張百平， 孫樹凱， 賈 棟

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經外科，陜西 西安 710038)

CBX8過表達或沉默對人神經膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響

張百平， 孫樹凱， 賈 棟△

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經外科，陜西 西安 710038)

目的： 探究染色質結構域蛋白8(chromodomain protein 8，CBX8)對人神經膠質瘤細胞增殖與凋亡的作用。方法: Western blot和RT-qPCR檢測組織及細胞系中CBX8的表達。構建過表達CBX8和沉默CBX8載體，轉染神經膠質瘤細胞T98G和U87MG，分別用MTT法和BrdU實驗檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡。結果: 與正常腦組織和星形膠質細胞相比，神經膠質瘤組織及細胞中的CBX8蛋白和mRNA水平明顯上升。在T98G和U87MG細胞中，過表達CBX8均促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，并上調Rb/E2F1的表達水平，而沉默CBX8則作用相反。sh-E2F1轉染細胞之后，cyclin D1的表達以及Bcl-2/Bax的比值降低。結論: CBX8可能通過Rb/E2F1通路調節(jié)膠質瘤細胞的增殖和凋亡。

神經膠質瘤； 色素框同源物8； T98G細胞； U87MG細胞

神經膠質瘤亦稱膠質細胞瘤，是最常見的顱內腫瘤，因其較高的致死率成為眾所周知的惡性腫瘤[1-2]。目前臨床上以手術治療為主，輔以放療及化療等綜合治療，但是由于膠質瘤的惡性程度高，呈浸潤性生長，與周圍正常腦組織無明顯分界，因此，手術治療的效果并不理想。近年來，越來越多的人開始研究膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的分子生物學機制，致力于為膠質瘤的診斷和治療尋找新的途徑[3-4]。染色質結構域蛋白8(chromodomain protein 8，CBX8)，是多梳基因抑制復合物1(polycomb repressive complex 1，PRC1)的成員之一[5]，它的異常表達與癌細胞的增殖和遷移密切相關[6]。最近的研究表明，CBX8在神經膠質瘤組織中高表達[7]，但其是否促進膠質瘤細胞的增殖及其相關機制尚無明確報道。因此，本文通過構建CBX8過表達和沉默載體，檢測其對膠質瘤細胞增殖、凋亡和p-Rb/E2F1表達等的影響，旨在探究CBX8表達對神經膠質瘤細胞增殖凋亡的影響及其相關機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人正常腦組織(20例)和膠質瘤組織(24例)均由唐都醫(yī)院神經外科提供；人膠質母細胞瘤細胞系U87MG和T98G，以及HEK293T細胞均來源于ATCC；人胎腦星形膠質細胞(Cell Applications Inc.)；DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗(含5×104U/L青霉素和50 mg/L鏈霉素)和胎牛血清(Gemini)；MTT、二甲基亞砜(DMSO)和LipofectamineTM2000 脂質體轉染試劑盒(Invitrogeo);兔抗人CBX8、p-Rb、E2F1、cyclin D1、Bcl-2和Bax多克隆抗體，鼠抗人β-actin單克隆抗體(Abcam)；羊抗鼠HRP標記的II抗、ECL顯色試劑盒和BCA試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

2 實驗方法

2.1 組織樣本采集 標本采集時先切成小塊，然后迅速置于凍存管中在-80 ℃下保存。其中，正常腦組織均為內減壓切除的標本，膠質瘤病例均經組織病理學檢查證實為膠質瘤，并按WHO神經系統(tǒng)腫瘤分類標準確定病理診斷和分級[8]。所有組織采集前均得到病人及其家屬的知情同意，并通過唐都醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準。

2.2 細胞培養(yǎng) HEK293T細胞、人膠質母細胞瘤細胞系U87MG和T98G采用含10%胎牛血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，人胎腦星形膠質細胞采用星形膠質細胞生長培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 載體的構建 參照文獻方法[9]完成，以健康人腦組織總RNA為模板，采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法獲得CBX8的cDNA，并與Flag標記的pcDNA3和pEGFP-C3載體連接，構建Flag-CBX8表達載體，測序鑒定正確后中量制備待用。

CBX8和E2F1重組腺病毒用pAdEasy系統(tǒng)構建[5]，將Flag標記的CBX8和E2F1亞克隆至pAdTrack-CMV質粒上，再與pAdEasy腺病毒骨架質粒重組，得到重組腺病毒載體，再轉染至HEK293T細胞進行擴增與純化。利用Adeno-X快速滴度試劑盒(Clontech)測定病毒滴度。CBX8和E2F1 shRNA病毒滴度均為5×1011TU/L。

