劉柱 華穎 徐瀟穎 陳萬(wàn)勤 趙超群 梁晶晶 丁宇琦+羅金文

摘要 建立了谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、去環(huán)氧脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的同位素稀釋超高效液相色譜線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLCQTRAPMS/MS）定性確證和定量測(cè)定方法。樣品經(jīng)乙腈水（84KG-3∶KG-516，V/V）混合溶液提取，乙腈飽和的正己烷除脂，HLB固相萃取柱凈化，WatersAtlantisT3色譜柱分離，以乙腈0.02%氨水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在負(fù)離子模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）信息依賴(lài)性采集（IDA）增強(qiáng)子離子掃描（EPI）模式檢測(cè)，在線EPI譜庫(kù)定性分析，同位素內(nèi)標(biāo)定量，在1～300μg/L濃度范圍內(nèi)，4種目標(biāo)物的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.1μg/kg，定量限為0.3μg/kg，添加5，50和200μg/kg的3個(gè)濃度水平，4種目標(biāo)物的平均回收率均在81.3%～101.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，將該技術(shù)應(yīng)用于FAPAS陽(yáng)性玉米質(zhì)控樣品和5種代表性的樣品進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速，適用于谷物及其制品中嘔吐毒素及其衍生物和代謝物的快速確證和定量測(cè)定。

關(guān)鍵詞同位素稀釋?zhuān)粐I吐毒素及其衍生物和代謝物；超高效液相色譜；線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜

1引言

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又稱(chēng)嘔吐毒素，其中3乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3AcDON）、15乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15AcDON）是其乙?；苌颷1＼]，去環(huán)氧脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DOM1）是DON在動(dòng)物或人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物；這類(lèi)毒素耐熱、耐酸堿，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在加工儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中不易被破壞[2＼]。其毒性表現(xiàn)為急性毒性、免疫毒性、細(xì)胞毒性、生殖毒性和三致作用等[3～5＼]，主要污染小麥、大麥、玉米、大米等谷物[6，7＼]，間接造成啤酒、醬油、米粉等谷物制品的污染[8＼]，部分谷物制品中含有動(dòng)物源性成分，例如嬰幼兒米粉和中老年谷物制品中會(huì)添加牛奶、雞蛋、雞肉、牛肉等，因此DOM1也成為該類(lèi)制品的污染物。食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)（JECFA）將原來(lái)針對(duì)DON的暫定每日容許最大攝入量（PTMDI）改為DON及其乙?；苌锝M的PTMDI為1μg/kgbw[9＼]。

目前，關(guān)于DON及其衍生物的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[10，11＼]、高效液相色譜法（HPLC）[12＼]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLCMS/MS）[13，14＼]，LCMS/MS結(jié)合了HPLC法的快速分離性能和質(zhì)譜高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，具高選擇性、高分辨率和高靈敏度的特點(diǎn)，能夠同時(shí)定性和定量分析多種化合物，但此法存在基質(zhì)效應(yīng)影響，當(dāng)樣品中目標(biāo)物殘留較低時(shí)，采用四級(jí)桿質(zhì)譜定性時(shí)，化合物的兩對(duì)MRM離子比率偏差較大，容易造成定性困難[15＼]。四極桿線性離子阱（QTRAP）系統(tǒng)是混合型串聯(lián)質(zhì)譜，既保留了串聯(lián)四級(jí)桿較好選擇性與靈敏度，也可作為線性離子阱增強(qiáng)二級(jí)碎片離子定性功能，其中多反應(yīng)監(jiān)測(cè)信息依賴(lài)性采集增強(qiáng)子離子掃描（MRMIDAEPI）模式，一次進(jìn)樣可得到用于定量的MRM色譜圖及用于定性的二級(jí)譜圖，與常見(jiàn)的三重四級(jí)桿掃描模式相比，增強(qiáng)了二級(jí)碎片離子掃描，更有利于增強(qiáng)復(fù)雜介質(zhì)中微量目標(biāo)化合物的定性能力[16＼]。

