鼓槌石斛組培快繁技術(shù)體系研究

劉揚(yáng)++李宏楊++鐘祥濤++陳冠銘

摘 要 以鼓槌石斛八成熟蒴果為外植體，通過對(duì)其種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)、原球莖繼代增殖及生根壯苗培養(yǎng)基的篩選，建立鼓槌石斛的組培快繁技術(shù)體系。結(jié)果表明：1/2 MS+1.0 mg/L NAA+8.0%土豆泥+0.10%活性炭培養(yǎng)基效果較理想，種子萌發(fā)率較高，發(fā)芽快；最適增殖培養(yǎng)基為3/4 MS+3.0 mg/L 6-BA+8%香蕉泥，增殖系數(shù)可達(dá)7.23；最佳生根培養(yǎng)基為3/4 MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L CA+8%香蕉泥，平均根數(shù)量達(dá)7.49條。煉苗移栽到松樹皮作為栽培基質(zhì)的苗床上，1個(gè)月以后，成活率均達(dá)80%。

關(guān)鍵詞 鼓槌石斛 ；增殖培養(yǎng) ；活性炭 ；生根壯苗

中圖分類號(hào) R282.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.03.014

Tissue Culture-based Rapid Propagation of Dendrobium chrysotoxum Lindl

LIU Yang LI Hongyang ZHONG Xiangtao CHEN Guanming

（Sanya Sci-Tech Academy of Winter Breeding and Multiplication， Sanya， Hainan 572000）

Abstract Immature seeds of Dendrobium chrysotoxum Lindl were used as explants for tissue culture， and mediums for aseptic seed germination， subculture of protocomb， rooting and growth of strong plantlets were screened to establish a rapid propagation system for D. chrysotoxum lindl. The results showed that the medium 1/2 MS+1.0 mg/L NAA+8.0% mashed potato+1.0% activated carbon was optimum for seed germination， under which the seeds germinated fast with a higher germination rate. The optimum subculture medium was 3/4 MS+6-BA 3.0 mg/L+8% mashed banana， which gave a proliferation coefficient of 7.23. The optimum rooting medium was 3/4 MS+NAA 1.0 mg/L+CA 0.5 mg/L+8% mashed banana， and it produced 7.49 roots by average. The rooted plants were transferred to the seedbed with pine bark as the culture substrate and had a survival rate of 80% one month after transferring.

Keywords Dendrobium chrysotoxum Lindl ； proliferation ； activated carbon ； strong rooted plantlets

鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum Lindl）又名金弓石斛、粗黃草，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，主要分布在廣西、四川以及云南南部至西部等地。此外，印度東北部，緬甸，泰國(guó)，老撾以及越南等國(guó)家亦有分布[1-2]。鼓槌石斛是一種集食、藥、觀賞于一身的石斛種類。其花不僅具有很高的觀賞價(jià)值，還可作飲品及高檔菜肴的配料，有安神明目、補(bǔ)血美容、提高免疫力等；莖入藥則具有生津益胃、清熱養(yǎng)陰等功效，是收入《中國(guó)藥典》的五種石斛之一[3-4]。研究表明，鼓槌石斛含多種有效成分，如菲類、聯(lián)芐類、芴酮類、簡(jiǎn)單苯環(huán)衍生物及酯類等，具有抑制腫瘤細(xì)胞、滋陰、提高人體免疫力和防止衰老等作用[5]。傳統(tǒng)上，鼓槌石斛也用于治療熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱、陰傷目暗等癥，對(duì)咽喉和腸胃疾病、白內(nèi)障、心血管疾病、糖尿病具有明顯的療效。

隨著對(duì)鼓槌石斛研究的深入，其藥用需求量愈來愈大，因長(zhǎng)期掠奪性采挖，致使國(guó)內(nèi)野生鼓槌石斛資源日趨枯竭，加上自然條件下，其種子萌發(fā)率極低，野生鼓槌石斛已經(jīng)瀕臨滅絕[6-7]。為能滿足人們不斷增長(zhǎng)的需求，又能保護(hù)野生資源，人工栽培可為藥材市場(chǎng)提供石斛原料，對(duì)蘭科植物種質(zhì)資源的保育和藥用石斛的產(chǎn)業(yè)化栽培具有顯著的現(xiàn)實(shí)意義。

