袁明美，封 聰，王守云，張巍偉，陳 默，姜 泓*，馮雪松

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110122； 2.中國醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽 110122)

LC-MS/MS法測定牛乳及其制品中β-乳球蛋白的含量

袁明美1，封 聰2，王守云1，張巍偉2，陳 默2，姜 泓2*，馮雪松1

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110122； 2.中國醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽 110122)

建立LC-MS/MS測定牛乳及其制品中β-乳球蛋白含量的方法. 從β-乳球蛋白酶解產(chǎn)物中篩選出標簽肽，通過多反應(yīng)檢測模式，對牛乳及其制品中的β-乳球蛋白進行定量. 結(jié)果表明，所建立方法具有靈敏度、準確度高，重現(xiàn)性好，前處理簡單的優(yōu)點，可用于牛乳制品中β-乳球蛋白的定量檢測.

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；β-乳球蛋白；標簽肽；牛乳制品；含量測定

乳及乳制品是人體重要的蛋白質(zhì)來源，乳蛋白是牛乳中最有營養(yǎng)價值的部分. 正常的牛乳中含有約2.2%～4.4%的蛋白質(zhì)，主要包括乳清蛋白、酪蛋白及少量的脂肪球膜蛋白等[1]. 乳清蛋白具有較高的蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)價值及生物學(xué)效價，是公認的人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補充劑之一，被廣泛應(yīng)用于乳制品和配方食品中[2].β-乳球蛋白是由乳腺上皮細胞合成的乳特有蛋白質(zhì)，在奶牛常乳中的含量約為4.0 g/L，占乳清蛋白總量的43.6%～50%[3-5].β-乳球蛋白具備最佳的氨基酸比例，支鏈氨基酸含量極高，有降低膽固醇、抗氧化、易被吸收、促進脂溶性營養(yǎng)素如維生素A和維生素E的吸收等特點[6-7]，被認為是多功能蛋白.

目前，β-乳球蛋白常用的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)[8]、凝膠電泳法(SDS-PAGE)[9]、毛細管電泳法(CE)[10]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[11]等. 這些檢測方法由于操作繁瑣、檢測周期長、分離度差等缺點，無法對乳及乳制品中β-乳球蛋白的含量進行更準確的評價. 因此，有必要建立乳與乳制品中β-乳球蛋白定量檢測的方法. 本文應(yīng)用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)，基于蛋白組學(xué)中自下而上的鳥槍法-特征肽段(標簽肽)定量靶蛋白，采用多反應(yīng)檢測(MRM)模式，檢測牛乳及其制品中β-乳球蛋白的含量，為準確評價牛乳制品中有效營養(yǎng)價值提供參考依據(jù)和準確的檢測方法.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1290液相色譜-6420三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國，Agilent)；CP124C全自動電子天平(十萬分之一)(日本A&D公司)；3K-18型超速低溫冷凍離心機(Sigma公司).

MTV-100多管漩渦混合儀(杭州奧盛儀器有限公司)；TMS-200超級恒溫混勻儀(杭州奧盛儀器有限公司)；MVS-1漩渦混合器(北京金北德工貿(mào)有限公司)；Easypure純水系統(tǒng)(美國，Barnstead公司);碳酸氫銨(NH4HCO3)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、甲醇(HPLC級)、乙腈(HPLC級)、甲酸、胰蛋白酶和β-乳球蛋白(Bovine，純度 ≥ 90%)標準品均購于美國Sigma公司；駱駝奶粉來自迪拜Al Ain Dairy. 標簽肽VLVLDTDYK和內(nèi)標肽ETTVFENLPEK*(K*, Lys-OH-13C6,15N2) 由上海杰肽生物科技有限公司合成. 純奶、酸奶、全脂奶粉、脫脂奶粉等均購自當?shù)卮笮统?