本研究采用固相萃取技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的富集和凈化，應(yīng)用同位素稀釋法消除基質(zhì)效應(yīng)，采用線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCQTRAPMS/MS）的MRMIDAEPI分析模式進(jìn)行檢測(cè)，并建立多能級(jí)檢索譜庫(kù)，為嘔吐毒素及其衍生物和代謝物的定性和精確定量分析提供更加準(zhǔn)確可靠的分析方法。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

ABQTRAP5500質(zhì)譜儀（美國(guó)ABSciex公司），搭配ShimadzuLC30AD超高效液相色譜儀（日本島津公司）；MilliQ超純水器（美國(guó)Millipore公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；全自動(dòng)氮吹濃縮儀（美國(guó)Biotage公司）；固相萃取裝置、WatersOasisHLB（200mg，6mL）固相萃取柱和C18固相萃取柱（500mg，6mL）（美國(guó)Waters公司）。

甲醇、乙腈（LCMS級(jí)，Merk公司）；正己烷（HPLC級(jí)，Merk公司）；氨水（HPLC級(jí)，Sigma公司）；水為MilliQ系統(tǒng)純化水；除已注明外，所用試劑均為分析純。

DON（（199.9±2.78）μg/mL，美國(guó)Smart公司）；3AcDON（（100.5±0.6）μg/mL）、15AcDON（（100.1±1.4）μg/mL）、DOM1（（50.5±1.3）μg/mL）、13C15脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（13C15DON，100μg/mL）和13C173乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（13C173AcDON，100μg/mL）均購(gòu)于Sigma公司。

2.2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別精密移取50μLDON，100μL3AcDON，100μL15AcDON和200μLDOM1至10mL容量瓶中，以乙腈定容，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000μg/L，

18℃保存，有效期6個(gè)月）；準(zhǔn)確移取1.0mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10mL容量瓶中，乙腈定容，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100μg/L）。JP

內(nèi)標(biāo)溶液配制：分別準(zhǔn)確移取100μL13C15DON和13C173AcDON同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至10mL容量瓶中，以乙腈定容，得混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液（1000μg/L，

18℃保存，有效期6個(gè)月）。

2.3樣品前處理

2.3.1提取谷物及制品：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0g（精確至0.0001g）樣品（粉碎的固體樣品或脫氣后的液體樣品），加入適量?jī)?nèi)標(biāo)溶液，混勻放置5min，加入15mL乙腈水（84KG-3∶KG-516，V/V）混合提取液，超聲提取20min，JP再用乙腈水（84KG-3∶KG-516，V/V）定容至20.0mL，10000r/min離心10min，取10.0mL上清液，待凈化。

2.3.2凈化

向待凈化的上清液中加入10mL乙腈飽和的正己烷，劇烈振蕩20min，5000r/min離心5min，棄上層正己烷萃取液后，45℃用氮?dú)獯抵两?，?mL水復(fù)溶，將復(fù)溶液經(jīng)HLB固相萃取柱（先后用5mL甲醇和5mL水活化平衡）萃取，控制流速1～2mL/min，依次用5mL水和5mL甲醇水溶液（5KG-3∶KG-595，V/V）淋洗，抽干后用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，45℃氮?dú)獯蹈?，?.0mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，超聲渦旋溶解1min，過(guò)0.22μm有機(jī)微孔濾膜后供LCMS/MS分析。

2.4超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析條件

2.4.1超高效液相色譜條件WatersAtlantisT3色譜柱（150mm×2.1mm，5.0μm，美國(guó)Waters公司）；柱溫：35℃；樣品溫度：15℃；進(jìn)樣體積：5μL；流速：0.35mL/min；流動(dòng)相：0.02%氨水溶液（A相），乙腈（B相）；梯度洗脫程序：0～5min，90%～30%A；5～6min，30%A；6～6.1min，30%～90%A；6.1～10min，90%A。

2.4.2質(zhì)譜分析條件電噴霧負(fù)離子模式，噴霧電壓4.5kV，霧化器壓力（GS1）50PSI，輔助氣壓力（GS2）50PSI離子源溫度500℃，氣簾氣壓力（CUR）40PSI；優(yōu)化后的母離子、子離子和錐孔電壓、聚焦電壓、碰撞能量等MRM相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。

