高向陽, 穆洪濤, 方 穎
(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,廣州 510642; 2.廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,廣州 510303; 3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,廣州 510510)
雙水相萃取系統(tǒng)相圖制作新方法
高向陽1, 穆洪濤2, 方 穎3
(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,廣州 510642; 2.廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,廣州 510303; 3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,廣州 510510)
相圖是研究雙水相萃取分離過程的重要前提步驟,提出了清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法,采用移液器微量滴定的方法繪制了PEGs/(NH4)2SO4的雙水相相圖,經(jīng)準(zhǔn)確度驗(yàn)證,此方法準(zhǔn)確可靠。清-濁點(diǎn)輔助相圖制作法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確和適用范圍廣等特點(diǎn),為雙水相系統(tǒng)相圖制作提供了新的方法,可以用于雙水相萃取的實(shí)驗(yàn)教學(xué)、科研及生產(chǎn)等領(lǐng)域。關(guān)鍵詞:清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法; 雙節(jié)線; 微量滴定; PEG/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)
雙水相萃取系統(tǒng)(Aqueous Two-phase Extraction,ATPS)是由兩種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的親水性聚合物,或者一種親水性聚合物和無機(jī)鹽在水中以適當(dāng)?shù)臐舛榷纬苫ゲ幌嗳艿膬伤嘞到y(tǒng)。由于其條件溫和、容易放大、可連續(xù)操作,目前已廣泛地應(yīng)用于生物大分子的分離和純化[1]。
目前,常用于雙水相系統(tǒng)相圖制作的方法大致有濁點(diǎn)法[2]和系線法[3]。濁點(diǎn)法制作相圖操作簡便,但由于在臨界點(diǎn)判斷上往往存在誤差,故不同研究者制作的相圖差異較大,降低了參考性[4-6]。系線法需要分析上、下相的組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù),操作繁瑣,而且精確地做出相圖要許多組數(shù)據(jù),工作量大,增加了相圖制作的困難。基于此,本文提出了清-濁點(diǎn)輔助相圖制作法,此方法不僅對所有的雙水相體系相圖制作具有普遍適用性,而且其操作過程更加簡易快捷,相圖的精確度方面也較傳統(tǒng)濁點(diǎn)法有較大程度的提高。
1.1 材料與儀器
材料:PEG400(聚乙二醇400),PEG1000,PEG2000,PEG6000購自阿拉丁試劑(上海)有限公司;硫酸銨購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,去離子水產(chǎn)自Milli-Q Academic A10。
儀器:1/1000天平(METTLER TOLEDO PB203-N),20~200 μL、100~1 000 μL移液器(Eppendorf Research plus),漩渦振蕩器(Essenscien v7),玻璃刻度離心管10 mL。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 溶液配制
將成相物質(zhì)PEG配制成50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的濃溶液,(NH4)2SO4配制成40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的濃溶液,備用。
1.2.2 清-濁點(diǎn)的測定
濃溶液質(zhì)量的標(biāo)定:用微量移液器量取一定體積(1 mL 或100 μL)的50%PEG濃溶液或40%的(NH4)2SO4濃溶液,于電子天平上稱量液體質(zhì)量,每種濃溶液反復(fù)稱量10次。
在刻度離心管中加入1 mL 50%PEG濃溶液,然后用移液器每次加入100 μL (NH4)2SO4濃溶液,振蕩,至體系剛剛渾濁(濁點(diǎn)),記錄加入(NH4)2SO4濃溶液的體積;再每次加入100 μL水,至體系剛剛澄清(清點(diǎn)),記錄加入水的體積;同理依次交替加入(NH4)2SO4濃溶和水,記錄加入體積并計(jì)算每個(gè)測試點(diǎn)含(NH4)2SO4和PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
1.2.3 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖的建立
以硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo),PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo),繪制清點(diǎn)散點(diǎn)圖和濁點(diǎn)散點(diǎn)圖。由于理論上相圖的雙節(jié)線位于濁點(diǎn)散點(diǎn)圖和清點(diǎn)散點(diǎn)圖之間,故取相鄰濁點(diǎn)坐標(biāo)和清點(diǎn)坐標(biāo)的中點(diǎn)所組成的系列散點(diǎn)制作雙節(jié)線圖,并對中點(diǎn)散點(diǎn)圖進(jìn)行曲線擬合。
