李 穎，華 巖，于 翔

(山海關(guān)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，秦皇島 066200)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥。在長期高血糖、高血脂和高血壓的刺激下，腎小球微循環(huán)系統(tǒng)的微循環(huán)濾過壓會異常增高，這導(dǎo)致DN發(fā)生和不斷發(fā)展[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以通過旁分泌途徑分泌細(xì)胞因子、生長因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子等生物活性物質(zhì)，具有抗凋亡、損傷修復(fù)、促再生和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等多種綜合性作用[2]。有研究表明干細(xì)胞條件培養(yǎng)基具有促血管生成和調(diào)節(jié)神經(jīng)功能的作用[3]。我們利用MSCs主要通過旁分泌的特點(diǎn)來提取和制作MSCs條件培養(yǎng)基，以研究其對DN的治療和修復(fù)作用； 同時結(jié)合Alzet微量滲透泵可長效緩慢進(jìn)行釋放的特點(diǎn)，對DN大鼠模型進(jìn)行治療，觀察其對DN大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

SD大鼠骨髓MSCs 和MSCs專用培養(yǎng)基采購自賽業(yè)生物科技有限公司(美國)，達(dá)爾伯克改良伊格爾(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基和胰酶采購自HyClone公司，鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購自Sigma公司。2ML2微量滲透泵購自美國ALZET公司。

1.2 MSCs條件培養(yǎng)基的制備

SD大鼠骨髓MSCs用MSCs專用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，約2 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液傳代，第3代MSCs在細(xì)胞培養(yǎng)融合度達(dá)到約90%時棄掉原培養(yǎng)基，更換為DMEM無血清培養(yǎng)基。在孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后收集上清液即為MSCs條件培養(yǎng)基。吸取上層條件培養(yǎng)基2 ml于Alzet微量滲透泵中即為MSCs條件培養(yǎng)基Alzet微量滲透泵。

1.3 分組和方法

30只清潔級SD 雄性大鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司]，體質(zhì)量(200±10)g，隨機(jī)分為3組：正常組，DN模型組和MSCs條件培養(yǎng)基組，每組10只。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)；DN模型組大鼠每天給予高脂高糖飼料(在普通飼料的基礎(chǔ)上加上10%蔗糖、5%奶粉、20%豬油)；MSCs條件培養(yǎng)基組是對造模成功的DN大鼠植入Alzet微量滲透泵。

DN模型大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，腹腔一次性注射STZ(35 mg/kg)，配制方法：將STZ溶解于新鮮配制的0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液中，溶液濃度為1%，pH值維持在4.2。1周后檢測相關(guān)指標(biāo)，將非禁食血糖≥16.7 mmol/L和尿蛋白≥30 mg/24 h 作為判斷2型DN大鼠模型是否成功的標(biāo)準(zhǔn)[4]。

Alzet微量滲透泵植入方法：2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取大鼠仰臥位，去毛備皮，聚維硐碘(碘伏)消毒，在腹部做1個1.5 cm深的縱切口，植入內(nèi)置MSCs條件培養(yǎng)基的Alzet微量滲透泵，逐層縫合，術(shù)中嚴(yán)格無菌操作。

1.4 檢測指標(biāo)

處死大鼠前行眶靜脈采血，全自動生化分析儀檢測血糖、甘油三酯、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)等生化指標(biāo)，電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測血清胰島素水平。處死大鼠前用代謝籠收集大鼠24 h尿液，全自動生化分析儀檢測24 h尿蛋白。處死大鼠后取一部分腎組織用10%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、包埋，切片，制作2 μm 厚度的石蠟切片行過碘酸雪夫氏(periodic acid-Schiff，PAS)染色，觀察大鼠腎臟病理形態(tài)變化情況，然后對腎臟組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行定量分析，同時計(jì)算平均腎小球系膜截面積和平均腎小球體積。再取一部分腎臟組織于-80℃冰箱中保存，用于做Western印跡檢測。

1.5 Western印跡檢測

取適量大鼠腎組織，經(jīng)裂解液對組織進(jìn)行處理，考馬斯亮藍(lán)法測蛋白濃度，然后等濃度加入上樣緩沖液，100℃沸水變性5 min。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過夜及二抗孵育，通過化學(xué)發(fā)光及圖像分析，測定nephrin蛋白的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠檢測指標(biāo)的比較

與正常組大鼠相比，DN模型組的血糖、血清胰島素、甘油三酯、24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮均顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DN模型組大鼠相比，MSCs條件培養(yǎng)基組的血糖、血清胰島素、24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；表1)。