采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRMIDAEPI模式檢測(cè)，在線EPI譜庫(kù)檢索輔助定性分析，同位素內(nèi)標(biāo)法定量分析，IDA參數(shù)：?jiǎn)?dòng)閥值5000CPS，采用動(dòng)態(tài)背景扣除模式；EPI參數(shù)：掃描速度10000Da/s，掃描范圍為m/z50～400Da，采用動(dòng)態(tài)填充阱集時(shí)間，不大于1ms，EPI碰撞能量（CE）：20和35eV。

3結(jié)果與討論

3.1色譜條件的優(yōu)化

選擇對(duì)極性和弱極性化合物具有較好保留能力的WatersAtlantisT3色譜柱（150mm×2.1mm，5.0μm），比較了乙腈水和甲醇水兩種流動(dòng)相，結(jié)果表明，乙腈水作為流動(dòng)相時(shí)，分離度和靈敏度都明

為進(jìn)一步提高待測(cè)化合物的離子化效率，增加靈敏度，結(jié)合目前LCMS/MS法檢測(cè)嘔吐毒素的相關(guān)報(bào)道[14，17＼]，在流動(dòng)相中添加對(duì)負(fù)離子有增強(qiáng)作用的氨水，通過(guò)比較0.01%～0.04%氨水濃度對(duì)靈敏度的影響，最終確定流動(dòng)相為乙腈0.02%氨水溶液；再優(yōu)化流動(dòng)相比例，最終選擇線性梯度洗脫，目標(biāo)物分離度較好、保留時(shí)間適中，優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

3.2MRMIDAEPI掃描模式和EPI譜庫(kù)建立

歐盟規(guī)定[18＼]，LCMS/MS法檢測(cè)有機(jī)污染物時(shí)，定性確證要求每種化合物選用兩對(duì)MRM離子，各定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖相比誤差不超過(guò)±20%，但當(dāng)目標(biāo)物濃度較低時(shí)，由于質(zhì)譜信號(hào)的絕對(duì)響應(yīng)低，加之受到基質(zhì)效應(yīng)的影響，實(shí)際檢測(cè)目標(biāo)分析物的離子相對(duì)豐度容易超出容許限，從而給確證分析結(jié)果的判定帶來(lái)困難[19＼]。本實(shí)驗(yàn)采用MRMIDAEPI模式，將優(yōu)化后的MRM條件作為EPI促發(fā)方式，初步設(shè)定IDA參數(shù)，對(duì)10μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。結(jié)果表明，CE值為20和35eV時(shí)，可以獲得足夠的碎片離子信息，并包含特征碎片離子。綜合考慮4種化合物EPI質(zhì)譜圖的背景強(qiáng)度，確定MRMIDAEPI模式的參數(shù)，進(jìn)而獲得對(duì)應(yīng)MRM通道中母離子的增強(qiáng)二級(jí)離子全掃描質(zhì)譜圖，4種目標(biāo)物在CE為20eV的EPI的掃描結(jié)果如圖2所示，用于定性分析，同時(shí)建立目標(biāo)物的EPI譜庫(kù)，用于陽(yáng)性樣品定性時(shí)的譜庫(kù)檢索，輔助定性分析。同時(shí)MRM通道采集的信號(hào)依然可用于定量分析，與普通MRM模式相比，JP由于EPI譜圖增強(qiáng)了二級(jí)碎片離子全掃描譜圖，其靈敏度高于四極桿質(zhì)譜，確證信息更豐富，而MRM通道采集的信號(hào)依然可作為定量分析的數(shù)據(jù)。因而可以有效輔助痕量水平或檢出限濃度樣品的定性分析，很好地解決了傳統(tǒng)四極桿MRM模式對(duì)低濃度樣品的定性檢測(cè)存在的困難[15＼]。

3.3前處理方法

3.3.1固相萃取柱的選擇和優(yōu)化最初采用特異性強(qiáng)的免疫親和層析凈化進(jìn)行前處理，近年來(lái)興起了特殊填料的多功能凈化柱凈化，這兩種方式雖然凈化效果較好，但成本高，應(yīng)用受到限制[17＼]。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取的方式進(jìn)行樣品前處理，可降低成本，簡(jiǎn)化操作。比較了Waters公司的C18（200mg，6mL）、HLB（200mg，6mL）兩種固相萃取柱的凈化效果和保留行為，結(jié)果表明，HLB（200mg，6mL）對(duì)4種嘔吐毒素的保留性最強(qiáng)；為進(jìn)一步去除基質(zhì)干擾，本實(shí)驗(yàn)還優(yōu)化了淋洗液和洗脫液，最終確定淋洗液為5mL水和5mL甲醇水溶液（5KG-3∶KG-595，V/V），洗脫液為5mL甲醇。

