王志國(guó)/遼寧省北鎮(zhèn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

禽流感病毒（H9亞型）LN株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

王志國(guó)/遼寧省北鎮(zhèn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

禽流行性感冒(簡(jiǎn)稱禽流感，Avain Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一種禽類(lèi)(包括家禽和野禽)的感染疾病綜合征，主要引起禽類(lèi)的全身性或呼吸系統(tǒng)性疾病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織確立為A類(lèi)傳染病。根據(jù)禽流感致病性的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無(wú)致病性禽流感。H9N2亞型禽流感屬于低致病性禽流感，發(fā)病率高，但死亡率低。

2010年，筆者于遼寧某市某養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病雞群中分離到一株禽流感病毒，經(jīng)鑒定為H9N2亞型禽流感，命名為L(zhǎng)N株，其具有經(jīng)胰酶處理后能在細(xì)胞上增殖的特性。為了評(píng)價(jià)MDCK細(xì)胞高適應(yīng)的禽流感疫苗株LN的生物學(xué)特性和免疫效果，我們進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)研究。

一、試驗(yàn)方法

（一）病毒的分離

2010年，從遼寧省某養(yǎng)雞地區(qū)的疑似H9N2禽流感發(fā)病雞群中，無(wú)菌采取具有典型臨床癥狀病雞的肺臟和肝臟等剪碎，按1∶5（W/V）加入滅菌生理鹽水后，研缽研磨后-40℃到室溫凍融3次，經(jīng)3 000 r/min離心15 min取上清液備用。

將上述病料上清液通過(guò)0.22μm微孔濾器除菌，尿囊腔接種10日齡非免疫雞胚。每份病料接種8枚雞胚，每枚雞胚接種0.2 ml，同時(shí)作不接種對(duì)照，37℃孵育。棄去24 h內(nèi)死胚，無(wú)菌收集48 h的雞胚尿囊液，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

病毒分離后需要在SPF雞胚上進(jìn)行3次終點(diǎn)有限稀釋克隆純化，即每一次均取最高稀釋度有血凝價(jià)雞胚尿囊液作為下一次傳代純化的種毒，如此經(jīng)三次純化后，以10-3稀釋接種9～11日齡SPF胚，48小時(shí)后收取雞胚尿囊液，經(jīng)菌檢證明無(wú)污染，分裝于小管中作為種毒貯存于-70℃。

（二）血清學(xué)及RT-PCR鑒定

將無(wú)菌收集的雞胚尿囊液以1.0%雞紅細(xì)胞懸液采用β微量法進(jìn)行HA試驗(yàn)，以HA價(jià)≥3 log2為試驗(yàn)陽(yáng)性。對(duì)有直接血凝性的樣本進(jìn)行H9亞型AIV HI（血凝抑制試驗(yàn)）與NI（神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)）。

根據(jù)GenBank已發(fā)表的H9N2毒株的HA基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)H9N2 HA基因的特異性引物，用于HA基因部分序列的擴(kuò)增。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為753 bp。引物的序列如下：上游引物(18個(gè)堿基)：5′-AATGGTCCTACATCGTCG-3′；下游引物(18個(gè)堿基)：5′-TGGCTCCAAATAGTCCTC-3′，以上引物由上海生物工程有限公司合成。

（三）分離毒在MDCK細(xì)胞中的增殖

將純化的組織毒，用滅菌生理鹽水稀釋后，接種90%長(zhǎng)成單層后的MDCK細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48～72 h，病變達(dá)75%以上放入-70℃中反復(fù)凍融3次，收獲病毒液。傳代10次，直至病毒在MDCK細(xì)胞增值良好。

（四）分離病毒LN株致病性的測(cè)定

通過(guò)雞胚半數(shù)感染量(EID50)、半數(shù)組織感染量(TCID50)和靜脈接種指數(shù)(IVPI)試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)分離病毒LN株的致病性，試驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞毒和胚毒進(jìn)行了同步試驗(yàn)，以比較不同培養(yǎng)方式繁殖的病毒液在毒力方面的差異，試驗(yàn)方法如下。