1.2.4 相圖精準(zhǔn)度驗(yàn)證
根據(jù)對雙節(jié)線的擬合結(jié)果,在雙節(jié)線附近均勻選取驗(yàn)證點(diǎn),根據(jù)所選的驗(yàn)證點(diǎn)坐標(biāo)配制相應(yīng)濃度的溶液體系,驗(yàn)證分相結(jié)果。
2.1 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系清-濁點(diǎn)的測定
PEG是雙水相萃取分離中最常用的一種有機(jī)試劑,本研究著重以PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系相圖的制作為例,介紹清-濁點(diǎn)相圖制作方法。由于備用硫酸銨濃溶液比重較大,需要對一定體積的濃溶液的質(zhì)量(密度)進(jìn)行標(biāo)定,以便計(jì)算每個(gè)清-濁點(diǎn)的PEG和硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。濃溶液質(zhì)量標(biāo)定參照移液器標(biāo)定方法[7]。由表1可知,一定體積濃溶液質(zhì)量標(biāo)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(CV<5%)為可接受范圍。即可以用微量移液器來量取溶液進(jìn)行清-濁點(diǎn)的制作。
向1 mL 50%的PEG1000溶液中以100 μL為單位滴加(NH4)2SO4或去離子水,記錄達(dá)到每個(gè)濁點(diǎn)或清點(diǎn)所用的(NH4)2SO4和去離子水的份數(shù)(25 ℃)。在PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系中共測定54個(gè)測試點(diǎn),其中清點(diǎn)和濁點(diǎn)的個(gè)數(shù)均為27個(gè)。在54個(gè)測試點(diǎn)中,絕大數(shù)測試點(diǎn)(90.7%)只需滴加1份(100 μL);只有少數(shù)(7.4%)需滴加2份,僅有一個(gè)點(diǎn)需滴加4份。由此可見,此方法大大簡化了傳統(tǒng)相圖的制作步驟。
計(jì)算每個(gè)濁點(diǎn)和清點(diǎn)處PEG1000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù),并以(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo),PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖(見圖1)。圖1中濁點(diǎn)散點(diǎn)和清點(diǎn)散點(diǎn)圖大致平行,且距離緊密。
圖1 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系測試點(diǎn)分布圖
2.2 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系的相圖制作及驗(yàn)證
由于每次加入(NH4)2SO4和H2O的體積大體相當(dāng),且每次加入的溶液相對整個(gè)體系來說較小,故選取相鄰清點(diǎn)和濁點(diǎn)坐標(biāo)的中點(diǎn)散點(diǎn)作為雙節(jié)線的制作依據(jù),所作的相圖更加精確。依據(jù)中點(diǎn)散點(diǎn)圖描出的平滑曲線即為PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系的相圖(見圖2)。經(jīng)回歸分析獲得中點(diǎn)散點(diǎn)圖的擬合曲線公式:
y=9.971 2x2-4.708 1x+0.594 3
回歸系數(shù)R2=0.996 5。
圖2 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系相圖
根據(jù)擬合的方程,在雙節(jié)線上下均勻選取驗(yàn)證點(diǎn)各7個(gè),并配制相應(yīng)濃度的溶液體系,震蕩后靜止觀察是否出現(xiàn)兩相。各驗(yàn)證點(diǎn)的結(jié)果(見圖3)顯示,雖然雙節(jié)線上下的驗(yàn)證點(diǎn)距離較近,但是上方的7個(gè)點(diǎn)均出現(xiàn)兩相分層,下方的7個(gè)點(diǎn)均未出現(xiàn)兩相分層(均相)。此結(jié)果表明,清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法制作的相圖精確。
2.3 其他型號PEG/(NH4)2SO4的相圖制作
按照同樣方法作出PEG400、PEG2000、PEG6000與(NH4)2SO4的雙水相體系相圖(見圖4)。由此可知,清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法同樣適合其他型號或類型的雙水相系統(tǒng)相圖的制作。
