楊 健，肖海波 （上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院心胸外科，上海200092）

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

非小細(xì)胞肺癌組織中USP22調(diào)控COX?2的研究

楊 健，肖海波 （上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院心胸外科，上海200092）

組蛋白的泛素水解酶泛素特異性蛋白酶 22（USP22）是一種表觀遺傳修飾劑，在許多腫瘤中作為致癌基因而上調(diào)．USP22在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中異常表達(dá)往往預(yù)示著患者生存率低下．人類USP22基因作為致癌基因，其調(diào)控底物研究較少，在癌癥中作用機(jī)制尚不清楚．本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶?2（COX?2）作為USP22直接調(diào)控底物，其在細(xì)胞中的表達(dá)水平由USP22介導(dǎo)的去泛素化調(diào)控．USP22沉默下調(diào)COX?2表達(dá)水平，減少其半衰期，并通過泛素化狀態(tài)的調(diào)控調(diào)節(jié)COX?2的穩(wěn)定性與活力，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖．結(jié)果表明USP22可能通過對COX?2的活性和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)在癌癥發(fā)生發(fā)展中起作用．

USP22；COX?2；NSCLC；去泛素化

0 引言

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，世界上，每年有超過100萬人死于肺癌［1］，非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的80%～90%［2］．目前肺癌的治療方法包括手術(shù)切除、鉑類化療、單一放療或聯(lián)合治療．然而，肺癌治療及預(yù)后較差，總的5年生存率約14%［3］．盡管肺癌在診斷及治療方面取得重大進(jìn)展，但是其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)仍然不斷上升［1］．

USP22（ubiquitin?specific protease 22）是一種泛素水解酶，促進(jìn)組蛋白H2A和H2B去泛素化，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用［4］．USP22與Myc的靶基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并啟動(dòng)這些基因轉(zhuǎn)錄，降低USP22表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞停滯于G1期［5］．USP22高表達(dá)與癌癥遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和生存率低下有關(guān)［6］，并且在 NSCLC、膀胱癌、宮頸癌等疾病中預(yù)示預(yù)后不良［4，7］．USP22在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)對于預(yù)測惡性腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和對化療藥物的抵抗將會(huì)有很大作用，因此，它被認(rèn)為是癌癥的生物標(biāo)記物與治療靶點(diǎn)［8］．

COX是花生四烯酸合成前列腺素（prostaglan?dins，PGs）和血栓素的關(guān)鍵酶，其存在兩種不同亞型的同工酶，環(huán)氧合酶?1（cyclooxygenase?1，COX?1）和環(huán)氧合酶?2（cyclooxygenase?2，COX?2）［9］．前列腺素E2（prostaglandinE2，PGE2）是主要的前列腺素類，通過G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用，與腫瘤生長、免疫抑制和血管生成等有關(guān)［10－11］．COX?2在一些腫瘤中過度表達(dá)，并且在非小細(xì)胞肺癌中預(yù)示著生存率低下［12－13］，其表達(dá)水平通過泛素／蛋白酶體途徑所調(diào)控［14－16］．然而，泛素介導(dǎo)的COX?2表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚．

本研究發(fā)現(xiàn)COX?2作為USP22直接調(diào)控底物，其在細(xì)胞中的表達(dá)水平由USP22介導(dǎo)的去泛素化所調(diào)控．結(jié)果表明USP22可能通過對COX?2的活性和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)而在癌癥發(fā)生發(fā)展中起作用．

1 材料和方法

1．1 目的質(zhì)粒和蛋白質(zhì)的制取pCMV6?XL5質(zhì)粒載體上USP22基因的cDNA獲自于OrigeneTechnolo?gies公司，以此為模板構(gòu)建pcDNA3?USP22重組質(zhì)粒．通過改變SiRNA序列每個(gè)密碼子的第三個(gè)堿基，構(gòu)建pcDNA3?USP22?R質(zhì)粒，其抗USP22?SiRNA 1作用．使用QuikChange誘變試劑盒構(gòu)建USP22基因的突變體USP22?C185A．pcDNA3載體上克隆有帶Myc標(biāo)簽的COX?2、COX?1、USP1基因的C端及帶有His標(biāo)簽的泛素的N端．

