盛 瓊， 翁 平， 張曉彤， 田文芳， 陳俊良， 苑佳佳， 陳新杰， 龐慶豐

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院， 江蘇 無錫 214122)

亞甲藍(lán)減輕大鼠離體心臟缺血/再灌注引起的線粒體損傷*

盛 瓊， 翁 平， 張曉彤， 田文芳， 陳俊良， 苑佳佳， 陳新杰， 龐慶豐△

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院， 江蘇 無錫 214122)

目的： 探討亞甲藍(lán)(methylene blue, MB)對大鼠離體心臟缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)線粒體損傷的作用。方法：將Spragure-Dawley大鼠隨機(jī)分為對照組(control組)、I/R模型組和MB治療組(I/R+MB組)，建立Langendorff離體心臟灌注模型(n=6)。手術(shù)前2 h，MB組大鼠按2 mg/kg腹腔注射MB。對照組持續(xù)灌注K-H液110 min，I/R組與I/R+MB組平衡灌注20 min后停灌30 min，再灌注60 min。實(shí)時(shí)記錄心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室最大壓力變化速率(±dp/dtmax)和左室舒張末壓(LVEDP)。測定冠脈流出液中肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)活性。測定心肌組織中活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)和三磷酸腺苷(ATP)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)活性。蘇木精-伊紅染色觀察組織病理學(xué)變化。分離心肌組織線粒體，測定線粒體腫脹程度和線粒體膜電位(MMP)。結(jié)果：與對照組相比，I/R組的心功能惡化，冠脈流出液中的CK-MB和LDH活性升高，心肌組織中的ROS和MDA增加，SOD活性降低，ATP減少，線粒體腫脹程度升高，MMP下降(P<0.05)；與I/R組相比，I/R+MB組的心功能改善，CK-MB和LDH的釋放減少，組織中的ROS和MDA減少，SOD活性和ATP含量升高，線粒體腫脹程度降低，MMP升高(P<0.05)。結(jié)論：MB通過減輕線粒體損傷對大鼠離體I/R心臟發(fā)揮保護(hù)作用。

亞甲藍(lán)； 離體心臟； 缺血/再灌注； 線粒體

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，如心臟移植、動(dòng)脈搭橋術(shù)、溶栓療法、心肌梗塞后再通、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)、心肺腦復(fù)蘇術(shù)和體外循環(huán)心臟外科手術(shù)，均會(huì)發(fā)生心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[1]。因此，尋找理想的治療藥物是防治手術(shù)中心肌I/R損傷的重要工作。

目前研發(fā)的抗氧化劑清除氧自由基的能力不斷增強(qiáng)，但臨床使用效果并不理想。尋找新的抗氧化損傷措施是防治心肌I/R損傷的緊要任務(wù)。強(qiáng)抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)，其氧化還原電位越低，一般均在-0.4 V與-0.2 V之間。一旦強(qiáng)抗氧化劑從線粒體復(fù)合體I獲取電子后，不容易向呼吸鏈中的鐵硫蛋白、泛醌、細(xì)胞色素b、細(xì)胞色素C等電子傳遞體釋放電子，電子傳遞活動(dòng)停止，氧化磷酸化過程障礙，ATP合成不足，無法對抗氧化應(yīng)激造成的組織損傷[2]。亞甲藍(lán)(methylene blue, MB)的氧化還原電位僅為10 mV，接近于零，屬于弱抗氧化劑，在臨床上廣泛用于亞硝酸鹽及苯胺類和氰化物引起的中毒。本課題組發(fā)現(xiàn)MB通過其抗氧化特性減輕百草枯中毒引起的大鼠肝損傷[3]。近來研究表明，MB通過增加細(xì)胞色素C氧化酶的活性，促進(jìn)ATP產(chǎn)生，對缺血造成的損傷的腦組織發(fā)揮保護(hù)作用[4-5]；MB通過增強(qiáng)組織抗氧化能力減輕大鼠腎I/R損傷[6]；MB能夠減輕腸I/R引起的肝臟線粒體功能障礙[7]；然而，MB對I/R心臟的保護(hù)作用尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本文擬研究MB對離體心臟I/R的作用及其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