1.2 色譜條件和質(zhì)譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱(Agilent 2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，柱溫40 ℃，流動相A:含0.1%甲酸的水溶液，流動相B：含0.1%甲酸的乙睛溶液，流速為0.4 mL/min，進樣量5 μL. 梯度洗脫：初始B相為10%，保持0.2 min；在2.8 min內(nèi)線性升高至50%；然后0.2 min內(nèi)B相線性升高至95%，并保持此梯度0.2 min；之后在0.2 min內(nèi)，B相降低回到10%的初始梯度條件，平衡1.1 min后開始下一個進樣程序，總洗脫時間5 min.

電噴霧(ESI)離子源，正離子模式，掃描方式為多反應(yīng)檢測(MRM)，標簽肽VLVLDTDYK的m/z為533.2→853.4，內(nèi)標肽ETTVFENLPEK*的m/z為657.8→884.4. 優(yōu)化后的質(zhì)譜離子源條件參數(shù)如下：毛細管電壓為4.0 kV；離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣(N2)溫度:350 ℃；標簽肽和內(nèi)標肽的毛細管出口電壓分別為150 V和100 V，碰撞電壓(CE)分別均為20 V；保護氣流量10 L/min.

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線溶液和質(zhì)控樣品溶液的配制

精密稱取牛β-乳球蛋白標準品和駱駝奶粉空白基質(zhì)適量，分別用50 mmol/L NH4HCO3溶液溶解，制得濃度為1 mmol/L的β-乳球蛋白儲備液和10 g/L的駱駝奶粉空白基質(zhì)溶液. 檢測分析前，精密量取β-乳球蛋白儲備液適量，用駱駝奶粉空白基質(zhì)溶液梯度稀釋配成濃度為2、5、10、20、50 和 100 μmol/L的系列標準對照溶液以及 3.5、15 和 75 μmol/L的質(zhì)控標準品溶液. 精密稱取內(nèi)標肽ETTVFENLPEK*適量，用水溶液配制成2 mmol/L的儲備溶液凍存于-80 ℃. 臨用前精密量取儲備液適量，用水稀釋成濃度為0.1 mmol/L溶液，作為內(nèi)標溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.3.2 樣品溶液的制備

精密稱取乳制品0.1 g，用50 mmol/L NH4HCO3溶解稀釋至濃度為10 g/L. 取200 μL樣品(稀釋后的乳制品、系列標準品溶液和質(zhì)控標準品溶液)，加入0.1 mmol/L內(nèi)標肽段溶液20 μL混勻. 隨后加入100 μL 100 mmol/L 二硫酥糖醇(DTT)溶液在恒溫混勻儀中60 ℃反應(yīng)60 min，待反應(yīng)溫度降至室溫加入200 μL 100 mmol/L 碘乙酰胺(IAA)溶液30 ℃避光反應(yīng)30 min. 然后加入200 μL 1 g/L 胰蛋白酶溶液，溶劑為25 mmol/L NH4HCO3溶液37 ℃過夜反應(yīng). 最后加入200 μL 10%甲酸水溶液室溫靜止30 min終止反應(yīng). 4 ℃下5 000 g離心10 min，過0.22 μm濾膜，轉(zhuǎn)移至新的離心管中待測備用.

1.3.3 方法學(xué)驗證和應(yīng)用

為了保證所建立方法的準確性，我們進行了特異性、線性、檢測限、精密度、回收率、穩(wěn)定性和重復(fù)性等方面的方法學(xué)考察. 同時，為了驗證方法的適用性，采集了液態(tài)奶制品純奶和酸奶以及固態(tài)奶制品全脂奶粉和脫脂奶粉，對β-乳球蛋白進行了分析檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 特征肽段的選擇

