雷亞梅， 范蕊芳， 許藝川， 賴文興， 林東軍

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510630)

替米沙坦抑制U937細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡*

雷亞梅， 范蕊芳， 許藝川， 賴文興， 林東軍△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510630)

目的： 探討替米沙坦對(duì)U937細(xì)胞株的生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。方法: 分別以不同濃度的替米沙坦處理人類急性髓系白血病細(xì)胞U937；以CCK-8法檢測(cè)不同濃度替米沙坦對(duì)U937細(xì)胞的生長抑制作用；以集落形成實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度替米沙坦對(duì)U937細(xì)胞集落形成能力的影響；以Annexin V-PI雙染法及Hoechst 33342染色法檢測(cè)不同濃度替米沙坦作用前后U937細(xì)胞凋亡程度的變化；以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U937細(xì)胞表面抗原CD11b的陽性表達(dá)率，瑞氏染色后倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，了解U937細(xì)胞的分化情況；以Western blot法檢測(cè)不同濃度替米沙坦作用U937細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的改變。結(jié)果: CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)替米沙坦呈時(shí)間和劑量依賴性抑制U937細(xì)胞的生長；集落形成實(shí)驗(yàn)顯示低劑量替米沙坦可以完全抑制U937細(xì)胞的集落形成能力；Annexin V-PI雙染法及Hoechst 33342法結(jié)果證實(shí)替米沙坦可以誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡；細(xì)胞表面抗原流式檢測(cè)術(shù)及瑞氏染色結(jié)果證實(shí)替米沙坦可以促進(jìn)部分U937細(xì)胞分化；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)替米沙坦作用于U937細(xì)胞72 h后，促凋亡相關(guān)蛋白cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白的水平明顯增高。結(jié)論: 替米沙坦可以抑制細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)U937細(xì)胞部分分化，并通過caspase依賴的凋亡途徑觸發(fā)U937細(xì)胞凋亡。

替米沙坦； U937細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞分化

白血病作為一類發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚的異質(zhì)性惡性克隆性疾病，系幼稚白血病細(xì)胞大量增生浸潤并影響正常造血功能的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，主要表現(xiàn)為貧血、出血、感染等臨床癥狀。近幾年來，各種因素導(dǎo)致白血病發(fā)病率顯著升高，雖然隨著化療藥物的不斷改進(jìn)及分子靶向治療、造血干細(xì)胞移植術(shù)的逐漸開展，其生存率有所提高, 然而造血干細(xì)胞移植術(shù)由于配型嚴(yán)格、費(fèi)用較高、并發(fā)癥多且風(fēng)險(xiǎn)較大等缺點(diǎn)限制了其廣泛開展, 因而積極探索新的抗癌藥物對(duì)白血病的臨床治療及病人生存質(zhì)量顯得尤為重要。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)屬于核激素受體,是一種核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、增殖、凋亡、自噬、分化等生命活動(dòng)進(jìn)程[1]。PPARγ在多種細(xì)胞中都有豐富的表達(dá)，同樣在多種人類腫瘤細(xì)胞如腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞以及白血病細(xì)胞等均有豐富的表達(dá)。近幾年針對(duì)PPARγ及其配體在抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化作用的研究逐漸增多，其抗癌性也越來越得到重視。

替米沙坦作為一種臨床上已廣泛應(yīng)用的一線新型降壓藥物，具有高效性、長效性、低毒性等特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于心血管疾病、糖尿病腎病、高血壓腎病的治療。它是一種特異性血管緊張素Ⅱ 1型受體阻斷劑，同時(shí)也被證明是一種潛在的選擇性PPARγ部分激動(dòng)劑，主要通過阻斷腎素-血管緊張系統(tǒng)和激活PPARγ改善糖尿病合并高血壓患者的胰島素抵抗，用于治療高血壓合并糖尿病導(dǎo)致的腎臟、心臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞等功能的損害。 國內(nèi)研究證明替米沙坦通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而減少鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病的發(fā)生[2]。近年來，多項(xiàng)研究表明替米沙坦對(duì)于很多實(shí)體瘤如肺腺癌、腎癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)，該效應(yīng)主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞增殖[3-4]、阻滯腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)展[5]、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[6-7]、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬等[8]。 最近有文獻(xiàn)報(bào)道，替米沙坦能誘導(dǎo)成人T淋巴細(xì)胞白血病凋亡和自噬[9]。但目前尚無替米沙坦對(duì)人白血病U937細(xì)胞影響的相關(guān)研究報(bào)道。本課題主要研究替米沙坦對(duì)白血病U937細(xì)胞株的作用，觀察其對(duì)U937細(xì)胞增殖、分化的影響，并探討替米沙坦誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供新的思路及理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

