劉貴旺， 徐大為， 張瑋瓊， 許錦煌， 鄭沛中， 葉 培， 李建華， 黃建榮△

(1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院骨科， 廣東 廣州 510235； 2廣州醫(yī)科大學(xué)生理教研室， 廣東 廣州 511436； 3廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院骨科， 廣東 廣州 511300； 4佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院骨科， 廣東 佛山 528200)

TRPC6在IL-1β誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖中的作用*

劉貴旺1， 徐大為1， 張瑋瓊3， 許錦煌3， 鄭沛中3， 葉 培4， 李建華2△， 黃建榮1△

(1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院骨科， 廣東 廣州 510235；2廣州醫(yī)科大學(xué)生理教研室， 廣東 廣州 511436；3廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院骨科， 廣東 廣州 511300；4佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院骨科， 廣東 佛山 528200)

目的： 應(yīng)用RNA干擾技術(shù)研究瞬時受體電位通道6(TRPC6)對IL-1β誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(RA-FLS)增殖的影響。方法: RT-qPCR法檢測RA和骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者滑膜組織中TRPC6 mRNA的表達水平。組織塊聯(lián)合酶消化法培養(yǎng)RA-FLS。流式細(xì)胞術(shù)鑒定RA-FLS。將不同濃度(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μg/L)的重組人 IL-1β與 RA-FLS共培養(yǎng)36 h，CCK-8法檢測細(xì)胞活力的改變；16 μg/L的IL-1β作用RA-FLS不同時間(12、24、36、48、60、72 h)，CCK-8法檢測細(xì)胞活力的改變。特異性TRPC6-siRNA轉(zhuǎn)染RA-FLS后，采用RT-qPCR和Western blotting 檢測沉默效率。在IL-1β存在和不存在的條件下，CCK-8法、EdU標(biāo)記法和流式細(xì)胞術(shù)檢測TRPC6干擾組與對照組的細(xì)胞活力、EdU陽性細(xì)胞比率和(G2/M+S)期比率的差異。結(jié)果: RA患者滑膜組織中TRPC6的mRNA表達水平相對于OA患者明顯增加(P<0.05)。TRPC6-siRNA能顯著降低RA-FLS中TRPC6 mRNA和蛋白的表達(P<0.05)。IL-1β能誘導(dǎo)RA-FLS增殖(P<0.05)。沉默TRPC6后，在IL-1β的誘導(dǎo)環(huán)境下，特異性干擾組RA-FLS 的活力、EdU陽性細(xì)胞比率和(G2/M+S)期比率與空白組和對照組相比均明顯降低(P<0.05)，而在不含IL-1β的條件下，干擾組與空白組和對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性。結(jié)論: TRPC6參與IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS增殖過程，沉默TRPC6能降低IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS增殖水平。

瞬時受體電位通道6； 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎； 滑膜細(xì)胞； 細(xì)胞增殖

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性多關(guān)節(jié)滑膜炎、骨及軟骨破壞為主要特征的全身性自身免疫性疾病[1]。比較公認(rèn)的基本病理機制為滑膜細(xì)胞的激活，分泌大量炎癥因子、趨化因子，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞激活并募集于滑膜襯下間質(zhì)。而炎癥細(xì)胞所分泌的炎癥因子又能反饋促進滑膜細(xì)胞的激活。如此級聯(lián)反應(yīng)，使得滑膜細(xì)胞快速活化，爆發(fā)增殖，形成血管翳，侵入并破壞毗鄰軟骨及骨骼。因此研究成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖作用及機制十分必要。