1.病毒EID50測(cè)定。

將分離病毒用滅菌生理鹽水作10-1～10-9稀釋，并設(shè)立空白對(duì)照組，每個(gè)稀釋度接種5枚10日齡非免疫雞胚，棄24 h死亡胚，于接種后72 h 4℃過(guò)夜凍死雞胚，收獲雞胚尿囊液，測(cè)定其HA效價(jià)，并參考Reed-Muench方法計(jì)算出病毒EID50。

根據(jù)EID50結(jié)果，將LN株以l×107EID50劑量接種0.lml/胚，35℃溫箱孵育，詳細(xì)記錄雞胚死亡情況，以評(píng)定分離病毒LN株對(duì)雞胚的致病性。

2.病毒TCID50測(cè)定。

（1）將狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞以2～3×105個(gè)/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37 C，6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～24 h。

（2）用超純水配制的無(wú)菌PBS(pH7.2)將病毒液進(jìn)行10倍梯度稀釋，設(shè)置10-3～10-108個(gè)稀釋梯度。

（3）棄去培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS洗滌已培養(yǎng)成單層的MDCK細(xì)胞三遍，以去除培養(yǎng)基中的血清成分，避免血清對(duì)病毒吸附的影響。

（4）將每個(gè)稀釋度的病毒接種于MDCK細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8孔，100μL/孔，37℃吸附1h左右。

（5）棄去吸附液，用滅菌PBS洗滌MDCK細(xì)胞一遍，加入含終濃度2μg/ml的TPCK-trypsin的細(xì)胞維持液(無(wú)抗無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基置35℃，6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔12 h觀察1次。

（6）待到細(xì)胞病變(CPE)和HA效價(jià)不再發(fā)生變化時(shí)，用Reed-Muench公式計(jì)算TCID50。

3.靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)的測(cè)定。取6周齡非免疫雞8只，按中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法測(cè)定IVPI。引起禽流感的A型流感病毒對(duì)6周齡雞的靜脈致病指數(shù)(IVPI)大于1.2或感染的A型流感病毒H5或H7亞型的核苷酸序列在血凝素的裂解位點(diǎn)上有多個(gè)堿性氨基酸，即確定為高致病性禽流感病毒。

（五）禽流感H9N2亞型LN株免疫保護(hù)試驗(yàn)

為了排除免疫抗原量對(duì)免疫效果的影響，根據(jù)試驗(yàn)中測(cè)得的數(shù)據(jù)，通過(guò)用空白尿囊液稀釋的方法，將經(jīng)MDCK細(xì)胞和雞胚擴(kuò)增的兩種病毒液調(diào)整為具有相同HA效價(jià)、EID50和TCID50的三組病毒液，并分別制備成油乳劑滅活苗，各組免疫相同的劑量后，觀察免疫及保護(hù)效果。