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和NCI?H460均保持在DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中添加10%的胎牛血清，1%谷氨酰胺和1%青霉素／鏈霉素．放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1．3 USPsiRNA文庫篩選USP siRNA文庫由Dharmacon公司提供，熒光染色siRNA作為對照組（序列為AACGUACGCGGAAUACUUCGA）．A549細(xì)胞株在25 nM的siRNA終濃度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染，持續(xù)3 d．

1．4 siRNA轉(zhuǎn)染取3×105生長狀態(tài)良好的A549和NCI?H460細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)基上24 h．取50 μL的脂質(zhì)體2000加入到1．5 mL的Opti?MEM，在室溫下孵育5 min（溶液A）．然后，取6 μL的siRNA加入1．5 mL的Opti?MEM（溶液B）．將溶液A和溶液B混合并在室溫下孵育20 min．然后在1 mL培養(yǎng)基中加入細(xì)胞與混合液，在37℃和5%CO2環(huán)境下孵育4 h．COX?2特異性siRNA由Origene提供．

1．5 USP22和USP1體外翻譯USP22和USP1重組蛋白質(zhì)生成，根據(jù) Promega供應(yīng)商的指示，使用TNT偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄／翻譯系統(tǒng)．反應(yīng)混合物中含有280 μL的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液、8 μL氨基酸混合物，16 μ LTNT反應(yīng)緩沖液，8 μL T7聚合酶以及4 μg pcDNA3?USP22或pcDNA3?USP1．將混合物混合于400 μL培養(yǎng)基中，在30℃條件下孵育2 h．所獲得的混合物進(jìn)行免疫共沉淀處理．

1．6 COX?2體外泛素化使用Boston Biochem公司提供的泛素化試劑盒對含有His標(biāo)簽的COX重組體進(jìn)行泛素化．泛素共軛體系由200 μg HeLa S?100，5 μM MG?132，4 μM泛素醛，600 μM泛素，和5 μL的能量再生溶液所組成．取1 μg His標(biāo)記的COX?2與泛素共軛體系在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，持續(xù)4 h．泛素化的COX?2根據(jù)制造商的指示用Ni?NTA樹脂進(jìn)行純化．

1．7 免疫印跡對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行裂解，裂解緩沖液由20 μM緩沖液，pH7．5，150 μM NaCl，1%NP40，1 μM EDTA以及由羅氏公司提供的一種完整的蛋白酶抑制劑所組成．提取物在20 kHz條件下每5 s震蕩3次，超聲震蕩處理的細(xì)胞在4℃、20 630 g條件下離心30 min，收集上清液．蛋白質(zhì)濃度由Pierce生物技術(shù)公司提供的Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行測定．約30 μg蛋白用SDS?PADE電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)印到由Pierce生物技術(shù)公司提供的PVDF上．膜在室溫下用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉30 min，然后室溫下孵育90 min．培養(yǎng)液中包含Novus生物有限公司提供的1∶500 COX?2抗體，Abcam公司提供的1∶500與USP22?C185A交叉反應(yīng)性抗體（ab4812抗體），1∶500上游遠(yuǎn)端元素結(jié)合蛋白 1（far upstream element?binding protein 1，F(xiàn)BP1），1∶500 COX?1抗體，1∶1000 β?肌動(dòng)蛋白以及 Proteintech公司提供1∶500 USP1抗體．用辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗并檢測，使用增強(qiáng)的化學(xué)熒光系統(tǒng)進(jìn)行信號檢測（Santa Cruz生物公司提供sc?2408）．

1．8 免疫沉淀反應(yīng)在30 μL A／G瓊脂糖凝膠蛋白質(zhì)柱床體積上添加20 μg Myc抗體，30 μL USP22抗體，或者30 μL對照組抗體，置于200 μL磷酸鹽緩沖液中（PBS），在室溫下孵育60 min．凝膠用PBS洗滌3次，然后置于含0．5 mg細(xì)胞裂解液的RIPA緩沖液中，4℃孵育4 h．凝膠用RIPA緩沖液洗滌3次，懸浮于緩沖液中，然后進(jìn)行免疫印跡分析．

