王貴升尹斐斐（①山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東 濟(jì)南 250100 ②山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 山東 濟(jì)南 山東省威海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

肺炎克雷伯氏菌PCR檢測(cè)方法的建立

王貴升①②尹斐斐③（①山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東 濟(jì)南 250100 ②山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 山東 濟(jì)南 ③山東省威海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

依據(jù)GenBank中肺炎克雷伯氏菌的部分已知序列，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立一種檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的診斷方法。特異性和敏感性試驗(yàn)顯示，該方法能特異地檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌，其最低能檢測(cè)的細(xì)菌濃度為1×10-4Mcf，整個(gè)檢測(cè)擴(kuò)增在3h內(nèi)完成。該結(jié)果表明本試驗(yàn)所建立的PCR方法的靈敏度及特異性均較好，可用于快速檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌。

肺炎克雷伯氏菌 PCR 檢測(cè)

肺炎克雷伯氏菌(K.pnenmoniae)是一種G-桿菌，屬于腸桿菌科，條件性致病菌[1]。肺炎克雷伯氏菌與大腸桿菌在普通的營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂等培養(yǎng)基上具有極高的相似性，細(xì)菌的形態(tài)、顏色、氣味都很相近，革蘭氏染色鏡檢中都是短小的G-小桿菌[2]。在常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)中很難將肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌區(qū)別開(kāi)來(lái)，而做細(xì)菌的生化鑒定和16sRNA鑒定需要比較長(zhǎng)的時(shí)間，約3～4d的時(shí)間。如果做16sRNA鑒定還需要進(jìn)行測(cè)序，成本比較高。另外，毛皮動(dòng)物克雷伯氏菌病以支氣管炎、肺炎，敗血癥，腦膜炎，腹膜炎，腹瀉等為主要癥狀；與綠膿桿菌也引起的肺炎的癥狀相同[3-5]，因此，建立快速檢測(cè)和鑒定肺炎克雷伯氏菌的方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 文中所涉及的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)，記載于2012年1月至2014年7月從發(fā)病的毛皮動(dòng)物(主要是水貂)中分離鑒定得到的；大腸桿菌(Escherichia coli)，記載于2012年1月至2014年7月從發(fā)病的毛皮動(dòng)物(主要是水貂)中分離鑒定得到的；綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、記載于2012年1月至2014年7月從發(fā)病的毛皮動(dòng)物(主要是水貂)中分離鑒定得到的；以上菌株除了肺炎克雷伯氏菌保存于中國(guó)微生物菌種保藏普通微生物中心(登記入冊(cè)編號(hào)11222)，其余均保存在山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，10×PCR反應(yīng)液、Taq酶、MgCl2(25mmol/L)、dNTP(25mmol/L)均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)板；顯微鏡；生化培養(yǎng)箱；PCR儀為羅氏公司生產(chǎn)；Centrifuge 5417R臺(tái)式冷凍離心機(jī)由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 選取肺炎克雷伯氏菌的基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)出相應(yīng)引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，使用前用滅菌超純水配成10μmol/L的濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物信息

1.2 方法

1.2.1 PCR體系建立 反應(yīng)條件的優(yōu)化，先建立優(yōu)化單個(gè)菌的檢測(cè)體系，在此基礎(chǔ)上，逐步改變引物的濃度以達(dá)到最佳。

1.2.2 PCR特異性試驗(yàn) 選取經(jīng)鑒定純化的水貂源大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和綠膿桿菌，分別挑單個(gè)菌落于10ml無(wú)菌試管中過(guò)夜搖菌，得原菌液。按照優(yōu)化好的PCR擴(kuò)增條件，PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，分別取5ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在BIO-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相。

1.2.3 PCR敏感性試驗(yàn) （1）將肺炎克雷伯氏菌7株劃在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，取單個(gè)菌落作PCR反應(yīng)的模版，其他反應(yīng)體系和條件都不變，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)充至50μl。（2）取培養(yǎng)了12h的肺炎克雷伯氏菌的單個(gè)菌落，于3ml 85%Nacl生理鹽水中，將菌液濃度(麥?zhǔn)綕舛?調(diào)整為0.1Mcf，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行50、100、1000倍稀釋?zhuān)聪♂尯蟮木簼舛葹?.002、0.001、0.0001Mcf。各取其4μl做PCR反應(yīng)的模版。其他PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系都不變。

1.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化 摸索反應(yīng)條件，建立了50μl的反應(yīng)體系：4μl待測(cè)樣品、4μl引物對(duì)K1或/和引物對(duì)K2(上下引物各2μl)和25μl PCR試劑，用滅菌雙蒸水補(bǔ)充至50μl。優(yōu)化后的程序?yàn)椋旱谝浑A段預(yù)變性94℃3min；第二階段94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸7min，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 肺炎克雷伯氏菌的特異性 如圖1所示，1～7泳道和9～15泳道為肺炎克雷伯氏菌的擴(kuò)增產(chǎn)物，8和16泳道為陰性對(duì)照(蒸餾水)；1～8泳道第一對(duì)引物，9～16泳道第二對(duì)引物；7株肺炎克雷伯氏菌對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及成像拍照，在303bp處均出現(xiàn)清晰條帶。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，其序列均如SEQ ID NO.5所示為肺炎克雷伯氏菌的特異性基因序列。可見(jiàn)，該引物能將肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)到。