2.4 細胞轉染 取對數(shù)生長期的U87MG細胞和T98G細胞以5×105/cm2接種于6孔板，將細胞分為6組：空白對照組(mock組)、陰性對照組(Flag-empty組)和CBX8過表達組(Flag-CBX8組)；空白對照組(mock組)、陰性對照組(sh-Luc組)和CBX8沉默組(sh-CBX8組)。次日，按分組轉染細胞，F(xiàn)lag-empty和Flag-CBX8每孔3 μg，脂質體6.6 μL；sh-Luc和sh-CBX8的感染復數(shù)為200。

2.5 MTT檢測細胞活力 分別取轉染0 h、48 h、72 h和96 h的細胞，PBS清洗，加入MTT反應液，37 ℃溫育4 h，每孔加150 μL 二甲基亞砜液，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結晶物溶解，酶標儀570 nm測吸光度值。

2.6 BrdU檢測細胞增殖 取轉染48 h的細胞，將細胞以每孔5×103個接種至96孔板內，24 h后進行BrdU檢測。按照BrdU細胞增殖檢測試劑盒檢測的步驟進行操作。

2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 取轉染48 h的細胞，PBS清洗，按照 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒參照說明書操作，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡。

2.8 Westen blot檢測蛋白表達 取適量人腦組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃下用抗CBX8和β-actin(均為1∶300)I 抗孵育過夜，PBST洗膜3次，II 抗(均為1∶300)室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，最后用ECL發(fā)光液在暗室曝光并壓片。

取轉染48 h的細胞，BCA法測定蛋白濃度。按照上述方法分析CBX8、caspase-3、p-Rb和E2F1蛋白的表達水平。

取對數(shù)期U87MG和T98G細胞以5×105/cm2接種于6孔板，分別將細胞分為5組：空白對照組(mock組)、陰性對照組(Flag-empty組)、CBX8過表達組(Flag-CBX8組)、E2F1沉默組(sh-E2F1組)和CBX8過表達同時沉默E2F1組(Flag-CBX8+sh-E2F1組)。按分組轉染細胞，48 h后提取細胞總蛋白，按上述方法分析cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白的表達水平。

2.9 實時熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測mRNA的表達 Trizol法分別提取人正常腦組織和膠質瘤組織的總RNA，并檢測其純度以及完整性。參照逆轉錄試劑盒說明書生成cDNA，擴增cDNA，CBX8基因擴增成功后，采用比較Ct值法(2-ΔΔCt)對CBX8含量進行定量分析。RT-qPCR反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次；72 ℃ 7 min。引物由上海生工生物工程公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

分別取轉染48 h的細胞，Trizol法提取總RNA，按照上述方法分析E2F1的mRNA表達水平。

取對數(shù)期U87MG細胞和T98G細胞以5×105/cm2接種于6孔板，分別將細胞分為5組：空白對照組(mock組)、陰性對照組(Flag-empty組)、CBX8過表達組(Flag-CBX8組)、E2F1沉默組(sh-E2F1組)和CBX8過表達同時沉默E2F1組(Flag-CBX8+sh-E2F1組)。按分組轉染細胞，48 h后提取細胞總RNA，按上述方法分析cyclin D1、Bcl-2和Bax mRNA的表達水平。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料結果用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 人神經膠質細胞瘤中CBX8蛋白與mRNA的表達水平上調

Western blot結果顯示，與正常腦組織相比，神經膠質瘤組織(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級腫瘤組織)中CBX8蛋白的表達顯著上升，各級膠質瘤組織中CBX8的表達并無明顯差異；與星形膠質細胞相比，神經膠質瘤細胞系中CBX8蛋白表達水平也明顯上升。RT-qPCR結果與Western blot結果一致，神經膠質瘤組織和神經膠質瘤細胞系中的CBX8 mRNA的表達水平明顯上調(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of CBX8 in the glioma tissue (A) and glioma cell lines (B) validated by Western blot and RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal；#P<0.05vsastrocytes.

圖1 膠質瘤組織以及膠質瘤細胞系中CBX8的表達

2CBX8過表達促進人腦膠質瘤細胞的增殖

Western blot結果顯示，按實驗分組感染T98G細胞與U87MG細胞后，與對照組相比，過表達組細胞CBX8 蛋白表達量增加(圖2A)，沉默組細胞CBX8 蛋白表達量下降(圖2B)。

MTT結果顯示，與對照組相比，CBX8過表達的T98G細胞和U87MG細胞的活力明顯上升。而CBX8沉默的T98G和U87MG細胞活力顯著下降(P<0.05)。BrdU實驗與MTT實驗的結果一致，表明CBX8促進人腦膠質瘤細胞的增殖，見圖2C、D。

Figure 2.The effects of CBX8 on the proliferation of T98G and U87MG cells. Flag-CBX8 (A) and sh-CBX8 (B) were transfected into T98G cells and U87MG cells, and Western blot was used to determine the CBX8 expression after transfection for 48 h. The proliferation of the T98G cells and U87MG cells was detected by MTT assay and BrdU staining after Flag-CBX8 (C) or sh-CBX8 (D) transfection for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmock.