牛乳中的β-乳球蛋白的相對分子質(zhì)量約為19 000，由178個氨基酸殘基組成. 通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot (www.uniprot.org)可獲得其氨基酸殘基序列，將得到的β-乳球蛋白的氨基酸序列(UniProt ID: P02754)導(dǎo)入計算機模擬水解軟件Skyline[12]中，選擇合適的預(yù)測篩選條件，如特征肽段氨基酸殘基個數(shù)為5～25，不含半胱氨酸、蛋氨酸等不穩(wěn)定氨基酸，可得到符合條件的模擬水解肽段8個. 然后將經(jīng)酶解處理后的的樣品進入LC-MS分析，通過全掃描和MRM分析，8個模擬水解肽段中，有7條肽段被檢測到，分別是GLDIQK [24, 29]、VYVEELKPTPEGDLEILLQK[56, 75]、IPAVFK [93, 98]、IDALNENK [99, 106]、VLVLDTDYK [107, 115]、TPEVDDEALEK [140, 150]、ALPMHIR [157, 163]. 肽段IIAEK [86, 90]可能由于基質(zhì)的影響或質(zhì)譜響應(yīng)等方面的問題，沒有被檢測到. 通過在線的Uniprot數(shù)據(jù)庫BLAST分析工具對β-乳球蛋白酶解出的肽段與數(shù)據(jù)庫中其他全部已知蛋白進行對比分析，結(jié)果表明GLDIQK [24, 29]、IPAVFK. [93, 98]、ALPMHIR [157, 163]這3條肽段蛋白專屬性較差，不具有足夠的特異性，不再進入下一步分析. 另外，肽段VYVEELKPTPEGDLEILLQK[56, 75]由于含有20個氨基酸，序列較長，標準肽段合成繁瑣也不再進行下一步分析. 化學(xué)合成剩余三條肽段的標準品，進行質(zhì)譜MRM參數(shù)優(yōu)化，結(jié)果如表1所示. 進一步比較其質(zhì)譜響應(yīng)，最終選擇色譜分離過程無干擾，質(zhì)譜響應(yīng)值最高的肽段VLVLDTDYK [107, 115]作為牛β-乳球蛋白的特征肽段—標簽肽(見圖1d)，另外兩條肽段可用做佐證肽段. 用于定量的標簽肽VLVLDTDYK的m/z為533.2→853.4.

表1 三個候選標簽肽的MRM參數(shù)

*定量子離子.

2.2 內(nèi)標物、空白基質(zhì)的選擇及方法的專屬性

在應(yīng)用LC-MS/MS法對樣品的酶解產(chǎn)物進行檢測時，由于樣品前處理影響和液質(zhì)離子化效率不一致等因素會對肽段信號響應(yīng)產(chǎn)生影響，液質(zhì)分析過程中經(jīng)常加入內(nèi)標物質(zhì)作為參照物，以達到更好的重現(xiàn)性. 本文選擇的內(nèi)標肽段ETTVFENLPEK*(K*, Lys-OH-13C6,15N2)為前期實驗中合成的同位素內(nèi)標物，m/z為657.8→884.4，在樣品酶解前后通過MRM提取均檢測不到，并且和β-乳球蛋白的標簽肽具有相似的色譜行為(見圖1b和c)，可用于校正樣品處理和檢測過程中的不穩(wěn)定因素.

圖1 酶解產(chǎn)物色譜圖

LC-MS/MS對復(fù)雜生物樣品進行分析時，基質(zhì)效應(yīng)對測量結(jié)果的影響不容忽視. 本實驗中檢測的特異性多肽需從β-乳球蛋白中經(jīng)胰蛋白酶水解出來，酶解效率也會受到基質(zhì)的影響. 為了盡可能還原β-乳球蛋白在乳制品中實際的水解情況，我們將一定量β-乳球蛋白加入空白基質(zhì)中和樣品經(jīng)過同樣的處理過程，這樣大大增加了定量的準確性. 經(jīng)過比較篩選，我們最終選擇駱駝奶粉作為空白基質(zhì)，一方面駱駝奶粉也是乳制品在組成和性質(zhì)上接近牛乳制品，另一方面我們在駱駝奶粉酶解前后的對牛β-乳球蛋白特征肽段和內(nèi)標肽段進行MRM提取，均未檢測到色譜峰(見圖1a). 結(jié)果表明，該方法具有良好的專屬性.

