龔屾，石英，韓毅強，高亞梅，鄭殿峰，杜吉到

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

提取緩沖液pH值對植物組織中SOD、POD和CAT酶活性的影響

龔屾，石英，韓毅強，高亞梅，鄭殿峰，杜吉到

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

植物組織中SOD、POD和CAT活性測定對于研究植物抗逆性極其重要。為了簡化實驗，利用比色法研究了四種作物在正常水分條件下和干旱脅迫下，不同pH值提取緩沖液對SOD、POD和CAT酶活性的影響。結(jié)果表明，SOD不適合在低pH值（6.0）提取緩沖液下提取，POD不適合在pH 7.0的提取緩沖液下提取，CAT可以應(yīng)用三種提取緩沖液中的任意一種，對酶活性均影響不大。綜上所述，SOD、POD和CAT三種酶活均可以應(yīng)用pH 7.8緩沖液提取，不會顯著影響實驗結(jié)果，提高測定效率。

抗氧化；酶活性；超氧化物歧化酶；過氧化物酶；過氧化氫酶

氧氣是需氧生物所必須的物質(zhì)，如果植物在生長過程中遭受到外界干旱、水淹、冷凍等環(huán)境脅迫，植物對光能的吸收效率會下降，體內(nèi)CO2固定受阻，最終O2被作為電子受體形成O2-產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[1]?；钚匝踹^度積累對植物產(chǎn)生嚴重傷害，甚至死亡。超氧化物歧化酶（SOD）催化O2·-分解生成H2O2，胞內(nèi)過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）能夠清除H2O2，它們共同形成重要的植物活性氧清除系統(tǒng)[2-3]。SOD、CAT和POD在生物學(xué)抗性研究中成為一個非常關(guān)鍵性的指標(biāo)，為了提高植物的活性氧清除系統(tǒng)，人們采用改變水肥[4-5]、施用激素[6]以及轉(zhuǎn)基因[7]等技術(shù)來提高植物的抗逆性。酶活性的測量有化學(xué)滴定法、比色法、電化學(xué)法和放射化學(xué)測定法等多種方法[8-9]。SOD、CAT和POD均可以通過比色法測定，測定方法簡便易行被研究人員廣泛采用[10]，三種酶在提取和測定時使用的緩沖溶液均可為磷酸緩沖溶液，僅pH值有差別。為了進一步簡化方法、減小誤差、減少工作量，實驗設(shè)計了不同pH的提取緩沖液體系，以研究提取緩沖液pH對酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗材料選取健康的大豆（嫩豐18）、水稻（墾鑒稻10）、小麥（墾大13）和玉米（鄭單958）種子。使用10%的雙氧水浸泡10 min，無菌水沖洗3次，播種于蛭石與土比例為3∶1的種植缽中，發(fā)芽15 d后，將各作物材料的1/2進行水分脅迫管理，另外1/2正常水分管理，處理10 d后，取長勢一致，同一部位的葉片置于液氮中30 min，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 酶活測定方法

SOD活性采用核黃素-NBT法測定[11]，活性單位以抑制NBT光化還原50%所需酶量為1個酶活單位（u）。CAT活性采用紫外吸收法測定[12-13]，以每min內(nèi)A240減少0.1的酶量為一個酶活單位（u）。POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[14]，酶活性計算：以每分鐘OD值變化（升高）0.1為1個酶活性單位（u）。

1.3 提取緩沖液和反應(yīng)緩沖液的配方

實驗對照組為SOD酶活測定使用的提取和反應(yīng)緩沖液是50 mmol·L-1pH 7.8磷酸緩沖液[11]，CAT酶活測定的提取和反應(yīng)緩沖液使用的是50 mmol·L-1pH 7.0磷酸緩沖液[12-13]，POD酶活測定的提取和反應(yīng)緩沖液使用的是50 mmol·L-1pH 6.0磷酸緩沖液[11]。實驗處理組為反應(yīng)液不變，提取液采用不同pH的磷酸緩沖液，設(shè)計如表1。

表1 實驗設(shè)計方案Table 1 Design scheme of experiment

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2010軟件錄入數(shù)據(jù)和作圖，采用SPSS19.0中Duncan檢測進行差異顯著性檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH磷酸提取緩沖液對SOD活性的影響

利用不同pH磷酸提取緩沖液測定的SOD酶活性的結(jié)果見圖2，在正常測定條件下（pH 7.8），干旱處理的大豆、水稻和玉米三種作物的SOD酶活性均顯著高于正常水分處理，小麥沒有顯著變化。磷酸提取緩沖液為（pH 7.0）時，變化與對照相同。并且不論正常水分處理還是干旱處理，四種作物的SOD酶活性均與對照無顯著差異。但是，當(dāng)磷酸提取緩沖液為（pH 6.0）時水稻和玉米干旱處理和正常水分處理間的SOD酶活性變化不顯著，小麥的出現(xiàn)顯著差異，這些與對照（pH 7.8）不同。同時，小麥正常水分處理時磷酸提取緩沖液為（pH 6.0）測得的酶活顯著低于正常測定條件下（pH 7.8）和pH 7.0處理；水稻的干旱條件下pH 6.0處理也顯著低于其他兩個處理。

圖1 不同提取液pH值對四種作物SOD酶活性的影響Fig.1 Effect of different pH of extraction buffer on enzyme activity of SOD of four crops