圖2 CBX8對膠質瘤T98G細胞和U87MG細胞增殖的影響

3CBX8過表達抑制人腦膠質瘤細胞的凋亡

流式細胞術分析結果顯示，與對照組相比，CBX8過表達的T98G細胞和U87MG細胞早期凋亡以及晚期凋亡百分比都明顯下降，而CBX8沉默的T98G細胞和U87MG細胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，見圖3A、B。

另外，Western blot結果顯示，與對照組相比，CBX8過表達的T98G細胞和U87MG細胞中凋亡蛋白caspase-3的表達顯著降低，而CBX8沉默的T98G和U87MG細胞中caspase-3蛋白的表達則顯著升高(P<0.05)，見圖3C、D。這些結果表明，CBX8抑制人腦膠質瘤細胞的凋亡。

4CBX8過表達通過上調Rb/E2F1通路促進人腦膠質瘤細胞增殖

Western blot 結果顯示，與對照組相比，CBX8過表達使T98G和U87MG細胞內p-Rb和E2F1的蛋白水平都顯著上升。而CBX8沉默使細胞內p-Rb和E2F1的蛋白水平都顯著下降。另外，CBX8過表達顯著提高了cyclin D1和Bcl-2/Bax比值，E2F1 shRNA則使其水平明顯降低，而在沉默E2F1的前提下，CBX8過表達對cyclin D1和Bcl-2/Bax的水平并沒有影響(P<0.05)。RT-qPCR結果與Western blot結果一致，可見，CBX8過表達可能通過上調E2F1通路促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，見圖4。

Figure 3.The effects of CBX8 on the apoptosis of T98G cells and U87MG cells. Flag-CBX8 and sh-CBX8 were transfected into the T98G cells and U87MG cells. The apoptosis of T98G cells and U87MG cells was detected by flow cytometry after Flag-CBX8 (A) or sh-CBX8 (B) transfection for 48 h. The expression of cleaved caspase-3 protein was detected by Western blot after Flag-CBX8 (C) or sh-CBX8 (D) transfection for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmock.

圖3 CBX8對膠質瘤T98G細胞和U87MG細胞凋亡的影響

討 論

神經膠質瘤是常見的顱內腫瘤，由于無法控制的細胞增殖、腫瘤細胞的侵襲性以及新生血管生長等生物學行為，而面臨嚴峻的治療難題[10]。PcG蛋白是在果蠅體內發(fā)現(xiàn)的第一個通過染色質修飾調控靶基因的轉錄抑制子的蛋白，分為PRC1和PRC2兩種蛋白復合物。PcG蛋白的異常狀態(tài)能夠導致癌癥的發(fā)生[11-12]。CBX8又叫多梳蛋白3(polycomb protein，HPC3)，在PRC1中作為轉錄抑制因子，可與BMI1相互結合[6, 13]。近年來，CBX8對細胞功能的調節(jié)作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，有研究表明，CBX8沉默通過促進INK4A-ARF通路調節(jié)纖維細胞增殖[14]。在結腸癌中，CBX8沉默明顯抑制細胞的增殖[6]。然而CBX8在神經膠質瘤細胞中的作用目前尚不清楚，本文旨在研究CBX8對神經膠質瘤細胞增殖凋亡的影響及其相關機制。

Figure 4.The effects of CBX8 on the expression of Rb/E2F1 in T98G and U87MG cells. Flag-CBX8, sh-CBX8 and sh-E2F1 were transfected into the T98G cells and U87MG cells. The effects of Flag-CBX8 (A) and sh-CBX8 (B) on the expression of Rb/E2F1 in the T98G cells and U87MG cells were determined by Western blot and RT-qPCR after transfection for 48 h. The effects of sh-E2F1 and Flag-CBX8 on cyclin D1, Bcl-2 and Bax levels in the T98G cells (C) and U87MG cells (D) were detected by Western blot and RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmock.