清潔級Sprague-Dawley雄性大鼠，體重250～300 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號為2015000505720。PowerLab/8SP離體心臟灌流系統(tǒng)(ADInstruments)。肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase-MB isoenzyme, CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；組織線粒體分離試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；722可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；顯微鏡(Olympus)；亞甲藍(lán)(江蘇濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán))。K-H液(mmol/L)：NaCl 118.5, NaHCO324.8, D-glucose 11, KCl 4.7, MgSO41.2, KH2PO41.2, CaCl22.25, pH 7.4。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組與模型建立 SD雄性大鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只：(1)正常對照組(control組), 持續(xù)灌流K-H液110 min；(2)缺血再灌注組(I/R組), K-H液平衡灌流20 min后，37 ℃全心停灌30 min，再灌注60 min；(3)MB 處理組(I/R+MB組)，大鼠于手術(shù)前2 h腹腔注射溶解于生理鹽水、濃度為1 g/L的MB (2 mg/kg)[3]，K-H液平衡灌流20 min后，37 ℃全心停灌30 min，再灌注60 min。

3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉SD雄性大鼠；開胸后迅速摘取心臟放入冰水混合狀態(tài)的K-H液中使心臟驟停，經(jīng)主動(dòng)脈將心臟懸掛于Langendorff灌流裝置上，用K-H液恒溫37 ℃逆行灌流，灌流液通95% O2、5% CO2混合氣體。將一球囊插入左心室，球囊與壓力轉(zhuǎn)換器連接，通過生物信號采集處理系統(tǒng)，連續(xù)記錄左心室收縮功能曲線，記錄左心室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)，左心室舒張末壓(left ventricle end-diastolic pressure，LVEDP)，左心室最大壓力變化速率(left ventricular pressure maximum change rate，±dp/dtmax)和心率(heart rate，HR)等指標(biāo)。

2.2 病理組織切片 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，4%甲醛固定心臟組織，常規(guī)石蠟包埋、制片、蘇木素-伊紅(HE)染色。

2.3 冠脈流出液中CK-MB及LDH活性檢測 收集再灌注末冠脈流出液，按照試劑盒說明檢測冠脈流出液中CK-MB和LDH的活性。

2.4 心肌組織生化指標(biāo)測定 取灌流后的心肌組織，按照MDA、ATP和SOD試劑盒說明，測定各實(shí)驗(yàn)組心臟組織中MDA和ATP含量以及SOD活性。

2.5 心肌組織ROS水平的檢測 心肌組織制成5%的勻漿，1 000×g離心取上清，用BCA法測定蛋白濃度。測定孔取190 μL上清液加入 1 mmol/L DCFH-DA工作液10 μL，對照孔取190 μL上清液加入PBS 10 μL，37 ℃孵育30 min，分別選取485 nm和525 nm作為激發(fā)波長和發(fā)射波長測定其熒光強(qiáng)度。

2.6 線粒體腫脹程度 取灌流后心肌組織，按照組織線粒體分離試劑盒說明，分離心肌組織線粒體，線粒體置于重懸液中；配制線粒體腫脹液(mmol/L)：sucrose 125, KCl 50, KH2PO42, HEPES 10, pH 7.4。用線粒體腫脹液稀釋分離出的線粒體至蛋白濃度為0.5 g/L，加入200 μmol/L CaCl2，30 ℃條件下用紫外分光光度計(jì)檢測540 nm處的吸光度，持續(xù)記錄10 min。吸光度的下降反映線粒體腫脹程度[8]。

2.7 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)檢測 配制膜電位緩沖液(mmol/L)：甘露醇 225, 蔗糖70, HEPES 5, KH2PO44, MgCl22, Rh123 3×10-4, pH 7.2。心肌線粒體加入2 mL膜電位緩沖液，使線粒體蛋白終濃度為0.5 g/L，調(diào)整熒光分光光度計(jì)為激發(fā)波長503 nm, 發(fā)射波長525 nm。加入40 μmol/L CaCl2誘導(dǎo)Rh123釋放。記錄熒光值[9]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 左心室血流動(dòng)力學(xué)記錄

再灌注30 min和60 min時(shí)，與對照組相比，I/R組的LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax顯著降低，LVEDP顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與I/R組相比，I/R+MB組的LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax顯著增加，而LVEDP顯著減少(P<0.05)，見表1。

表1 左心室血液動(dòng)力學(xué)

*P<0.05vsbaseline；△P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsI/R group.

2 心臟組織病理學(xué)改變

對照組的心肌細(xì)胞排列整齊，心肌橫紋比較清晰；I/R組的心肌纖維排列紊亂，心肌有斷裂，核碎裂、消失，胞質(zhì)均質(zhì)紅染及呈不規(guī)則粗顆粒狀，間質(zhì)水腫，心肌纖維間可見大量炎細(xì)胞浸潤；I/R+MB組的心肌細(xì)胞損傷較I/R組明顯減輕，見圖1。

Figure 1.The effects of methylene blue (MB) on the histopathological changes of heart tissues after I/R (HE staining, ×400).