1．9 PGE2酶免疫分析A549細(xì)胞加入12孔板，1．5×105／孔，分別加入1．5 nM控制組RNA與80 ng pcDNA3，1．5 nM USP22 SiRNA 1與80 ng pcDNA3，或者1．5 nM USP22 SiRNA 1與80 ng pcDNA3?COX?2，轉(zhuǎn)染24 h．第二天重復(fù)轉(zhuǎn)染，然后與1 μM的花生四烯酸（Sigma公司提供，貨號10931）在DMEM液中37℃條件下培養(yǎng)15 min，ELISA法檢測PGE2濃度．

1．10 細(xì)胞活性檢測使用MTT法檢測細(xì)胞活性．COX?2、USP22與對照組轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到96孔板（1×103），并在100 μL培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h．然后每孔加入100 μL MTT試劑（碧云天，貨號C0009），37℃下培養(yǎng)90 min．沉淀物用DMSO溶解，Thermo公司提供的iEMS微孔盤讀取儀560 nm光譜分析．

1．11 數(shù)據(jù)分析使用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，用多樣本均數(shù)比較分析方差，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Origin8．0計(jì)算分析COX?2的半衰期．

2 結(jié)果

2．1 USP22調(diào)節(jié)COX?2的表達(dá)COX?2是NSCLC生存狀態(tài)的預(yù)測因子，其水平受泛素蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控．本試驗(yàn)中，USP siRNA轉(zhuǎn)染A549和NCI?H460細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72 h檢測PGE2的濃度．由于USPs能夠下調(diào)COX?2表達(dá)，作為NSCLC致癌基因和生存不良預(yù)測因子的 USP22，研究 COX?2與 USP22的關(guān)系．為驗(yàn)證siRNA的效果，四種USP22 siRNA和pcDNA3?USP22轉(zhuǎn)染A549和NCI?H460細(xì)胞，對細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫印跡分析．與 control siRNA相比，4種USP22 siRNA沉默USP22表達(dá)（圖1A、D），然后檢查 USP22沉默對 COX?2表達(dá)及 USP22底物FBP1［17］水平的影響．研究表明與 control siRNA相比，USP22沉默下調(diào)A549和NCI?H460細(xì)胞中COX?2和FBP1水平（圖1B、E）．為檢測USP22對COX?2的特異性，用USP22 siRNA與編碼耐USP22（USP22R）siRNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，免疫印跡分析結(jié)果表明，USP22R恢復(fù)USP22水平，USP22 siRNA下調(diào)COX?2表達(dá)（圖1C、B）．通過對A549細(xì)胞進(jìn)行control siRNA和USP22 siRNA轉(zhuǎn)染72 h，檢測USP22基因沉默對COX?2穩(wěn)定性的影響．免疫印跡分析顯示USP22 siRNA顯著降低COX?2在A549細(xì)胞中的半衰期，從2．50±0．57 h降至1．18±0．34 h（圖1G、H，P＜0．05）．USP22異常表達(dá)上調(diào)COX?2水平，然而無催化活性的c185a USP22突變體表達(dá)無影響，證實(shí)USP22調(diào)節(jié)A549細(xì)胞中COX?2的穩(wěn)定性（圖1I）．

圖1 USP22沉默對COX?2表達(dá)的影響

2．2 COX?2是USP22底物為檢測USP22和COX?2之間潛在的相互作用，用表達(dá)USP22和Myc標(biāo)記的COX?2載體對A549和NCI?H460細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞裂解液用抗Myc抗體和對照IgG抗體進(jìn)行免疫沉淀．結(jié)果表明USP22與COX?2免疫共沉淀（圖2A、D）．細(xì)胞裂解液用抗?USP22抗體進(jìn)行免疫沉淀，得到相似結(jié)果（圖2B、E）．為證實(shí)USP22與COX?2之間的直接作用，將重組USP22與His標(biāo)記的COX?2或者 COX?1孵育，蛋白用親和層析法進(jìn)行分離．USP22與COX?2同步降低，但與COX?1變化不一致，表明USP22與COX?2之間直接作用（圖2C）．為檢測COX?2是USP22底物，全長度His標(biāo)記的COX?2泛素化與USP22或無催化活性的USP22 c185a突變體進(jìn)行孵育，免疫印跡結(jié)果表明與USP22共孵育導(dǎo)致COX?2去泛素化，USP22 c185a突變體未出現(xiàn)去泛素化（圖2F）．為證實(shí)USP22對COX?2去泛素化特異性，使用一種去泛素化酶，USP1作為對照進(jìn)行泛素化實(shí)驗(yàn)．含USP22組泛素化的COX?2水平降低，而在USP1或USP22 c185a組泛素化COX?2增加（圖2G）．另外，對細(xì)胞裂解液進(jìn)行COX?2泛素化分析以及使用抗泛素抗體都得到相似結(jié)果（圖2G、H）．綜上所述，結(jié)果表明 COX?2是 USP22底物，其穩(wěn)定性受USP22介導(dǎo)的去泛素化調(diào)控．