鈣離子(Ca2+)是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的第二信使，參與細(xì)胞內(nèi)信息傳遞并調(diào)控遞質(zhì)釋放、細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞死亡等一系列生命過程[2]。瞬時受體電位通道6(transient receptor potential channel 6, TRPC6)作為參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度媒介。TRPC6基因突變或過表達能引起胞內(nèi)鈣離子信號通路異常，影響細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，進而使細(xì)胞的多種病理生理過程發(fā)生變化[3]。一項關(guān)于RA的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome- wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)RA病人中TRPC6基因存在突變，并且與RA疾病進展具有相關(guān)性[4]。IL-1β是一種重要的促炎因子，參與多種慢性炎癥性疾病的病理過程。它能加重RA患者滑膜炎癥的進展，并在RA病理機制中發(fā)揮重要作用。有文獻報道，IL-1β能促進類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RA-FLS)的DNA合成，加快其增殖[5]。結(jié)合本課題組前期的實驗結(jié)果顯示TRPC6在RA-FLS中的表達量較骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中的表達量增加。是否TRPC6在RA-FLS增殖行為中起重要作用呢？本文擬通過RNAi技術(shù)，在IL-1β誘導(dǎo)下對該問題進行了初步探討，以期闡明TRPC6 在IL-1β誘導(dǎo)RA-FLS增殖中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑及儀器

DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DPBS磷酸鹽緩沖液、含EDTA的0.25%胰酶溶液和Opti-MEM培養(yǎng)基購自于Gibco；抗CD90-PE和CD68-APC抗體購自于BD；IL-1β購自于Peprotech；Lipofectamine RNAiMAX 購自于Invitrogen；CCK-8試劑盒購于Dojindo；Cell-Light EdU Apollo 567 DNA試劑盒購于廣州銳博。碘化丙啶、RNA酶和II型膠原酶購于Sigma。TRPC6兔抗多克隆抗體購于Alomone；GAPDH鼠抗單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗小鼠Ⅱ抗購于Bioworld；PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time) 試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒購于TaKaRa。其它化合物均為分析級，購于廣州化學(xué)試劑廠。所用引物由Invitrogen根據(jù)設(shè)計合成，見表1。所用siRNA由蘇州吉瑪公司根據(jù)設(shè)計合成，見表2。

表1 引物序列

表2 siRNA序列

多功能酶標(biāo)儀、StepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀和EVOS FL熒光顯微鏡(Thermo Fisher)； 化學(xué)發(fā)光成像儀(Bio-Rad);流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur)。

2 主要方法

2.1 RT-qPCR檢測RA和OA滑膜組織TRPC6 mRNA表達水平 滑膜組織來自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)或關(guān)節(jié)鏡下滑膜清理術(shù)的RA和OA患者。該項目通過了中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會審查。所有RA及OA患者的診斷分別符合美國風(fēng)濕病學(xué)會類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。TRIzol法提取2組滑膜組織總RNA，按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒說明書合成cDNA。然后按照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書，在Thermo Fisher的StepOnePlusTM實時定量PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計算RA組與OA組滑膜組織TRPC6 mRNA的相對表達量。

2.2 原代細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 取出滑膜組織后，充分剪碎，加入2 g/L的II型膠原酶溶液，于37 ℃培養(yǎng)箱中消化4 h，濾過未消化組織，離心2 000 r/min、5 min，PBS重懸后離心2 000 r/min、5 min，重復(fù)2次；加入適量含15% FBS的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，換液除去未貼壁細(xì)胞，隨后每2～3 d換液。原代培養(yǎng)第3代后通過2種方法進行細(xì)胞鑒定：光學(xué)相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)以及通過流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)細(xì)胞的CD68和CD90抗原陽性率。

2.3 siRNA沉默RA-FLS細(xì)胞TRPC6基因 取經(jīng)過鑒定的第3～6代RA-FLS用于實驗，將RA-FLS以1×107cells/L的密度接種于6 孔板，每孔加入2 mL 含15% FBS完全培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達到60%～80%時，采用Lipofectamine RNAiMAX介導(dǎo)TRPC6-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。設(shè)置RA-FLS TRPC6-siRNA轉(zhuǎn)染組(TRPC6-siRNA組)、RA-FLS陰性對照(negative control, NC)siRNA轉(zhuǎn)染組(NC-siRNA組)和RA-FLS對照組(control組)。在轉(zhuǎn)染8 h后，先用DPBS洗滌細(xì)胞3 次，洗脫殘留在培養(yǎng)基及細(xì)胞表面的攜帶FAM基團的siRNA，以降低熒光背景。熒光顯微鏡觀察，初步估計轉(zhuǎn)染效率。