圖1 各組大鼠離體心臟病理學(xué)改變

3 冠脈流出液及心肌組織中生化指標(biāo)水平

同對照組相比，I/R組冠脈流出液中的CK-MB和LDH活性顯著增加，心肌組織中的ROS和MDA含量增加，SOD活性降低(P<0.05)。與I/R相比，I/R+MB組流出液中的CK-MB和LDH活性顯著降低(P<0.05)，心肌組織中的ROS和MDA產(chǎn)生較I/R組顯著減少，SOD活性顯著增加(P<0.05)，見表2。

表2 MB對離體心臟I/R模型生化指標(biāo)的影響

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group.

4 線粒體腫脹程度、MMP和ATP含量

與對照組相比，I/R組的吸光度變化值增大(P<0.05)，I/R+MB組與I/R組相比，吸光度變化減少(P<0.05)。該結(jié)果提示I/R可引起線粒體腫脹，而MB能減輕了線粒體腫脹，見圖2。與對照組相比，I/R組MMP降低，ATP生成減少(P<0.05)。I/R+MB組與I/R組相比，MMP顯著增加，ATP生成增加(P<0.05)，見圖3、4。

Figure 2.The effect of methylene blue (MB) on the mitochondrial swelling levels in the rat heart tissues after I/R. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group.

圖2 I/R后大鼠心臟組織中線粒體腫脹程度變化

討 論

與其他研究各種強(qiáng)還原劑對I/R心臟的保護(hù)作用不同，本研究首次探討了弱還原劑MB對大鼠離體I/R心臟的保護(hù)作用，獲得主要研究結(jié)果如下：(1)MB能有效減輕I/R大鼠離體心臟的血流動(dòng)力學(xué)異常以及形態(tài)學(xué)變化；(2)MB能夠減輕心肌組織中MDA含量，增加SOD活性；(3)MB能夠抑制線粒體腫脹，恢復(fù)線粒體膜電位，促進(jìn)線粒體ATP生成。這些結(jié)果提示MB能夠通過增強(qiáng)線粒體的功能，降低離體心臟的I/R損傷。

Figure 3.The effect of methylene blue (MB) on the changes of MMP in the rat heart tissues after I/R. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group.

圖3 I/R后大鼠心臟組織中MMP變化

Figure 4.The effect of methylene blue (MB) on the change of ATP contents in the rat heart tissues after I/R. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group.

圖4 I/R后大鼠心臟組織中ATP含量變化

線粒體損傷是心臟I/R發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制[10]，而抗氧化劑是治療心臟I/R的關(guān)鍵藥物[11]。但目前研發(fā)的抗氧化劑尚不能有效治療心臟的I/R損傷。超氧化物歧化酶和過氧化物酶因無法穿過生物膜而作用受限[12]?？寡趸幬锞S生素C因加速羥自由基的產(chǎn)生，有可能反而加重氧化損傷[13]。MB作為一種小分子，容易通過生物膜，可以快速地發(fā)揮藥效[14]。以往研究認(rèn)為MB是鳥苷酸環(huán)化酶競爭性抑制劑，通過作用于NO/cGMP通路減輕心臟I/R[15]。本研究發(fā)現(xiàn)MB能夠通過減輕線粒體損傷而減輕心臟I/R損傷，可能揭示了MB減輕心臟I/R損傷的新機(jī)制。

心功能是反映I/R損傷程度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過離體心臟Langendorff灌注模型，觀測MB對I/R的大鼠離體心臟的血流動(dòng)力學(xué)以及心肌酶的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：同對照組相比，I/R組大鼠離體心臟再灌注期的±dp/dtmax絕對值和LVDP顯著減少，而LVEDP顯著增加，說明I/R損傷模型成功。MB能夠減輕I/R導(dǎo)致的心臟損傷，使再灌注期±dp/dtmax的絕對值和LVDP顯著增加，LVEDP顯著降低，提示MB能夠有效改善I/R導(dǎo)致的心功能障礙。病理形態(tài)學(xué)檢查也發(fā)現(xiàn)MB可以減輕I/R導(dǎo)致的形態(tài)學(xué)異常。