圖2 USP22與COX?2相互關(guān)系

2．3 USP22調(diào)節(jié)COX?2的活性和穩(wěn)定性及其對細(xì)胞增殖的影響為進(jìn)一步研究 USP22通過調(diào)節(jié)COX?2如何發(fā)揮其在腫瘤發(fā)生中的作用，本研究通過siRNA下調(diào)A549細(xì)胞中USP22和COX?2表達(dá)，觀察其細(xì)胞活力．USP22 siRNA處理的細(xì)胞中，異常表達(dá)的COX?2可以恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)COX?2水平（圖3A）．用MTT法檢測細(xì)胞活性，結(jié)果表明USP22和COX?2表達(dá)下調(diào)明顯降低細(xì)胞的活力，分別為63%和47%，過度表達(dá)的COX?2能夠恢復(fù)USP22 siRNA以及過表達(dá)COX?2質(zhì)粒處理細(xì)胞的活力（圖 3B）．實(shí)驗(yàn)證明USP22通過COX?2水平的調(diào)節(jié)影響細(xì)胞活力．為明確USP22對COX?2的作用，研究了細(xì)胞中炎癥因子PGE2水平．沉默USP22或COX?2明顯減少PGE2的生成，然而過表達(dá)COX?2可以恢復(fù)被USP22抑制的PGE2水平．這表明USP22調(diào)節(jié)COX?2的表達(dá)和活性（圖3C）．

圖3 沉默USP22抑制細(xì)胞增殖，COX?2增加PGE2水平

3 討論

真核細(xì)胞中，蛋白質(zhì)水平需要嚴(yán)格調(diào)控以保持平衡．泛素蛋白酶體系統(tǒng)是體內(nèi)蛋白質(zhì)清除機(jī)制之一，在體內(nèi)發(fā)揮諸多作用，如阻止與癌癥發(fā)生有關(guān)的分子信號通路傳導(dǎo)［18］．去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes，DUBs）催化蛋白質(zhì)去泛素化，然后分解為半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶．USPs是一個(gè)家族成員最多、結(jié)構(gòu)差異最大的去泛素化酶亞家族，至今被認(rèn)識研究超過60多種［19］．USPS包含三個(gè)保守的氨基酸殘基，Cys、His和推測的第三個(gè)保守氨基酸殘基Asp或Asn組成催化三聯(lián)體，它們是由四面體瞬間結(jié)構(gòu)形成的氧離子洞中間的水分子橋來穩(wěn)定的．DUBs參與許多生物學(xué)過程，他們在人類惡性腫瘤中的作用研究較少［20］．一些DUBs抑制劑已被研究，可望成為潛在抗癌劑．然而，由于USP抑制劑缺乏特異性，并且針對不同的USPs，特異性底物的識別對發(fā)展有效的靶向藥物是必不可少，因此其研究應(yīng)用受到限制［19］．

USP22與各種惡性腫瘤，包括NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，然而，其在癌癥中的作用機(jī)制仍不清楚．本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)COX?2作為USP22底物，USP22通過調(diào)節(jié)COX?2的活性和穩(wěn)定性發(fā)揮其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用．

在本研究中，沉默USP22下調(diào)COX?2水平，并降低肺癌細(xì)胞A549半衰期．USP22通過泛素化狀態(tài)調(diào)節(jié)COX?2穩(wěn)定性和活性．COX?2表達(dá)的調(diào)節(jié)作為一種潛在的癌癥治療策略．