2.4 RT-qPCR檢測TRPC6的mRNA表達 TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒說明書合成cDNA。然后按照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書，在Thermo Fisher的StepOnePlusTM實時定量PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計算TRPC6-siRNA組與兩對照組TRPC6的mRNA相對表達量。

2.5 Western blotting 檢測TRPC6蛋白的表達 轉(zhuǎn)染72 h后收集各組細(xì)胞、提取總蛋白，采用BCA 法蛋白定量后，各組取80 μg蛋白上樣。經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，BSA封閉液室溫孵育2 h，孵育后TBST洗膜，然后將膜分別放入抗TRPC6和GAPDH的 I 抗稀釋緩沖液中，4 ℃平緩搖動過夜。再次TBST洗膜3次，每次5 min；放入牛奶稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗，室溫?fù)u床孵育1 h； TBST洗膜3次，每次5 min，最后于化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，用ImageJ軟件進行分析，比較各組蛋白的相對表達量。

2.6 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 (1)將RA-FLS接種于96孔板中，細(xì)胞密度為1×107cells/L。當(dāng)細(xì)胞生長融合至60%時，給予不同濃度(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μg/L) IL-1β處理36 h或一定濃度IL-1β處理不同時間(12、24、36、48、60、72 h)，在處理結(jié)束后，棄去板內(nèi)的培養(yǎng)基，用DPBS清洗1 次后，每孔加入1∶10稀釋過的CCK-8溶液100 μL，37 ℃孵育3 h，酶標(biāo)儀讀取各孔在450 nm 波長處的吸光度(A)值，取其平均值。(2)將TRPC6-siRNA 組、NC-siRNA 組和control組的RA-FLS分別接種于96孔板中，又分別將其分為IL-β處理和不處理亞組。60 h后，棄去板內(nèi)的培養(yǎng)基，用DPBS清洗1 次后，每孔加入1∶10稀釋過的CCK-8溶液100 μL，37 ℃孵育3 h，酶標(biāo)儀讀取各孔在450 nm 波長處的吸光度(A)值，取其平均值。

2.7 EdU標(biāo)記法檢測細(xì)胞DNA合成 將TRPC6-siRNA 組、NC-siRNA 組和control組的RA-FLS分別接種于96孔板中，又分別將其分為IL-1β處理和不處理亞組。36 h處理或不處理后，按照Cell-Light EdU Apollo 567 DNA試劑盒說明書進行操作。于熒光顯微鏡拍攝獲得圖片。EdU陽性細(xì)胞率通過10個隨機視野下計數(shù)獲得。

2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化 將TRPC6-siRNA 組、NC-siRNA 組和control組的RA-FLS分別接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，又將其分為IL-1β處理和不處理亞組。60 h后，胰酶消化，離心去除培養(yǎng)基。用DPBS重懸后，1 000 r/min 離心5 min，取不少于3×105～5×105個細(xì)胞，用0.2 mL DPBS重懸，然后用70%冰乙醇2 mL固定細(xì)胞，混勻后，封口4 ℃過夜。取固定過夜的細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min ，棄固定液，2 mL DPBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min ，再次棄上清。細(xì)胞沉淀加50 μL RNA酶和450 μL碘化丙啶，避光孵育30 min后，行流式細(xì)胞儀檢測。檢測結(jié)果使用相關(guān)分析軟件分析。細(xì)胞增殖活性用增殖指數(shù)(proliferation index，PI)進行量化，PI 值越大，細(xì)胞處于增殖期的越多，增殖越明顯。PI=100%×(G2/M+S)期細(xì)胞數(shù)/(G2/M+S+G0+G1)期細(xì)胞數(shù)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析, 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。 兩組間比較采用獨立樣本資料t檢驗。雙因素多組間資料用雙因素方差分析, 多重比較用Bonferroni法檢驗。單因素多組間資料用單因素方差分析，多重比較用Bonferroni法檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RA和OA患者滑膜組織中TRPC6 mRNA表達水平