3.3.2提取溶劑的選擇由于DON及其衍生物和代謝物易溶于水和極性有機(jī)溶劑，通過(guò)考察各種類(lèi)型的谷物及其制品發(fā)現(xiàn)，純的谷物（如大米、小麥、小麥粉、玉米、玉米粉等）可以采用純水提取，但谷物制品種類(lèi)繁多，一些即食、膨化、沖調(diào)后食用的谷物制品加水會(huì)變成糊狀，無(wú)法通過(guò)離心等手段進(jìn)行分離，而一些添加牛奶、雞蛋、雞肉、牛肉等成分的谷物制品中蛋白含量高，在水中加入一定比例的乙腈會(huì)沉淀蛋白，同時(shí)避免糊化現(xiàn)象，本研究結(jié)合已有報(bào)道和資料[12，17＼]，以及對(duì)不同提取溶劑的研究結(jié)果，最終確定提取液為乙腈水（84KG-3∶KG-516，V/V）。

3.4方法學(xué)驗(yàn)證

3.4.1線性范圍、檢出限和定量限采用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用初始流動(dòng)相配制成1～300μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以13C15DON作為DON的內(nèi)標(biāo)，13C173AcDON作為3AcDON、15AcDON和DOM1的內(nèi)標(biāo)，以待測(cè)物質(zhì)的峰面積和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。結(jié)果表明，各嘔吐毒素在1～300μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；在2g空白大米基質(zhì)樣品中加入20μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100μg/L），理論加標(biāo)濃度為1.0μg/kg，按照已建立方法檢測(cè)，結(jié)果信噪比均大于80，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定S/N>10為檢測(cè)下限，S/N>3為檢出限，鑒于質(zhì)譜本身的穩(wěn)定性、不同儀器間的差異和方法的適用性，確定本方法的檢出限0.1μg/kg，定量限0.3μg/kg，如表2所示，本方法的檢出限與相關(guān)報(bào)道基本一致[14＼]，可滿(mǎn)足檢測(cè)需求。

3.4.2方法的回收率和精密度

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和可靠性，在陰性樣品大米、小麥粉和啤酒中分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，加標(biāo)水平為5，50和200μg/kg，每個(gè)濃度水平按照J(rèn)P優(yōu)化后的CM（44方法平行測(cè)試6次，回收率和RSD的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，DON的回收率為97.5%～101.7%，CM）

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～3.3%；3AcDON的回收率為94.1%～1014%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～3.0%；5AcDON的回收率為95.6%～100.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～4.4%；DOM1的回收率為81.3%～93.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～4.3%；結(jié)果表明，在3個(gè)水平下，本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可以滿(mǎn)足谷物及其制品中DON及其衍生物和代謝物檢測(cè)的要求。

3.5實(shí)際樣品驗(yàn)證

3.5.1FAPASS質(zhì)控樣品的驗(yàn)證為了進(jìn)一ZH（步驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性和適用性，對(duì)FAPASS提供的陽(yáng)性質(zhì)控玉米粉進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表4所示，DON、3AcDON、15AcDON的檢測(cè)結(jié)果均在質(zhì)控標(biāo)示值范圍內(nèi)，且平行測(cè)試結(jié)果RSD≤5.0%，DOM1未檢出，與FAPASS的質(zhì)控樣品的標(biāo)示值一致，表明本方法適用于實(shí)際陽(yáng)性樣品的檢測(cè)。ZH）