替米沙坦、鼠抗人CD11b-PE檢測(cè)盒購于Sigma；胎牛血清、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液購于HyClone；CCK-8檢測(cè)試劑盒購于Dojindo；Annexin V-PI凋亡檢測(cè)試劑盒購于BD；各種 I 抗及 II 抗購于CST；甲基纖維素為R&D產(chǎn)品；其它生化試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品或進(jìn)口分裝產(chǎn)品。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U937細(xì)胞株來源于中山大學(xué)血液病研究所，使用含有15%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，于5% CO2、37 °C飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分組。

2.2 CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)U937細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)期生長的U937細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，接種密度為每孔1×104個(gè)細(xì)胞，分別予不同濃度(5、12.5、25、50、75、100、125和150 μmol/L)替米沙坦作用24 h、48 h和72 h，每濃度點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)前每孔加10 μL CCK-8溶液，室溫避光孵育3 h，后于酶標(biāo)儀用450 nm 波長測(cè)定吸光度(A)。

2.3 甲基纖維素細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 將空白組和藥物處理后的U937細(xì)胞培養(yǎng)于甲基纖維素中，置于5% CO2、37 °C飽和濕度條件細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，于顯微鏡下觀察U937細(xì)胞集落形成情況及計(jì)算集落形成率，并隨機(jī)拍照。

2.4 Annexin V-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，離心去上清液，預(yù)冷PBS潤洗細(xì)胞1次(1 000 r/min離心5 min)， 后100 μL 1×binding buffer 重懸細(xì)胞，避光環(huán)境中依次加入3 μL的Annexin V-FITC和3 μL的PI，微微振蕩，室溫避光條件下孵育15 min后加入200 μL 1×binding buffer，流式細(xì)胞儀檢測(cè)U937細(xì)胞凋亡率。

2.5 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 收集細(xì)胞，離心去上清后PBS潤洗細(xì)胞2次。加入Hoechst 33342(10 mg/L)染液500 μL，混勻后置于37 ℃水浴鍋中孵育15 min。然后 PBS洗細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下用紫光激發(fā)，觀察細(xì)胞的細(xì)胞核變化，計(jì)數(shù)凋亡的細(xì)胞數(shù)，并隨機(jī)拍照。

2.6 細(xì)胞表面分化抗原 CD11b的檢測(cè) 分別予不同濃度(50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L)替米沙坦作用72 h后的U937細(xì)胞按試劑說明要求，分別加入鼠抗人CD11b-PE抗體10 μL，4 °C避光孵育30 min后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U937細(xì)胞CD11b陽性表達(dá)率。

2.7 細(xì)胞形態(tài)觀察 收集不同處理的細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至5×106/L，將細(xì)胞滴入甩片機(jī)內(nèi)的載玻片小孔中，以1 800 r/min離心6 min，將細(xì)胞甩至載玻片上，風(fēng)干后用Wright’s染料染色，染A液1 min后，加入B液，混勻，染色5～8 min，在油鏡(IX41，Olympus)下觀察形態(tài)變化。

2.8 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白 收集細(xì)胞后加入含有1 μL PSMF 的RIPA 裂解液100 μL，冰上裂解細(xì)胞30 min，4 ℃預(yù)冷離心機(jī)12 000 r/min 離心15 min，提取上清液即為細(xì)胞總蛋白，后BCA法檢測(cè)蛋白濃度。予12%的SDS-PAGE 凝膠電泳分離上述蛋白，并將其轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST洗滌1次，麗春紅染色后切割目的條帶，后置于5%牛血清白蛋白封閉液中封閉1 h，加入抗體孵育4 °C過夜，TBST洗滌3次后加Ⅱ抗室溫孵育1 h。ECL(Thermo)顯影，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)分析結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較分析用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 替米沙坦對(duì)U937細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)5 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L、125 μmol/L 和150 μmol/L 終濃度的替米沙坦對(duì)U937細(xì)胞處理24 h后的細(xì)胞活力抑制率分別為(9.08±0.12)%、(14.01±0.13)%、(19.78±0.32)%、(24.06±0.13)%、(32.04±0.26)%、(44.76±0.24)%、(55.34±0.16)%和(60.27±0.38)%，IC50為109.16 μmol/L。替米沙坦對(duì)U937細(xì)胞活力的抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。隨著替米沙坦終濃度的升高和作用時(shí)間的延長，對(duì)細(xì)胞生長的抑制能力增強(qiáng)。