RT-qPCR結(jié)果顯示，RA患者滑膜組織中TRPC6的mRNA表達水平相對于OA患者明顯增加(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.Expression of TRPC6 mRNA in synovial tissues from OA patients and RA patients. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vsOA group．

圖1 RA和OA患者滑膜組織中TRPC6 mRNA表達水平

2 RA-FLS的培養(yǎng)及鑒定

用組織塊聯(lián)合酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)第4天即可見少量細(xì)胞，第10天可見細(xì)胞融合。胰酶消化進行傳代。光學(xué)顯微鏡下原代細(xì)胞呈細(xì)長紡錘形，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相符，見圖2A。流式細(xì)胞術(shù)檢測第3代細(xì)胞表面CD90和CD68陽性表達率，分別為93.55%和0.53%，提示大多數(shù)細(xì)胞為RA-FLS，見圖2B。

Figure 2.Identification of primarily cultured RA-FLS. A: RA-FLS under light microscope at 4 d, 6 d, 8 d and 10 d; B: the expression of CD90 and CD68 in the RA-FLS at passage 3 detected by flow cytometry．

圖2 RA-FLS的培養(yǎng)與鑒定

3 IL-1β誘導(dǎo)RA-FLS增殖

不同濃度IL-1β作用36 h 后，8 μg/L 和16 μg/L組RA-FLS的A值與對照組相比顯著升高(P<0.05)，見圖3A; 16 μg/L IL-1β作用不同時間后，36～72 h組RA-FLS的A值與相應(yīng)對照組相比均顯著升高(P<0.05)，見圖3B。

Figure 3.The viability of RA-FLS induced by IL-1β. A: the cells were treated with 0.25～16 μg/L IL-1β for 36 h; B: the cells were treated with 16 μg/L IL-1β for 12 h～72 h. The cell viability was measured by CCK-8 assay. Mean±SEM.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group．

圖3 IL-1β誘導(dǎo)RA-FLS細(xì)胞活力增強

4 轉(zhuǎn)染TRPC6-siRNA對RA-FLS 中 TRPC6 mRNA和蛋白表達的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，TRPC6-siRNA轉(zhuǎn)染RA-FLS后，TRPC6的mRNA表達相對于空白對照組及陰性對照組均明顯降低(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組相比mRNA的表達無明顯差異，見圖4A。Western blotting檢測結(jié)果顯示TRPC6-siRNA轉(zhuǎn)染組的TRPC6 蛋白表達相對于空白對照組及陰性對照組明顯降低(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組相比蛋白表達未見明顯差異，見圖4B。

Figure 4.The interference efficiency of TRPC6-siRNA. A: the mRNA expression of TRPC6 at 24 h after transfection detected by RT-qPCR; B: the protein expression of TRPC6 at 72 h after transfection detected by Western blotting. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsNC-siRNA.

圖4 RA-FLS中TRPC6-siRNA沉默效率

5 沉默TRPC6對IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS增殖作用的影響

TRPC6-siRNA轉(zhuǎn)染RA-FLS后，在IL-1β誘導(dǎo)和不誘導(dǎo)的條件下，采用 CCK-8法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在IL-1β誘導(dǎo)的環(huán)境下，TRPC6-siRNA干擾組與空白對照組和陰性對照組相比細(xì)胞活力水平明顯降低(P<0.05)；而在IL-1β不進行誘導(dǎo)的條件下，TRPC6-siRNA干擾組與空白對照組和陰性對照組相比活力水平差異不顯著，見圖5。EdU實驗結(jié)果表明，沉默TRPC6后，在IL-1β誘導(dǎo)的環(huán)境下，TRPC6-siRNA干擾組與空白對照組和陰性對照組相比DNA合成水平明顯降低(P<0.05);而在IL-1β不進行誘導(dǎo)的條件下，TRPC6-siRNA干擾組與空白對照組和陰性對照組相比DNA合成水平差異不顯著，見圖6。