藍(lán)玉甜[8]等研究表明，以N6+2mg/L NAA+0.5 mg/L BA +10%香蕉汁+ 20 g/L蔗糖+0.5 g/L 牛肉蛋白胨+ 5.8 g/L瓊脂+0.5g/L AC培養(yǎng)出的苗整齊度高且均勻，但研究也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于鼓槌石斛生根壯苗培養(yǎng)基而言，活性炭的濃度以0.05%為最佳。當(dāng)活性炭的濃度≥0.10%時(shí)，就開始產(chǎn)生抑制效應(yīng)，AC濃度達(dá)到2.0%以上便出現(xiàn)死苗。為了更新培養(yǎng)基，建立更優(yōu)良的鼓槌石斛組培快繁技術(shù)體系，本研究進(jìn)行了種子無菌萌發(fā)試驗(yàn)、原球莖增殖試驗(yàn)、不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和不同活性炭濃度對(duì)鼓槌石斛生根壯苗影響等系列研究。

1 材料與方法

1.1 材料

采自海南省三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院蘭科植物資源圃，經(jīng)人工授粉八成熟的鼓槌石斛蒴果（圖1-C），經(jīng)表面消毒之后[9]，取其未成熟種子作為外植體材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

除去鼓槌石斛未成熟蒴果表面雜質(zhì)，沖洗干凈，用洗潔精搖洗3次，每次5 min，倒去洗潔液后，再?zèng)_洗，瀝干，轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)上。無菌條件下，以75%乙醇清洗消毒3 min，撈出后以無菌水沖洗3～4次，再用0.15% HgCl2消毒15 min，撈出后用無菌水沖洗4～5遍，瀝干備用。滅菌后的蒴果置于不銹鋼盤上，切除其兩端各約0.5 cm，然后中段縱向切開，夾取一塊，并將種子均勻撒在培養(yǎng)基上[10]。

1.2.2 培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)各階段材料均置于（25±2）℃和2 000～2 500 lx光照條件培養(yǎng)，每天用日光燈照明10 h照明（8：00～18：00）[11]。

1.2.3 試驗(yàn)配方

① 鼓槌石斛種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)基 試驗(yàn)了2種無菌發(fā)芽培養(yǎng)基，配方1附加有10.0%土豆泥和0.1%活性炭，配方2則不加土豆泥與活性炭；二者的其他組分相同。配方如下：1/2 MS無機(jī)鹽+肌醇200 mg/L+煙酸1.0 mg/L+鹽酸硫胺素2.0 mg/L+鹽酸吡哆素1.0 mg/L+甘氨酸2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖2.5 %+卡拉膠粉0.75 %；pH=5.8。

20 d后開始觀察發(fā)芽情況，連續(xù)記錄3個(gè)月。

②增殖培養(yǎng) 用鼓槌石斛原球莖作為繁殖體材料，每瓶接入10枚原球莖，每處理各接種5瓶，重復(fù)3次。采用以下9種培養(yǎng)基進(jìn)行原球莖增殖培養(yǎng)：供試的外源激素為KT和6-BA 2種，每種外源激素各設(shè)1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L 4個(gè)濃度梯度，以空白作對(duì)照（CK-a），基本培養(yǎng)基為1/2 MS。各處理的編號(hào)及外源激素的種類與濃度如表1所示，接種后3個(gè)月統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

③生根培養(yǎng) 用鼓槌石斛二葉期無菌苗作為實(shí)驗(yàn)材料，每瓶接5株，每處理各接種5瓶，重復(fù)3次。采用以下8種培養(yǎng)基進(jìn)行鼓槌石斛小苗生根培養(yǎng)：（1）3/4 MS；（2）3/4 MS+0.5 mg/L IBA ；（3）3/4MS+3.0 mg/L IBA ；（4）3/4 MS+0.5 mg/L NAA；（5）3/4 MS+1.0 mg/L NAA；（6）3/4 MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L AC；（7）3/4 MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L AC；（8）3/4 MS+1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L AC。以上培養(yǎng)基均加8%香蕉泥勻漿，以空白作為對(duì)照（CK-b）。接種3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)鮮重和生根數(shù)，