圖1 肺炎克雷伯氏菌的特異性試驗(yàn)M：DNA maker DL2000：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；下同

圖2 大腸桿菌的特異性試驗(yàn)

2.1.2 對(duì)大腸桿菌的特異性試驗(yàn) 如圖2所示，1～10泳道和12～21泳道為10株大腸桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物；11和22泳道為陰性對(duì)照；1～11泳道是第一對(duì)引物；2～22泳道是第二對(duì)引物；10株大腸桿菌在303bp處沒(méi)有出現(xiàn)條帶?？梢?jiàn)，該引物不能將大腸桿菌檢測(cè)到。

2.1.3 對(duì)綠膿桿菌的特異性試驗(yàn) 如圖3所示，1～10泳道和12～21泳道為10株綠膿桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物；11和22泳道為陰性對(duì)照；1～11泳道是第一對(duì)引物；2～22泳道是第二對(duì)引物；在303bp處均沒(méi)有出現(xiàn)條帶?？梢?jiàn)，該引物不能將綠膿桿菌檢測(cè)到。

2.1.4 對(duì)肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌和綠膿桿菌混合菌的特異性試驗(yàn) 如圖4所示，1～3泳道為第一對(duì)引物檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌三種混合菌液的結(jié)果；4～6泳道為第一對(duì)引物檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌、綠膿桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；7～9泳道為第一對(duì)引物檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；10泳道為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的結(jié)果；11泳道為陰性對(duì)照；12～14泳道為第二對(duì)引物檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌三種混合菌液的結(jié)果；15～17泳道為第二對(duì)引物檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌、綠膿桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；18～20泳道為第二對(duì)引物檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌兩種混合菌液的結(jié)果；21泳道為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的結(jié)果；22泳道為陰性對(duì)照；可見(jiàn)，此兩對(duì)引物對(duì)肺炎克雷伯氏菌具有良好的特異性，能夠?qū)⒎窝卓死撞暇c混淆程度很大的大腸桿菌和綠膿桿菌區(qū)分開(kāi)。

圖3 綠膿桿菌的特異性試驗(yàn)

圖4 肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌和綠膿桿菌混合菌的特異性試驗(yàn)

2.2 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 肺炎克雷伯氏菌單個(gè)菌落敏感性 如圖5，肺炎克雷伯氏菌7株單個(gè)菌落就可以用該引物檢測(cè)到，說(shuō)明此引物敏感性良好。

圖5 肺炎克雷伯氏菌單個(gè)菌落敏感性試驗(yàn)

2.2.2 肺炎克雷伯氏菌梯度稀釋后敏感性 如圖6、7，引物對(duì)K1對(duì)肺炎克雷伯菌的敏感性試驗(yàn)結(jié)果；1、2泳道菌液模版濃度為0.002Mcf，3、4泳道菌液模版濃度為0.001Mcf，5、6泳道菌液模版濃度為0.0001Mcf，7泳道菌液模版濃度為0.1Mcf作為陽(yáng)性對(duì)照，8泳道為陰性對(duì)照；引物對(duì)K2對(duì)肺炎克雷伯菌的敏感性試驗(yàn)結(jié)果； 1、2泳道菌液模版濃度為0.002Mcf，3、4泳道菌液模版濃度為0.001Mcf，5、6泳道菌液模版濃度為0.0001Mcf，7泳道菌液模版濃度為0.1Mcf作為陽(yáng)性對(duì)照，8泳道為陰性對(duì)照；可見(jiàn)，當(dāng)菌液濃度為0.0001Mcf時(shí)仍可見(jiàn)清晰的條帶，說(shuō)明該引物的敏感性較高。

圖6 引物對(duì)K1的敏感性試

圖7 引物對(duì)K2的敏感性試驗(yàn)

3 結(jié)論

隨著毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)向規(guī)?；?、集約化發(fā)展，毛皮動(dòng)物疾病越來(lái)越復(fù)雜，病毒、細(xì)菌等多病原混合感染的現(xiàn)象日益突出[6]。當(dāng)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疫病時(shí)，應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室檢查與現(xiàn)場(chǎng)診斷相結(jié)合，傳統(tǒng)技術(shù)與現(xiàn)代化技術(shù)相結(jié)合，綜合分析，找出主要病原和誘發(fā)因素[7]。本方法的建立，能夠快速的將肺炎克雷伯氏菌與大腸桿菌、綠膿桿菌區(qū)分開(kāi)。為臨床治療方案制定爭(zhēng)取了時(shí)間。

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S852.61+2

A

1007-1733(2017)04-0006-02

2017–01–11）

山東省毛皮動(dòng)物產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-18-011-05)