與其他方法相比,清-濁點(diǎn)輔助相圖制作法樣品用量少使體系能夠快速平衡,從而在單位時(shí)間內(nèi)能夠采集更多相分離臨界點(diǎn),提高了相圖的準(zhǔn)確度,同時(shí)又大大地減少了相圖制作時(shí)間并節(jié)約了測試試劑成本(見表2)。另外,由于本方法無需測定各成相組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù),故具有極高的通用性。由表2可知,傳統(tǒng)濁點(diǎn)法依然是相圖制作的主流方法。此種方法雖然具有操作簡便快捷的優(yōu)點(diǎn),但在臨界點(diǎn)判斷上往往存在誤差。濁度滴定法[12]是在傳統(tǒng)濁點(diǎn)法的基礎(chǔ)上,用回滴水或回滴有機(jī)相的方法對濁點(diǎn)加以確定。濁度滴定法雖在一定程度內(nèi)提高了濁點(diǎn)的判定的準(zhǔn)確度,但反復(fù)滴加和每管至多測定一個(gè)濁點(diǎn),也在一定程度上增加了操作步驟的繁瑣度。安建平等[6]用吸光度法和電導(dǎo)率法分別測定PEG和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)帶替代傳統(tǒng)的稱重法,在臨界點(diǎn)的判定上并沒有做出改進(jìn)。
圖3 相圖精準(zhǔn)度驗(yàn)證
圖4 PEGs/(NH4)2SO4的雙水相體系相圖
表2 清-濁點(diǎn)輔助相圖制作法與其他相圖制作方法的比較
本文提出的清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法依據(jù)雙節(jié)線的定義修正了傳統(tǒng)上用濁點(diǎn)來表示臨界點(diǎn)的方法,提高了臨界點(diǎn)確定的準(zhǔn)確度,具有快捷簡便、試劑用量少和適用范圍廣等特點(diǎn);另外,清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法同時(shí)也傳承了傳統(tǒng)濁點(diǎn)法適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn),即不僅適用于PEGs/(NH4)2SO4的雙水相體系還適用于其他雙水相萃取體系的相圖制作,如高聚物-鹽、高聚物-高聚物、表面活性劑、離子液體等組成的雙水相體系。綜上,清-濁點(diǎn)輔助相圖制作法作為一種新型雙水相系統(tǒng)相圖制作方法,可以用于與雙水相萃取相關(guān)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)、科研及生產(chǎn)等領(lǐng)域。
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A Novel Method for Construction Aqueous Two-phase System Phase Diagram: Clear-cloud Points Aid Phase Diagram Establishment
GAOXiangyang1,MUHongtao2,FANGYin3
(1. Food College, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. College of Biological and Food Engineering, Guangdong Education Institute, Guangzhou 510303, China; 3. Public Basic Course Experimental Teaching Center, South China Agrical Telrel University, Guangzhou 510510, China)
Phase diagrams are essential and important in the application of aqueous two-phase extraction technology. Conventional methods in the determination of phase boundaries are inaccurate, complicated and time consuming. In this paper, we proposed a novel method to overcome these imperfections. Using adjustable-volume pipettes and pipette calibration method, the method proposed could steadily provide accurate phase diagrams in a short time. It was tested in the phase diagram of PEG/(NH4)2SO4, and the result showed extensive reliability. This method can be used in area of experiment teaching, scientific research, and industrial manufacture which related to aqueous two-phase extraction technology.
clear-cloud points aid phase diagram establishment; bimodal; microtitration; PEG/(NH4)2SO4aqueous two-phase extraction system
2016-05-13
國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(6130425);華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校級教學(xué)改革項(xiàng)目(JG14110)
高向陽(1966-),女,湖南麻陽人,博士,副教授,研究方向:食品生物化學(xué)。Tel.:13310896601;E-mail:xin-198310@163.com
1006-7167(2017)03-0016-04
TP 212
A