3.5.2陽(yáng)性樣品的分析

應(yīng)用本方法分析了10份在售谷物及其制品（大米、年糕、玉米粉、醬油、饅頭各2份），其中部分樣品中有DON，3AcDON，15AcDON，DOM殘留，殘留量為0.2～5.0μg/kg，以陽(yáng)性可疑大米樣品為例，采用MRMIDAEPI掃描模式對(duì)樣品進(jìn)行分析，在保留時(shí)間3.5min，獲得2個(gè)不同的碰撞能量EPI譜圖，將樣品的EPI譜圖在新建的嘔吐毒素及其衍生物和代謝物的譜庫(kù)中進(jìn)行檢索，得到匹配結(jié)果，其中Fit值（匹配值）是用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖與可疑樣品譜圖進(jìn)行對(duì)比后獲得的相似度值（滿(mǎn)分為100），RevFit值（反相匹配值）是反相匹配后獲得的相似度值；Purity值（純度值）是綜合前兩種結(jié)果得出的數(shù)值[20＼]，從表5可明顯看出樣品為DON陽(yáng)性。使用MRM通道采集的信號(hào)進(jìn)行定量分析，結(jié)果為1.2μg/kg，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中DON的快速確證，簡(jiǎn)化了定性分析流程。

4結(jié)論

建立了谷物及其制品中嘔吐毒素及其衍生物和代謝物的UHPLCQTRAPMS/MS分析方法，采用MRMIDAEPI分析模式，利用QTrap的線性離子阱功能獲得DON，3AcDON，15AcDON和DOM1的增強(qiáng)全掃描二級(jí)質(zhì)譜圖，并建立其多能級(jí)全掃描檢索譜庫(kù)，同步實(shí)現(xiàn)MRM定量檢測(cè)和在線EPI譜庫(kù)檢索定性確證功能，在樣品前處理中采用HLB固相萃取技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)谷物及其制品中4種目標(biāo)化合物的富集和凈化，同時(shí)在前處理中加入了同位素內(nèi)標(biāo)，不但能有效地去除基質(zhì)效應(yīng)影響，還能排除前處理過(guò)程因樣品損失造成的回收率不穩(wěn)定的問(wèn)題，與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)和已報(bào)道的方法相比，本方法檢出限更低，定量結(jié)果準(zhǔn)確，檢測(cè)成本更低，檢測(cè)范圍更廣，分析速度更快，為嘔吐毒素及其衍生物和代謝物提供更加準(zhǔn)確可靠的定性篩查和定量分析方法。

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AbstractAmethodwasestablishedforthequalitativeidentificationandquantitativedeterminationofDON，3AcDON，15AcDON，DOM1incerealandcerealproductsbasedonsolidphaseextractionandultraperformanceliquidchromatographyquadrupolelineariontrapmassspectrometry（UPLCQTRAPMS/MS）withisotopicdilution.Sampleswereextractedbythemixtureofacetonitrileandwater（84KG-3∶KG-516，V/V），degreasedbyhexanesaturatedwithacetonitrileandpurifiedbyHLBsolidphaseextractioncartridge.ThetargetanalyteswereseparatedbyWatersAtlantisT3columnwithgradientelutionbymobilephaseswhichconsistedofacetonitrileand0.02%ammoniawater.Ascheduledmultiplereactionmonitoring（MRM）innegativemodeassurveyscanandanenhancedproduction（EPI）scanasdependentscaninaninformationdependentacquisition（IDA）experimentwereadoptedinmassspectrometryacquisition.OnlinelabbuiltMS/MSlibraryaswellastheisotopeinternalstandardswasemployedfortheidentificationandqualification.Foreachanalyte，thecorrelationcoefficientwasabove0.999inthelinearrangeof1-300μg/L.Thelimitsofdetection（LOD）andquantitation（LOQ）were0.1μg/kgand0.3μg/kg，respectively.Themeanrecoverywas81.3%-101.7%atthreespikedlevelsof5，50，200μg/kg.Therelativestandarddeviation（RSD）wasnomorethan5%.TheproposedmethodwassuccessfullyappliedtotheanalysisofFAPAS′sQCsamplesandfiverepresentativesamples.Thismethodwassimple，fastandprecise，andsuitableforthedeterminationandconfirmationofdeoxynivalenolanditsderivativesandmetabolitesincerealandcerealproducts.

KeywordsIsotopicdilution；Deoxynivalenolanditsderivativesandmetabolites；Ultraperformanceliquidchromatography；Quadrupolelineariontrapmassspectrometry

HQWT6JY（Received27May2016；accepted13September2016）