心肌I/R導(dǎo)致線粒體功能嚴(yán)重障礙，主要表現(xiàn)有線粒體腫脹、MMP降低和ATP生成減少[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MB可有效地增加I/R心肌細(xì)胞線粒體中ATP的生成；同時(shí)降低線粒體腫脹程度和維持MMP。這些結(jié)果提示MB對心肌I/R的線粒體損傷有理想的對抗作用。

心肌I/R可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜損傷，出現(xiàn)細(xì)胞膜完整性破壞、通透性增加、大量心肌酶外漏等病理過程。心肌酶CK-MB是反映心肌細(xì)胞受損程度的重要指標(biāo)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MB可以減少I/R引起的心肌組織中CK-MB的外漏，提示MB可以減輕I/R時(shí)心肌細(xì)胞的破壞，保護(hù)心肌組織。

大量研究表明，心臟I/R時(shí)會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)大量的氧自由基產(chǎn)生，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA。MDA破壞細(xì)胞膜，使得大量Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，甚至引起細(xì)胞死亡[18]。因此，MDA的含量變化可間接反映細(xì)胞受自由基損傷的破壞程度。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的重要物質(zhì)，其活性變化也可間接反映機(jī)體對氧自由基的清除能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明I/R組心肌組織中的MDA含量增加，而SOD活性降低。而與I/R組相比，I/R+MB組的心肌組織中的MDA含量降低，SOD活性增加。說明心臟I/R導(dǎo)致大量自由基產(chǎn)生，引起心肌損傷；MB可以加快氧自由基的清除，減少脂質(zhì)過氧化作用達(dá)到心肌保護(hù)的效果。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)MB通過減輕線粒體損傷對大鼠離體I/R心臟發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能為防治心肌I/R損傷提供一種新的、有效的方法。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Protective effects of methylene blue on ischemia/reperfusion-induced mitochondrial injury in isolated rat hearts

SHENG Qiong, WENG Ping, ZHANG Xiao-tong, TIAN Wen-fang, CHEN Jun-liang, YUAN Jia-jia, CHEN Xin-jie, PANG Qing-feng

(WuxiMedicalSchool,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China.E-mail:qfpang@jiangnan.edu.cn)

AIM: To study the effects of methylene blue (MB) on myocardial ischemia/reperfusion (I/R)-induced mitochondrial injury in isolated rat hearts. METHODS: Spragure-Dawley (SD) rats were divided into 3 groups randomly (n=6): control group, I/R model group and MB treatment group (IR+MB group). The isolated rat hearts were prepared and set up to Langendorff perfusion. The rats in I/R+MB group received MB (2 mg/kg) by intraperitoneal injection 2 h before operation. The hearts in control group were perfused with K-H solution for 110 min consecutively. The hearts in I/R group and I/R+MB group were in equilibrium for 20 min, following by 45 min of global ischemia, and then reperfused for 60 min. The heart rate (HR), left ventricular developed pressure (LVDP), left ventricular pressure maximum change rate (±dp/dtmax) and left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) were recorded. The perfusate was collected to determine the activity of creatine kinase-MB (CK-MB) and lactate dehydrogenase (LDH). The contents of reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA) and adenosine triphosphate (ATP), and the activity of superoxide dismutase (SOD) in the myocardial tissues were all determined. Histopathological examination of left ventricle was performed. The mitochondria from the heart tissues was isolated and the mitochondrial swelling and mitochondrial membrane potential (MMP) were analyzed. RESULTS: Compared with control group, the hearts in I/R group showed poorer function, higher CK-MB and LDH levels in the perfusate, increased ROS and MDA contents， higher SOD activity and less ATP content in the heart tissues (P<0.05). Furthermore, the mitochondrial swelling level increased and MMP reduced in I/R group (P<0.05). Compared to I/R group, MB improved heart function and reduced the release of CK-MB and LDH (P<0.05). MB also decreased ROS and MDA contents, and increased the activity of SOD and the content of ATP (P<0.05). In addition, MB alleviated mitochondrial swelling and restored the reduced MMP (P<0.05). CONCLUSION: MB protects the isolated rat hearts from I/R-induced injury by attenuating the damage of mitochondria.

Methylene blue; Isolated heart; Ischemia/reperfusion; Mitochondria

1000- 4718(2017)04- 0711- 06

2016- 11- 01

2017- 02- 13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270126)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(No. JUSRP51412B)； 江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程項(xiàng)目(No. KYZZ16_0312； No. KYLX15_1196)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No. 201610295074)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.022

△通訊作者 Tel： 0510-85328363； E-mail: qfpang@jiangnan.edu.cn