2.2 不同pH磷酸提取緩沖液對POD活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)磷酸提取緩沖液pH值為7.0時，四種作物兩種處理的POD酶活性都低于正常提取條件下（pH6.0）POD酶活性，其中大豆、小麥和水稻的POD酶活性顯著低于正常提取條件下（pH6.0）。并且小麥中水分不同造成的差異也不相同。而當(dāng)磷酸提取緩沖液pH值為7.8時，所有作物和的POD酶活性都與正常提取條件下（pH6.0）POD酶活性無顯著變化，同時干旱脅迫形成的差異與正常提取條件下（pH6.0）形成的差異相同。干旱條件下，大豆POD酶活性差異最大，小麥其次，水稻和玉米無顯著變化。

圖2 不同提取液pH值對四種作物POD酶活性的影響Fig.2 Effect of different pH of extraction buffer on enzyme activity of POD of four crops

2.3 不同pH磷酸提取緩沖液對CAT活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)磷酸提取緩沖液pH值對CAT活性的影響較小，同種作物和同樣的水分條件下不同pH值提取緩沖液對CAT活性無顯著影響，并且兩種水分條件下的CAT活性差異變化均相同，見圖3。干旱處理顯著增加了水稻、小麥和玉米CAT活性，水稻影響最大，增加2倍左右，對大豆無顯著影響。

圖3 不同提取液pH值對四種作物CAT酶活性的影響Fig.3 Effect of different pH of extraction buffer on enzyme activity of CAT of four crops

3 結(jié)論與討論

在植物抗性研究中，準(zhǔn)確快捷獲得酶活力大小的方法是所有研究領(lǐng)域科學(xué)家希望獲得的。植物樣品在進行酶活性測定時都需要破碎細胞和提取，提取液中一些成分對酶活的測定也有影響，有人通過簡單分離純化的手段將影響物質(zhì)去除以達到更好的測定效果[15]。汪俏梅等[16]在研究1-甲基環(huán)丙烯對青花菜衰老延緩作用時對三種抗氧化酶進行了聯(lián)合測定，但并未給出相應(yīng)的理論依據(jù)。實驗結(jié)果表明，提取緩沖液pH值對CAT沒有顯著影響，低pH值影響一些植物SOD酶活性，而pH值為7.0時POD酶活性在大豆、小麥和水稻三種植物中均顯著低于正常處理。究其原因，認為可能來自于兩個方面，首先一些酶對低pH值耐受性較差，例如SOD[17]；其次，酶在其等電點時溶解度最低，SOD的等電點PI 4.9，低pH值影響SOD的提取，POD的等電點PI 7.0，在等電點處提取酶的效率是最低的，提取液中酶的提取量直接影響的酶活性表征。SOD、POD、CAT作為ROS系統(tǒng)中的最主要的酶，是科研的重要指標(biāo)。以往根據(jù)三種酶反應(yīng)的最適pH設(shè)定相應(yīng)的提取液的pH[14]，三種酶液的提取都是分開的，這為三種酶活性的測定增加了工作量。對實驗的結(jié)果進一步分析發(fā)現(xiàn)，三種酶在提取緩沖液pH 7.8時可以獲得較高的酶活性，可以準(zhǔn)確測量。這樣可一次提取三種酶的提取液用于酶活測定，減少提取次數(shù)，簡化實驗。

作物干旱條件下，SOD將O2·-分解生成H2O2，而H2O2除本身對細胞有毒害外，還可在Fe2+、Mn2+等的參與下，通過Haber-Weiss反應(yīng)生成毒害更強的·OH[18]。CAT直接催化H2O2分解為H2O和O2，而POD是一種以血紅素為輔基的酶，通過催化H2O2與有機無機氫供體發(fā)生氧化還原反應(yīng)，以消耗H2O2。它們在阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中還起著承上啟下的作用。研究發(fā)現(xiàn)干旱條件下大豆中POD活性顯著高于正常水分。而CAT活性沒有顯著改變，說明在大豆中POD在清除H2O2能力方面強于CAT。同樣的干旱條件下水稻和玉米的CAT活性顯著高于正常水分，而POD活性沒有顯著改變，說明在水稻和玉米中CAT在清除能力方面強于POD。他人在研究植物與微生物共生過程中活性氧網(wǎng)絡(luò)時也發(fā)現(xiàn)了CAT和POD清除H2O2能力不同的情況[3]。小麥中POD和CAT活性均顯著高于正常水分，表明這兩種酶在清除H2O2均有作用，但小麥中POD活性遠遠高于其他三種作物，POD可能更加重要。

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Effect of pH of Extraction Buffer on SOD，POD and CAT in the Plant Tissue

Gong Shen，Shi Ying，Han Yiqiang，Gao Yamei，Zheng Dianfeng，Du Jidao
（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319）

Enzyme activity measurement of SOD，POD and CAT was important for study of plant stress-tolerance.To simplify the experiment，effect of different extraction buffer on enzyme activity measurement of SOD，POD and CAT was analyzed in four crops under normal condition and drought stress by photocolorimetric method.Results showed that the extraction of SOD was unsuitable in low pH （6.0）buffer，and the extraction of POD was unsuitable in pH 7.0 buffer，and the extraction of CAT could be carried out in three buffers，which had no effect on enzyme activity of CAT.Above all，pH 7.8 buffer could be applied for extraction of SOD，POD and CAT，and had no obvious effect on result of measurement，and it would improve efficiency of activity measurement of those enzymes.

Antioxidation；Enzyme activity；SOD；POD；CAT

Q4-33/S-3

A

1002-2090（2017）02-0008-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.002

2016-03-26

國家自然科學(xué)基金項目（31271652）；大慶市指導(dǎo)性科技計劃項目（zd-2016-041）。

龔屾（1989-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院2013級碩士研究生。

鄭殿峰，男，教授，E-mail：zdffnj@263.net。