圖4 CBX8對膠質瘤T98G細胞和U87MG細胞中Rb/E2F1表達的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，PcG蛋白在神經膠質瘤中異常表達，其中CBX7、CBX6等表達顯著降低，而CBX8表達顯著升高，并且CBX6過表達顯著抑制膠質瘤細胞的增殖[7]。本實驗結果表明，與正常腦組織及人胚腦星形膠質細胞相比，神經膠質瘤組織及細胞中的CBX8蛋白和mRNA水平明顯上升，這可能與神經膠質瘤的發(fā)展有著密切的關系。因此，本實驗將CBX8過表達和沉默載體轉染入神經膠質瘤T98G細胞和U87MG細胞，檢測細胞增殖凋亡情況，結果顯示，過表達CBX8促進膠質瘤細胞增殖并抑制細胞凋亡，而沉默CBX8抑制膠質瘤細胞增殖并促進細胞凋亡。

Rb基因家族處于細胞周期調控的中心環(huán)節(jié)，在細胞生長和分化的調控中發(fā)揮重要作用。E2F1作為重要的細胞周期調控因子，與Rb共同參與調控細胞由G0/G1期向S期的過渡[15]。研究表明，E2F1通過調節(jié)細胞周期促進膠質瘤細胞的增殖[16]，而CBX8能夠通過Rb-E2F1通路調節(jié)白血病細胞衰老[5]。作為周期蛋白，cyclin D1的過度表達會使細胞周期失控，從而導致惡性轉化[17]。因此，cyclin D1已經作為抑制腫瘤細胞增殖的靶分子被廣泛研究[18-19]。過表達CBX8提高cyclin D1的表達，使細胞G1期縮短，持續(xù)增殖。細胞程序性死亡的調節(jié)因子Bcl-2與Bax的比值反映了膠質瘤細胞增殖或凋亡的過程，當Bcl-2/Bax比值增大，細胞趨向增殖[20]。本實驗結果表明，CBX8過表達促進膠質瘤細胞系Rb/E2F1通路的激活;反之，CBX8沉默顯著降低細胞中Rb/E2F1的激活。另外，CBX8過表達顯著提高了cyclin D1和Bcl-2/Bax的水平，E2F1 shRNA則使其水平明顯降低，而在沉默E2F1的前提下，CBX8過表達對cyclin D1和Bcl-2/Bax的水平并沒有影響。因此，結合參考文獻我們推測，CBX8可能通過Rb/E2F1通路，調節(jié)相關蛋白cyclin D1、Bcl-2和Bax的表達，從而調控神經膠質瘤細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，本研究通過構建過表達和沉默CBX8載體并轉染神經膠質瘤細胞T98G和U87MG，發(fā)現(xiàn)CBX8可通過激活Rb/E2F1通路促進T98G和U87MG細胞增殖并抑制細胞凋亡。這一結果初步闡明了CBX8誘導神經膠質瘤發(fā)生的相關機制，為神經膠質瘤的治療提供了新思路。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of silencing and overexpression of CBX8 on proliferation and apoptosis of human glioma cells

ZHANG Bai-ping, SUN Shu-kai, JIA Dong

(DepartmentofNeurosurgery,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China.E-mail:shidasda@163.com)

AIM: To explore the effects of chromodomain protein 8 (CBX8) on the proliferation and apoptosis of human glioma cells. METHODS: The expression of CBX8 in the tissues and cells was detected by Western blot and RT-qPCR. The overexpression (Flag-CBX8) and silencing (sh-CBX8) vectors ofCBX8 were constructed and transfected into glioma T98G cells and U87MG cells. The cell proliferation was detected by MTT assay and BrdU staining. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The protein expression of Rb/E2F1 was detected by Western blot. RESULTS: Compared with normal brain tissues and astrocytes, the expression of CBX8 was increased in the glioma tissues and glioma cells. Overexpression ofCBX8 promoted the cell proliferation, inhibited the cell apoptosis, and upregulated the protein levels of Rb/E2F1. On the contrary, silencing ofCBX8 inhibited the cell proliferation, promoted the cell apoptosis, and decreased the protein levels of Rb/E2F1 in the T98G cells and U87MG cells. Moreover, the expression of cyclin D1 and Bcl-2/Bax ratio were reduced after transfection with sh-E2F1 in the T98G cells and U87MG cells.CONCLUSION: CBX8 may regulate the proliferation and apoptosis of glioma cells through Rb/E2F1 pathway.

Glioma; Chromodomain protein 8; T98G cells; U87MG cells

1000- 4718(2017)04- 0723- 07

2016- 11- 23

2016- 12- 29

R730.23; R739.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.024

△通訊作者 Tel: 13519182336； E-mail： shidasda@163.com