階段采用甲醇分階段流加和山梨醇與甲醇混合添加誘導(dǎo)[15]等方法，使得PGL的產(chǎn)量最高為1593 U/mL。本研究中篩選得到的堿性果膠酶高產(chǎn)菌株在 5 L發(fā)酵罐中的表達(dá)水平達(dá)到了2271 U/mL，雖然未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，但已經(jīng)是目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高表達(dá)水平。P. pastoris在以甲醇作為唯一碳源和能源表達(dá)外源目的蛋白時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)與蛋白表達(dá)一直存在著激烈的競(jìng)爭(zhēng)，共同爭(zhēng)奪碳源和能源，也導(dǎo)致外源蛋白表達(dá)效率降低。雖然有報(bào)道堿性果膠酶PL在大腸桿菌BL21(DE3) 中分泌表達(dá)[33]，用IPTG誘導(dǎo)的發(fā)酵上清酶活可達(dá)到4507 U/mL。但考慮到畢赤酵母表達(dá)所用誘導(dǎo)劑的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 IPTG，且相比于大腸桿菌其自身分泌蛋白更少，產(chǎn)物方便純化，通過一系列發(fā)酵策略的優(yōu)化[34]，有望進(jìn)一步提高該菌株的發(fā)酵產(chǎn)量，使其更加具有應(yīng)用于紡織行業(yè)的潛力。

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