甲基纖維素集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過7 d培養(yǎng)，未加藥組可見集落形成率為90.00%±4.52%，經(jīng)5 μmol/L和12.5 μmol/L 處理過的細(xì)胞集落形成率分別為68.00%±3.20%和32.00%±3.75%，經(jīng)25 μmol/L 處理后的細(xì)胞未見集落形成，表明低劑量的替米沙坦已經(jīng)完全抑制了U937的集落形成能力(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.Telmisartan inhibited the proliferation of U937 cells. A: telmisartan inhibited the viability of U937 cells determined by CCK-8 assay; B: the U937 cells treated with telmisartan at various concentrations were incubated in methylcellulose culture for 7 d, and the colony formation capacity was completely suppressed. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1 替米沙坦抑制U937細(xì)胞的增殖

2 替米沙坦誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡

Annexin V-PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與實(shí)驗(yàn)組相比，50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 替米沙坦作用于U937細(xì)胞24 h的凋亡率分別為(7.08±0.18)%、(11.01±0.32)%和(21.98±0.33)%，48 h的凋亡率分別為(11.32±0.24)%、(19.80±1.00)%和(28.98±0.14)%，72 h的凋亡分別為(12.08±0.62)%、(26.54±0.56)%和(52.10±1.60)%。這表明替米沙坦對(duì)U937細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用明顯，并且U937細(xì)胞凋亡率隨著替米沙坦?jié)舛鹊脑黾雍妥饔脮r(shí)間的延長而逐漸增加。Hoechst 33342法染色結(jié)果表明，50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 替米沙坦處理了72 h的U937細(xì)胞可以在顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染，凋亡率分別為(15.00±0.16)%、(35.00±1.21)%和(58.00±0.32)%，從形態(tài)學(xué)上驗(yàn)證替米沙坦可以誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，見圖2。

3 替米沙坦對(duì)U937細(xì)胞分化的影響

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)替米沙坦誘導(dǎo)U937細(xì)胞72 h后CD11b的表達(dá)水平，結(jié)果表明0 mmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 替米沙坦作用后的CD11b表達(dá)率分別為0.313%±0.213%、12.90%±0.27%、16.10%±0.34%和30.80%±0.45%。Wright’s法染色后，于油鏡下觀察替米沙坦誘導(dǎo)72 h后U937細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞形態(tài)圖像顯示部分U937細(xì)胞具有分化的細(xì)胞學(xué)形態(tài)，表現(xiàn)為核質(zhì)比例升高、核仁減少或消失、核質(zhì)疏松和和分葉增多，見圖3。

4 替米沙坦對(duì)cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U937細(xì)胞經(jīng)過終濃度分別為50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L 的替米沙坦處理72 h后，與對(duì)照組相比，caspase-3逐漸被活化，出現(xiàn)17 kD與19 kD活化片段，PARP 被活化的caspase-3裂解出現(xiàn)89 kD的剪切片段, caspase-3活化及PARP裂解的強(qiáng)度隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，表明替米沙坦通過caspase途徑誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，見圖4。