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組。

NC/NE—表示未經(jīng)稀釋的原始細(xì)胞毒和胚毒制備疫苗免疫組。

HC/HE—表示經(jīng)稀釋得到的具有相同HA效價(jià)的細(xì)胞毒和胚毒制備疫苗免疫組。

EC/EE—表示經(jīng)稀釋得到的具有相同EID50的細(xì)胞毒和胚毒制備疫苗免疫組。

TC/TE—表示經(jīng)稀釋得到的具有相同TCID50的細(xì)胞毒和胚毒制備疫苗免疫組。

每組14只SPF雞，同時(shí)留5只不免疫作為攻毒對(duì)照組。

2.免疫及攻毒。所有試驗(yàn)SPF雞于負(fù)壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)至4周齡進(jìn)行免疫，免疫前采血，HI抗體檢測(cè)均為陰性。滅活疫苗按每只0.3 ml的劑量經(jīng)胸部肌肉接種免疫。首免后第7、14、21天采血，用商品化標(biāo)準(zhǔn)抗原檢測(cè)抗體效價(jià)。免疫后4周4周后，用分離病毒LN株尿囊液做攻毒試驗(yàn)。攻毒劑量均為105.0EID50，每只雞100μL。毒后的第3，5，7天分別采取咽喉和泄殖腔拭子，進(jìn)行病毒分離檢測(cè)，取處理后的樣本上清以尿囊腔途徑接種SPF雞胚，收集死亡雞胚的尿囊液進(jìn)行HA效價(jià)檢測(cè)，當(dāng)HA效價(jià)達(dá)4 1og2以上時(shí)，確定病毒分離為陽(yáng)性。

二、結(jié)果

（一）病毒分離

病料經(jīng)過(guò)4代雞胚培養(yǎng)后，HA血凝價(jià)逐漸穩(wěn)定，雞胚死亡數(shù)開(kāi)始增長(zhǎng)，胚體病變逐漸明顯。種毒經(jīng)適當(dāng)稀釋后，接種SPF雞胚尿囊腔，收集接種后48～72 h雞胚的尿囊液，經(jīng)離心純化后，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）HI及NI試驗(yàn)結(jié)果

取病毒分離為陽(yáng)性的尿囊液，用ND、IB、IBD及EDS-76抗血清進(jìn)行HI試驗(yàn)，不產(chǎn)生抑制現(xiàn)象，表明分離株并非上述病毒株，結(jié)果只能被H9 AIV陽(yáng)性血清所抑制。神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)檢測(cè)，該病毒只能被N2亞型陽(yáng)性血清特異性抑制，因此，鑒定結(jié)果為H9N2亞型禽流感病毒，并命名為A/Chicken/Jilin/LN（縮寫(xiě)為L(zhǎng)N）。

用H9N2 AIV HA基因的特異性引物對(duì)該毒株的雞胚尿囊液進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，也得到753 bp的目的基因片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 吉林市分離株HA基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

（三）分離病毒LN的致病性測(cè)定

分離病毒LN株接種10只10日齡SPF雞胚后，24 h內(nèi)無(wú)雞胚死亡。在36～96 h孵育期間致死4枚雞胚，死亡率40%。

表1 分離病毒LN株致病性測(cè)定

（四）禽流感H9N2亞型LN株免疫保護(hù)試驗(yàn)

在本試驗(yàn)中，我們將分離病毒LN株油乳劑滅活疫苗免疫SPF雞，并排除了免疫時(shí)抗原量對(duì)各組免疫保護(hù)效果的影響，在免疫后1周雞群就可檢測(cè)到低水平的HI抗體水平，免疫后2周免疫組所有雞群都產(chǎn)生明顯的抗體，平均HI抗體水平達(dá)6 1og2，免疫后3周各試驗(yàn)組的HI抗體水平達(dá)到高峰，平均效價(jià)達(dá)7 1og2以上（見(jiàn)表2），表明分離病毒LN株作為疫苗株具有良好的免疫原性，免疫動(dòng)物以后能產(chǎn)生較高的抗體水平，且從抗體檢測(cè)結(jié)果可以看出在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清免疫組的抗體水平均要比尿囊液免疫組高，抗體水平上升也較快。

表2 不同試驗(yàn)組在免疫后不同時(shí)間的抗體水平

三、結(jié)論

成功從遼寧省發(fā)病雞中分離到了一株H9亞型禽流感病毒，并通過(guò)SPF雞致病性、EID50和IVPI等的測(cè)定確定分離到的毒株為低致病性禽流感病毒。

對(duì)分離到的H9亞型禽流感毒株的NA亞型進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)分離到得H9亞型禽流感屬于H9N2亞型。

該毒株對(duì)MDCK細(xì)胞高度適應(yīng)。經(jīng)免疫保護(hù)試驗(yàn)證明，細(xì)胞毒與胚毒制備的疫苗相比具有產(chǎn)生抗體效價(jià)高，抗體上升水平快等優(yōu)點(diǎn)。