2.2 各組大鼠病理結(jié)果

正常組大鼠腎小球、腎小管及腎間質(zhì)無明顯改變；DN模型組大鼠可見腎小球體積增大，系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞可有水腫；MSCs條件培養(yǎng)基組大鼠腎損害較DN模型組有所減輕(圖1)。在顯微鏡下進(jìn)行腎小球系膜截面積與腎小球體積定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組大鼠相比，DN模型組的腎小球系膜截面積與腎小球體積均顯著增加(P<0.05)；而與DN模型組相比，MSCs條件培養(yǎng)基組大鼠的腎小球系膜截面積與腎小球體積均顯著減小(P<0.05；表2)。

2.3 Western印跡結(jié)果

與正常組大鼠相比，MSCs條件培養(yǎng)基組大鼠nephrin蛋白的表達(dá)情況顯著降低(P<0.05)，但與DN模型組相比顯著增加(P<0.05；圖2)。

表1 各組大鼠檢測指標(biāo)的比較

DN: diabetic nephropathy; MSCs: mesenchymal stem cells; Scr: serum creatinine; BUN: blood urea nitrogen. Compared with normal control group,*P<0.05; compared with DN group,#P<0.05

圖1 各組大鼠病理變化

Index NormalcontrolgroupDNgroupMSCsgroupGlomerularmesangialarea(μm2×103)4.49±0.187.49±0.30*5.23±0.25#Glomerularvolume(μm3×105)5.52±0.138.06±0.25*6.89±0.18#

DN: diabetic nephropathy; MSCs: mesenchymal stem cells. Compared with normal control group,*P<0.05; compared with DN group,#P<0.05

圖2 各組大鼠nephrin蛋白表達(dá)情況

3 討 論

近年來，干細(xì)胞治療糖尿病的相關(guān)研究引起了人們的注意，MSCs可以通過旁分泌等方式分泌各種生長因子及細(xì)胞因子，通過調(diào)控免疫的途徑來實(shí)現(xiàn)對損傷的修復(fù)治療[5]。然而直接應(yīng)用MSCs(如通過注射移植)的方式也存在一些問題，如大鼠尾靜脈注射后歸巢率低、病理環(huán)境下使用時增加感染等問題[6]。我們利用MSCs通過旁分泌機(jī)制實(shí)現(xiàn)治療損傷的特性，制備MSCs條件培養(yǎng)基，以觀察其對于DN的治療作用。MSCs不僅通過旁分泌分泌細(xì)胞因子，而且其條件培養(yǎng)基中的因子可以趨化性的到達(dá)損傷部位，使損傷部位細(xì)胞增殖、凋亡減輕，這些都是MSCs條件培養(yǎng)基治療作用的一些特點(diǎn)[7,8]。

MSCs條件培養(yǎng)基治療損傷有許多優(yōu)點(diǎn)，但如何能長期穩(wěn)定釋放連續(xù)治療DN是目前存在的問題。如果一次性腹腔注射，隨著吸收及時效的延長會影響治療作用的發(fā)揮。我們利用微量滲透泵長效緩慢釋放的特點(diǎn)，通過無菌手術(shù)植入實(shí)驗(yàn)動物皮下或腹腔內(nèi)，從而使藥物持續(xù)穩(wěn)定地釋放[9]。本研究采用Alzet 2ML2型微量滲透泵，可裝入2 ml的條件培養(yǎng)基，并且以恒定速度(5μl/h)向外輸出，持續(xù)時間長達(dá)2周。該途徑給藥能夠起到持續(xù)、恒定、穩(wěn)定的作用，減少藥物濃度波動對實(shí)驗(yàn)的影響[10,11]。

本研究結(jié)果表明MSCs條件培養(yǎng)基緩慢釋放的確能降低DN大鼠的血糖及胰島素釋放水平，降低血肌酐和血尿素氮，同時減少24 h尿蛋白量，進(jìn)而改善腎功能，然而甘油三酯的變化不太明顯，可能是由于實(shí)驗(yàn)時間等因素的影響。病理結(jié)果也顯示MSCs條件培養(yǎng)基治療后能降低系膜截面積和腎小球體積，提示MSCs條件培養(yǎng)基能夠減輕系膜增生和系膜基質(zhì)聚集[12,13]。

Western印跡監(jiān)測結(jié)果顯示，與正常組大鼠相比，MSCs條件培養(yǎng)基組大鼠nephrin蛋白的表達(dá)情況顯著降低(P<0.05)，但與DN模型組相比顯著增加(P<0.05)，表明MSCs條件培養(yǎng)基能減輕一些nephrin的損傷，這一結(jié)果與24 h尿蛋白定量的結(jié)果也比較符合。以上結(jié)果進(jìn)一步證明MSCs條件培養(yǎng)基緩慢釋放對DN有治療修復(fù)作用。

綜上所述，MSCs條件培養(yǎng)基對DN損傷具有治療作用，可避免移植細(xì)胞帶來的不良反應(yīng)；Alzet微量滲透泵持續(xù)緩慢釋放的特性為MSCs在DN的應(yīng)用方面提供了新的思路。

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