討 論

PPAR屬于核激素受體超家族的成員，是一種核轉(zhuǎn)錄因子[10]，共有 α、β和γ 3 個(gè)亞型，在多種細(xì)胞中均有豐富的表達(dá)，與細(xì)胞生長、增殖、分化、纖維化、脂類代謝、炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)等密切相關(guān)[11]。PPARγ在多種人類腫瘤細(xì)胞如腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌以及白血病細(xì)胞等均有豐富的表達(dá)，隨著針對(duì)PPARγ及其配體在抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的研究增多[12-14]，其抗癌性也越來越得到重視。多項(xiàng)研究證明PPARγ及其配體在多種腫瘤中發(fā)揮抗癌作用，如結(jié)腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、白血病等[15-16]。最新研究表明，替米沙坦作為一種潛在的選擇性PPARγ部分激動(dòng)劑，激活受體的效應(yīng)可以達(dá)到完全激動(dòng)劑匹格列酮和羅格列酮最高水平的25%～30%[17]。Li等[18]研究證明，替米沙坦可以通過上調(diào)PPARγ抑制肺腺癌A594細(xì)胞增殖。Pu等[19]證明替米沙坦通過上調(diào)PPARγ能誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡受阻在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。目前認(rèn)為細(xì)胞外的凋亡誘導(dǎo)途徑分為caspase依賴和非caspase依賴的凋亡途徑[20]。Caspase是具有ICE/CED-3結(jié)構(gòu)特征的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用。作為目前發(fā)現(xiàn)的caspase成員中與CED-3同源性最高者，caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末執(zhí)行因子，它的激活可使細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡[21]。Caspase-3與細(xì)胞膜空泡形成、核膜破裂、染色質(zhì)聚集和邊聚及DNA斷裂等以及一些生化改變關(guān)系密切，在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí)，作用底物PARP被活化的caspase-3剪切，激活DNA內(nèi)切酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。國外研究證明替米沙坦可以通過上調(diào)PPARγ顯著抑制腎癌細(xì)胞的生長并通過活化caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦可以明顯抑制U937細(xì)胞增殖，并能誘導(dǎo)其凋亡，這種作用呈時(shí)間和劑量依賴性。Western blot結(jié)果顯示cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白水平隨著替米沙坦作用濃度的增加逐漸增加，推測(cè)替米沙坦活化凋亡蛋白酶caspase-3，活化的caspase-3進(jìn)一步剪切PARP，通過caspase依賴的凋亡途徑誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，這是替米沙坦抗腫瘤可能機(jī)制之一。細(xì)胞分化障礙與惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，研究證明許多藥物可以促進(jìn)白血病細(xì)胞分化[24]。本課題通過對(duì)替米沙坦作用后U937細(xì)胞CD11b陽性表達(dá)率的測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，顯示替米沙坦一定程度上可以促進(jìn)U937細(xì)胞分化。研究證明替米沙坦可以促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分化[25]，但目前國內(nèi)外尚無替米沙坦對(duì)腫瘤細(xì)胞分化作用的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)替米沙坦可以抑制U937細(xì)胞增殖，促進(jìn)其分化并誘導(dǎo)其凋亡，主要是通過活化caspase途徑來實(shí)現(xiàn)的。PPARγ在惡性血液腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)，PPARγ配體可以有效誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡和促進(jìn)分化[26]。因此，替米沙坦對(duì)U937的增殖抑制作用可能與PPARγ的部分激活有關(guān)，但其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究證明。

Figure 2.Telmisartan induced apoptosis in the U937 cells. A: the U937 cells treated with telmisartan were stained with Annexin V-PI and subjected to flow cytometry analysis; B: the U937 treated with different concentrations of telmisartan for 72 h were stained with Hoechst 33342 and observed under a fluorescence microscope (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2 替米沙坦誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡

Figure 3.Telmisartan induced differentiation in the U937 cells. A: the U937 treated with different concentrations of telmisartan for 72 h were subjected to flow cytometry analysis to determine the expression of CD11b; B: the images of Wright’s staining of the cells were observed under microscope (×1 000). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖3 替米沙坦誘導(dǎo)U937細(xì)胞分化

Figure 4.The effect of telmisartan on the protein levels of the apoptosis-related proteins in the U937 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖4 替米沙坦對(duì)U937細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Telmisartan inhibits proliferation and induces apoptosis in U937 cells

LEI Ya-mei, FAN Rui-fang, XU Yi-chuan, LAI Wen-xing, LIN Dong-jun

(DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:lindongjun0168@163.com)

AIM: To demonstrate the effects of telmisartan on the proliferation and apoptosis of U937 cells. METHODS: The proliferation ability of the U937 cells was assessed by CCK-8 assay and colony formation test with methylcellulose. The CD11b expression rate of the U937 cells was identified by flow cytometry. The apoptotic rate was analyzed by flow cytometry with Annexin V-PI double staining and Hoechst 33342 staining. The protein levels of cleaved PARP and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. RESULTS: The results of CCK-8 assay confirmed that the viability of U937 cells was inhibited by telmisartan. The colony formation capacity of U937 cells was also significantly inhibited by telmisartan. The differentiation of U937 cells was induced by telmisartan with the expression of CD11b. The results of flow cytometry analysis with Annexin V-PI double staining and Hoechst 33342 staining identified that the apoptosis of U937 cells was induced by telmisartan in dose-dependent and time-dependent manners with the up-regulation of cleaved PARP and cleaved caspase-3 proteins. CONCLUSION: Telmisartan inhibits the proliferation and induces the differentiation of U937 cells. Telmisartan also induces the apoptosis of U937 cells through the caspase pathway.

Telmisartan; U937 cells; Cell proliferation; Apoptosis; Cell differentiation

1000- 4718(2017)04- 0669- 07

2016- 11- 17

2017- 03- 03

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2013B021800079)

R965； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.015

△通訊作者 Tel: 020-85252777; E-mail: lindongjun0168@163.com