2.3 標準曲線、檢測限、精密度和重復(fù)性考察

本文中的標準曲線通過將β-乳球蛋白標準品加入駱駝奶粉空白基質(zhì)中溶解稀釋，經(jīng)和樣品相同的處理過程后，檢測水解出的特異性多肽VLVLDTDYK，建立校準曲線. 結(jié)果表明，標簽肽回歸方程為y= 7 281.4x+ 21 772 (r=0.996 3)，在2～100 μmol/L(0.4～20 g/100 g)范圍內(nèi)線性良好，可以滿足實驗檢測要求.

用檢測限與定量限評價方法的靈敏度，信噪比(S/N)為3∶1和10∶1時的溶液濃度分別為檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，計算所得檢測限為1 nmol/L(0.2 mg/100 g), 定量限為3 nmol/L(0.6 mg/100 g). 日內(nèi)和日間精密度相對標準偏差(RSD)分別為1.2%～2.5% 和 5.0%～5.4%. 重復(fù)性(n=6)RSD為2.8%～6.2%.

2.4 回收率和樣品穩(wěn)定性考察

本實驗采用標準加入法測定回收率，取15份預(yù)混合的樣品分別加入低、中、高3個濃度水平的β-乳球蛋白標準品，另取5份預(yù)混合樣品作為對照，每一濃度水平平行5份，加入內(nèi)標后混勻，按照樣品前處理步驟進行處理，進行檢測分析. 3個添加水平的平均回收率在91.5%～100.2%之間，且RSD < 4.5%，結(jié)果表明該方法具有良好的回收率.

此外，對樣品的穩(wěn)定性進行了考察，結(jié)果在室溫條件下穩(wěn)定24 h，-20 ℃冰凍條件下穩(wěn)定30 d，反復(fù)凍融3 d均不影響處理后樣品中標簽肽的檢測及β-乳球蛋白的定量.

2.5 應(yīng)用

取3個廠家市售奶制品，用建立的方法進行檢測，結(jié)果如表2所示，不同生產(chǎn)廠家的奶制品中β-乳球蛋白的含量雖有差別，但相差不多. 從品種上來看，純奶中的β-乳球蛋白的含量相對酸奶高些，脫脂奶粉的β-乳球蛋白含量比全脂奶粉高，具體原因可能與生產(chǎn)工藝有關(guān).

表2 檢測不同奶制品中β-乳球蛋白的含量

3 結(jié)論

本方法采用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選出對牛β-乳球蛋白具有高度專一性的特征肽段和空白基質(zhì)，并對定量肽段進行了方法學(xué)考察，所建方法具有靈敏度高、檢測速度快、選擇性好、定量結(jié)果準確等優(yōu)點.

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[責任編輯：吳文鵬]

Determination of bovineβ-lactoglobulin in dairy products by LC-MS/MS

YUAN Mingmei1, FENG Cong2, WANG Shouyun1, ZHANG Weiwei2, CHEN Mo2, JIANG Hong2*, FENG Xuesong1

(1.CollegeofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China； 2.CollegeofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China)

A method for determining bovineβ-lactoglobulin in cow dairy products was developed by LC-MS/MS. The content ofβ-lactoglobulin was detected by multiple reaction monitoring using the signature peptides which were chosen and identified from the tryptic hydrolysates. The results show that the established method has the advantages of good sensitivity, accuracy and reproducibility as well as with simple pretreatment. It can be used for the quantitative detection ofβ-lactoglobulin in dairy products.

LC-MS/MS；β-lactoglobulin； signature peptide； dairy products； determination

2017-01-16.

中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)教育分會和中國高等教育學(xué)會醫(yī)學(xué)教育專業(yè)委員會2016年醫(yī)學(xué)教育研究立項課題(2016A-YF002), 遼寧省高等教育學(xué)會“十三五”規(guī)劃高教研究立項課題(GHZD160007).

袁明美(1991-)，女，碩士生，主要從事化學(xué)生物分析及作用機制研究.*

, E-mail:hjiang@cmu.edu.cn.

O657

A

1008-1011(2017)02-0219-05