6 沉默TRPC6對IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS細(xì)胞周期的影響

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析沉默TRPC6對IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS細(xì)胞周期的變化。結(jié)果顯示在IL-1β誘導(dǎo)的環(huán)境下，TRPC6-siRNA干擾組與空白對照組和陰性對照組相比S期和G2/M期的細(xì)胞比例減少，G0/G1期增加(P<0.05)；而在IL-1β不進行誘導(dǎo)的條件下，TRPC6-siRNA干擾組與空白對照組和陰性對照組相比S期和G2/M期以及G0/G1期的細(xì)胞比例變化不明顯，見圖7。

討 論

RA是一種以慢性多關(guān)節(jié)滑膜炎、骨及軟骨破壞為主要特征的全身性自身免疫性疾病，可發(fā)生于任何年齡，持續(xù)性反復(fù)發(fā)作，致殘率極高。在歐美發(fā)達國家中，RA的患病率約為0.5%～1.0%[1]。我國的流行病學(xué)調(diào)查顯示RA的患病率為0.41%，男女比約為1∶6[6]。RA的主要病理特征為滑膜襯里細(xì)胞增生，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞大量浸潤，微血管增生，血管翳形成，軟骨和骨組織破壞，關(guān)節(jié)功能障礙。然而，RA的發(fā)病機制依然不全明了。比較公認(rèn)的基本病理機制為滑膜細(xì)胞的激活，然后炎癥細(xì)胞激活并募集于滑膜組織，形成血管翳，侵入并破壞毗鄰軟骨及骨骼[1]。特別是RA-FLS功能異常在RA患者關(guān)節(jié)炎癥和組織破壞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，研究RA-FLS的生物學(xué)功能，探尋RA發(fā)病機制中新的干預(yù)靶點，成為RA相關(guān)研究的熱點。

Figure 5.CCK-8 assay for determining the effect ofTRPC6 silencing on the viability of RA-FLS induced by IL-1β. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsNC-siRNA．

圖5 沉默TRPC6對IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS細(xì)胞活力的影響

Figure 6.EdU assay for determining the effect ofTRPC6 silencing on the proliferation of RA-FLS induced by IL-1β. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsNC-siRNA.

圖6 沉默TRPC6對IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS細(xì)胞增殖的影響

Ca2+是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的第二信使，在細(xì)胞內(nèi)傳遞信息并調(diào)控遞質(zhì)釋放、細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞死亡等一系列生命過程。Berridge等[7]發(fā)現(xiàn)Ca2+信號在細(xì)胞增殖中起到重要作用。鈣依賴和鈣調(diào)素途徑均可以影響相關(guān)細(xì)胞細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變[8]。越來越多實驗證明，激活Ca2+信號通路能影響腫瘤細(xì)胞的增殖[9]。那么，RA-FLS作為一種類腫瘤細(xì)胞，是否Ca2+信號在其增殖中也起到重要作用呢?

TRPC通道是TRP通道的一個非選擇性陽離子通道亞家族[10]。它包括7個成員，TRPC1～TRPC7，主要參與細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運[11]。有研究表明，TRPC通道在氣道平滑肌細(xì)胞[12]和幾種腫瘤細(xì)胞[13-14]的增殖能力中起作用。而TRPC6作為TRPC通道一員，也參與體內(nèi)許多重要的生理和病理調(diào)節(jié)過程。TRPC6基因突變或過表達所引起的胞內(nèi)鈣離子信號通路異常，會通過改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度而影響細(xì)胞的多種病理生理過程。那么，TRPC6是否在RA-FLS的增殖作用中起重要作用呢？

炎性滑膜炎導(dǎo)致的關(guān)節(jié)破壞是RA的典型病理過程。IL-1β可通過誘導(dǎo)RA-FLS增殖參與該過程[15]。此外，IL-1β也是RA炎性微環(huán)境的主要成分。因此，本實驗利用IL-1β為增殖誘導(dǎo)物，發(fā)現(xiàn)沉默TRPC6能減緩IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS增殖，并且減少細(xì)胞向G2/M期轉(zhuǎn)變。

Figure 7.Flow cytometry for analyzing the effect ofTRPC6 silencing on the cell cycle of RA-FLS stimulated with IL-1β. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsNC-siRNA.

