林春麗 張海波 陳紅霞 侯春燕 云雨生/內(nèi)蒙古維克生生物科技有限公司

牛腹瀉病毒的PCR檢測方法

林春麗 張海波 陳紅霞 侯春燕 云雨生/內(nèi)蒙古維克生生物科技有限公司

本研究是通過PCR技術(shù)對新生牛是否帶有牛病毒性腹瀉病毒進(jìn)行檢驗(yàn)，排除其患病牛，制備無病毒血清，進(jìn)一步用于獸藥的研制。

一、材料與方法

（一）材料

1.主要試劑。RNAiso plus購自Takara公司；氯仿、無水乙醇、75%酒精，DEPC水、ddH2O、DNA Marker購自TakaRa公司；核酸染料購自百泰克有限公司；高速低溫離心機(jī)購自Sigma公司；PCR擴(kuò)增儀為美國伯樂公司，型號為S1000；凝膠成像儀。

2.樣品。共30個(gè)樣本包括：28個(gè)未知樣本均為新生牛初血清；空白對照；陰性對照和陽性對照。

（二）方法

1.PCR檢測。PCR技術(shù)，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由Saiki發(fā)明，其技術(shù)對世界生物醫(yī)學(xué)的巨大推動作用，獲得了1992年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。由美國PE-Cetus公司的Kary Banks Mulis在1985年建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

二、操作步驟。

（一）樣品提取前準(zhǔn)備

1.器材準(zhǔn)備。1 000μl槍，200μl槍，50μl槍、1 000μl槍頭，200μl槍頭，75%酒精棉，止血鉗，EP管，EP管架等。

2.提取步驟。

（1）取2 ml無菌無酶EP管，加入RNA Siso Plus（裂解液）900μL（加液過程中如槍頭接觸到EP管壁或其他物品，需更換槍頭），再分別吸取待測血清樣品、陽性對照、陰性對照各200μL于EP管中，每加一次樣品換一次槍頭。輕輕上下顛倒搖勻，至底部無沉淀，顏色均一，冰盒中靜置5min。將已檢測樣品放回-20℃冷凍保存。（陰性對照放在中間順序）

（2）12 000 r/min、4℃，離心1 min。加入200μL的氯仿，上下顛倒20次混勻，至顏色均一為乳粉色，冰盒中靜置8 min。

（3）12 000 r/min、4℃、離心15 min。在離心剩余2 min時(shí)準(zhǔn)備新1.5 ml無菌無酶EP管，加入800μl-20℃預(yù)冷的異丙醇。從離心機(jī)輕拿輕放取出EP管。（離心后液體分為三層，底層為有機(jī)溶液層，中層蛋白質(zhì)，上層上清液含RNA）。吸取400μl上清液（分兩次200μl吸取，吸取上層液體時(shí)切勿碰觸或吸取中層蛋白質(zhì)），放入事先加好異丙醇的新1.5 ml EP管中，輕輕上下顛倒20次搖勻，-20℃靜置20 min。

（4）12 000 r/min、4℃、離心15 min。離心機(jī)中EP管擺放方向保持一致，以使沉淀在管底同一側(cè)。若離心后不出沉淀繼續(xù)-20℃放置10～20 min后離心。棄上清，保留沉淀。沉淀即為RNA提取物，量很少，在倒上清液時(shí)注意，切勿將沉淀倒出。

（5）加入1 ml 75%乙醇（DEPC水配制，加乙醇過程中如槍頭接觸到EP管壁或其他物品，需更換槍頭），輕輕上下顛倒，洗滌沉淀，將沉淀懸浮起來即可。

（6）7 500 r/min、4℃、離心5 min。棄上清，保留沉淀。用200μl槍頭將管底殘余乙醇液體吸凈，吸取一個(gè)樣品換一個(gè)槍頭，注意不要碰觸和吸取到RNA沉淀。

（7）EP管中的RNA在超凈工作臺中室溫下自然干燥10 min。加入20μL的無RNase水（將水加到沉淀上），輕彈溶解沉淀，短期使用-20℃保存，長期使用保存于-70℃下。

（二）引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primeier 5.0設(shè)計(jì)BVDV特異性引物如下。

gB1、gB2引物

FR oe rv we引ar s物red名 PP稱rrii m meerr 5 5''--TG AG CT GA AC CG核TT CC苷GT TC酸TC CA序GA CG列GC CT TG CC TC CC --33’’

gE1、gE2引物：

FR oe rv we引ras物red名 PP稱rrii m meerr 5 5''--CGTCTTTTGCTG核CGG苷TCCC酸GCAG序CA T列CT GG GA T GT CCTGT --33’’

PCR操作程序

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PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)定

注：按照上述表格所示，反應(yīng)體系配制在冰盒上進(jìn)行，設(shè)定好反應(yīng)程序后，將裝有上述體系液體PCR反應(yīng)管，包括對照管（空白PCR體系管和水樣PCR體系管）放入Smart CycLer System中按照表格中參數(shù)設(shè)定PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。

圖1 PCR儀

（三）電泳分析

1.制膠。稱取1.35 g瓊脂糖粉放入錐形瓶中（注：倒入過程中避免瓊脂糖粉末粘在錐形瓶壁上。）加入90 ml 1*TBE溶液，微波爐加熱無絮狀物至完全溶解（注：至少沸騰3次），取出錐形瓶后，冷卻至60℃左右，加入17μL的核酸染料，搖至徹底混勻后倒入帶有梳子的膠槽中（輕輕混勻即可，避免氣泡產(chǎn)生），冷卻凝固40 min。

2.電泳。

（1）將制好的膠放入電泳槽中，倒入1*TBE，液位高于膠面2 mm。

（2）用移液槍取20μl 6×Loading Buffer于載玻片上，并取3μl加至PCR產(chǎn)物管中反復(fù)吹打三次混勻后吸取10μl混合液加入瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，從左面第二個(gè)孔開始依次點(diǎn)樣品、陰性對照與陽性對照，最后取7μl marker點(diǎn)于第一個(gè)孔中。

（3）將電泳儀正負(fù)極對應(yīng)連接，開啟電泳儀電源開關(guān)，在120V電壓下電泳50 min。將跑完的瓊脂糖凝膠從電泳槽取出，放在凝膠成像儀中，進(jìn)行觀察。

三、結(jié)果判定

圖2 未感染與感染樣本對照

如圖2，12號為陰性對照，無明亮的；24號為陽性對照，出現(xiàn)明亮的條帶，證明實(shí)驗(yàn)成立。剩余樣本在316 bp處，8號、9號、10號、11號、20號、21號、23號出現(xiàn)明亮的條帶，說明該樣本血清樣本染牛腹瀉病毒。

四、影響PCR檢測因素

（一）dNTP的質(zhì)量與濃度

1.dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系。dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200 umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會引起錯(cuò)配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

2.Mg2+濃度。Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200 umol/L 時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0 mmol/L 為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

3.溫度與時(shí)間的設(shè)置?；赑CR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90℃～95℃變性，再迅速冷卻至40℃～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70℃～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300 bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

4.循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

（二）影響PCR特異性的因素

通過上述內(nèi)容，可以看出有許多因素可以影響PCR的特異性。

1.退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。

2.減短退火時(shí)間及延伸時(shí)間可以減少錯(cuò)誤引發(fā)及錯(cuò)誤延伸。

3.引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯(cuò)誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化.

4.改變MgCl2濃度可以改進(jìn)特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對Taq酶的直接作用。

一般認(rèn)為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48 h以內(nèi)完成電泳檢測，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48 h后帶型就會出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。

（略）