實(shí)驗(yàn)報(bào)道［12］，長期使用針對COX酶的非甾體類抗炎藥，可以減少肺癌的發(fā)病率，據(jù)此，COX?2表達(dá)的調(diào)節(jié)可以作為一種潛在的癌癥治療策略．選擇性COX?2抑制劑塞來昔布已被批準(zhǔn)用于治療家族性腺瘤性息肉?。袑W(xué)者［21］建議塞來昔布可以作為NSCLC化療輔助用藥．然而，COX?2表達(dá)上調(diào)以及PGE2增加具體作用仍不清楚，COX?2表達(dá)上調(diào)刺激細(xì)胞生長，但也導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，PGE2在一些腫瘤中抑制細(xì)胞生長，但也通過激活EGFR增加細(xì)胞活力促進(jìn)生長［22］．COX?2是一種膜結(jié)合蛋白，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）中，通過ER相關(guān)的降解系統(tǒng)，將COX?2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，然后被UPS調(diào)控降解［23］．COP9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體調(diào)控COX?2穩(wěn)定性，其為一種調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的多亞基復(fù)合物，影響其泛素化過程［24］．通過泛素化過程對COX?2水平的調(diào)節(jié)以及COX?2和PGE2信號通路在肺癌患者中的重要性已被證實(shí)．研究結(jié)果表明USP22與COX?2水平存在相關(guān)關(guān)系，然而 USP22上調(diào)和COX?2在NSCLC之間的相互關(guān)系還需進(jìn)一步研究．

USP22底物的識別在理解USP22在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制尤其重要，USP22去除組蛋白H2A和H2B泛素部分，并調(diào)節(jié) c?myc基因的表達(dá)［5，25］．USP22所介導(dǎo)的泛素化修飾組蛋白H2B過程，可以激活JAK?STAT誘導(dǎo)基因，這可能是USP22在癌癥患者中潛在作用機(jī)制之一［26］．FBP1為 USP22底物，USP22介導(dǎo)的FBP1去泛素化調(diào)節(jié)其對靶位點(diǎn)的募集和基因調(diào)控表達(dá)，這提示USP22可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)發(fā)揮其在腫瘤中的間接作用［17］．USP22與MDMX之間相互作用導(dǎo)致 p53依賴的細(xì)胞凋亡［27］．盡管USP22致癌作用已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其在一些惡性腫瘤也表達(dá)上調(diào)，但是USP22底物識別是有限的，其作用機(jī)制尚待闡明．目前研究顯示，USP22介導(dǎo)的COX?2去泛素化調(diào)控細(xì)胞中COX?2和PGE2表達(dá)水平，其對肺癌細(xì)胞活力的影響提示潛在的致癌機(jī)理．USP22沉默對細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，以及明確COX?2和PGE2軸在USP22所參與的腫瘤中起的作用，還需進(jìn)一步研究．

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USP22 regulation of cyclooxygenase?2 in non?small cell lung cancer

YANG Jian，XIAO Hai?Bo
Department of Cardiothrocic Surgery，Xinhua Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200092，China

Ubiquitin?specific protease 22（USP22）is an epige?netic modifier that is upregulated in many cancers as an oncogene．Abnormal expression of USP22 in non?small cell lung cancer（NSCLC）often indicates a poor survival rate．USP22 gene，as an oncogene，has little research on its regulatory substrate and its mechanism in cancer is unclear．In the study，we found that cyclooxygenase?2（COX?2）as a substrate for direct regulation of USP22，its expression in cells regulated by USP22 mediated ubiquitination．USP22 silencing down regulate the expression of COX?2，reduce its half?life，and regulate the stability and activity of COX?2 through the regulation of ubiquitination，thereby inhibi?ting the proliferation of lung cancer cells．The findings of this study suggest that USP22 may play a role in the development of cancer by regulating the activity and stability of COX?2．

USP22；COX?2；NSCLC；Deubiquitination

R734．2

A

2095?6894（2017）02?16?05

2016－12－21；接受日期：2017－01－05

國家自然科學(xué)基金（81572248）

楊 ?。瓻?mail：15800551893＠163．com

肖海波．副主任醫(yī)師，副教授．E?mail：xnavor＠163．com