圖7 沉默TRPC6對IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS細(xì)胞周期的影響

眾所周知，細(xì)胞增殖需要Ca2+的參與，因此我們推測，TRPC6可能通過調(diào)控Ca2+參與RA-FLS的增殖作用。本實驗由于缺少TRPC6調(diào)控Ca2+的直接證據(jù)，所以不能完全證明上述觀點。因此下一步實驗，我們將通過實時鈣測定和膜片鉗技術(shù)證明TRPC6調(diào)控RA-FLS的胞內(nèi)Ca2+濃度。此外，本實驗也缺少過表達TRPC6的反向?qū)嶒?。最后，TRPC6是否有聯(lián)合TRPC通道亞家族的其它成員，共同參與RA-FLS的增殖作用調(diào)控，也有待進一步研究。

總之，結(jié)合本實驗結(jié)果及相關(guān)文獻，TRPC6可能是通過調(diào)控胞內(nèi)Ca2+濃度，控制細(xì)胞向G2/M期轉(zhuǎn)變，從而影響RA-FLS的增殖。因此，TRPC6可能在RA的疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。進一步探討TRPC6在RA中的作用及機制，有助于為以TRPC6為靶點的RA臨床干預(yù)提供初步的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of TRPC6 on IL-1β-induced proliferation of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes

LIU Gui-wang1, XU Da-wei1, ZHANG Wei-qiong3, XU Jin-huang3, ZHENG Pei-zhong3, YE Pei4, LI Jian-hua2, HUANG Jian-rong1

(1DepartmentofOrthopaedics,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510235,China;2DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China;3DepartmentofOrthopaedics,ZengchengDistrictPeople’sHospitalofGuangzhou,Guangzhou511300,China;4DepartmentofOrthopaedics,NanhaiDistrictPeople’sHospitalofFoshan,Foshan528200,China.E-mail:guke16@163.com;lijianh@hotmail.com)

AIM: To investigate the effects of transient receptor potential channel 6 (TRPC6) on the proliferation of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA-FLS) induced by IL-1β. METHODS: The mRNA expression of TRPC6 in synovial tissues from RA or OA patients was studied by RT-qPCR. RA-FLS were cultured by enzyme digestion and tissue adhesion methods. The method of flow cytometry was applied to identify the RA-FLS. RA-FLS were treated with different concentrations (0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 and 16 μg/L) of IL-1β for 36 h. The cell viability was examined by CCK-8 assay. RA-FLS were incubated with IL-1β (16 μg/L) for different time (12, 24, 36, 48, 60 and 72 h), and the cell viability was measured by CCK-8 assay. The interference efficiency of TRPC6-siRNA was determined by RT-qPCR and Western blotting. After incubation in the presence or absence of IL-1β medium, the cell viability, the percentage of EdU-positive cells and the percentage of (G2/M+S) phase were measured by CCK-8 assay, EdU labeling assay and flow cytometry, respectively. RESULTS: The mRNA expression of TRPC6 was found in synovial tissue with higher levels in RA patients than that in OA patients. TRPC6-siRNA significantly decreased the mRNA and protein expression of TRPC6 (P<0.05). When RA-FLS were treated with IL-1β, the proliferation of RA-FLS was increased (P<0.05). The differences of the cell viability, the percentage of EdU-positive cells and the (G2/M+S) phase percentage between TRPC6-siRNA group and blank control group or NC-siRNA group were significant, in the presence of IL-1β (P<0.05). However, they were not significant in the absence of IL-1β. CONCLUSION: TRPC6 is involved in the proliferation of RA-FLS induced by IL-1β. Silencing ofTRPC6 gene inhibits the growth of RA-FLS induced by IL-1β．

Transient receptor potential channel 6; Rheumatoid arthritis; Synoviocytes; Cell proliferation

1000- 4718(2017)04- 0627- 08

2016- 11- 17

2017- 01- 20

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81470205)；廣州市屬高?？蒲杏媱?No. 2012C043)

R363.2; R593.22

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.009

△通訊作者 黃建榮 Tel: 020-82725271; E-mail: guke16@163.com； 李建華 Tel: 020-37103061; E-mail: lijianh@hotmail.com