1.2.4 組培苗的移栽

鼓槌石斛移栽前幾天要煉苗。移栽前將培養(yǎng)瓶的蓋子擰松（不完全打開），并從培養(yǎng)室挪到蔭棚下放置2～3 d，然后將瓶蓋完全打開，再放置1～2 d。移栽時(shí)，用鑷子將苗從培養(yǎng)瓶中輕輕取出，小心操作，切忌傷害根系。將附著的瓊脂培養(yǎng)基洗凈后，用1∶800倍的多菌靈和1∶800倍的百菌清混合液浸泡20 min消毒，然后移栽到用松樹皮作為栽培基質(zhì)的苗床上。移栽后注意要用75%遮陽網(wǎng)遮蔭，并注意要適當(dāng)控制水分和溫度，避免陽光直射，注意控溫保濕[7]（圖1-A、1-B、1-D）。移栽1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用新復(fù)極差法檢驗(yàn)，α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)

鼓槌石斛未成熟種子接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上1處理進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，萌發(fā)速度較快，原球莖增殖多，出苗整齊。經(jīng)約20 d培養(yǎng)，可在培養(yǎng)基表面觀察到肉眼可見的綠點(diǎn)，這些綠點(diǎn)即是鼓槌石斛種子經(jīng)過這段時(shí)間的離體培養(yǎng)之后種胚已發(fā)育成為成熟的原球莖體（淺綠色），其中發(fā)育較快的原球莖體已經(jīng)形成子葉。至離體培養(yǎng)30 d左右時(shí)，在培養(yǎng)基表面可看到除了多數(shù)部位分布著比較均勻的一薄層淺綠色的成熟原球莖外，也有不少成堆的直徑在0.5～2.0 mm不等的綠色球狀物，這種綠色球狀物實(shí)際上是在接種時(shí)種子分散不均勻，以后種胚發(fā)育成成熟的原球莖體之后，相互堆疊在一起，形成綠色球狀顆粒。隨后，原球莖體相繼發(fā)育成苗，并伴有新增殖出來的原球莖體形成；成熟的原球莖體在離體培養(yǎng)的過程中萌發(fā)出子葉和真葉，至接種后第80天左右，整個(gè)培養(yǎng)基的表面以及培養(yǎng)基表面1.0～1.5 cm厚的空間內(nèi)，均充滿了具1～2片真葉的鼓槌石斛實(shí)生小苗，以及位數(shù)不少的新增殖而形成的原球莖體。此時(shí)，未成熟種子的無菌萌發(fā)過程即告完成，應(yīng)及時(shí)將實(shí)生苗轉(zhuǎn)接到新配制的生根壯苗培養(yǎng)基上，或?qū)⒃蚯o體轉(zhuǎn)接到新配制的增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。經(jīng)過表面消毒處理的鼓槌石斛種子接種到發(fā)芽培養(yǎng)基2處理進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，種子的萌發(fā)速度較慢，直到60 d后才能在培養(yǎng)基的表面觀察到肉眼可見的綠點(diǎn)。離體培養(yǎng)90 d時(shí)才少數(shù)成苗，但顏色較淡，長(zhǎng)勢(shì)較差。

2.2 鼓槌石斛原球莖增殖培養(yǎng)

不同激素濃度對(duì)鼓槌石斛增殖培養(yǎng)的影響見表1。從表1可看出，與對(duì)照相比，向培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素KT與6-BA都顯著提高了原球莖的增值率。其中，對(duì)于添加KT的配方而言3.0 mg/L KT濃度的增值率顯著高于其它濃度處理；對(duì)于添加6-BA的配方而言3.0 mg/L 6-BA濃度的增值率顯著高于其它濃度處理。添加3.0 mg/L KT與3.0 mg/L 6-BA之間無顯著差異。但生長(zhǎng)表現(xiàn)來看，添加外源激素KT增殖出來的小苗容易畸形，3.0 mg/L KT增殖率雖然比較高，但小苗畸形，葉片卷縮。說明，適用于鼓槌石斛的增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基是1/2 MS+3.0 mg/L 6-BA，增殖倍數(shù)在7左右。

2.3 無菌小苗生根培養(yǎng)

不同濃度激素和活性炭對(duì)鼓槌石斛生根壯苗的影響見表2。從表2以看出，不同濃度的生長(zhǎng)素IBA和NAA對(duì)試管苗生根數(shù)和鮮重影響較大，與對(duì)照相比，培養(yǎng)基中添加IBA和NAA顯著提高了生根數(shù)和鮮重，但I(xiàn)BA濃度0.5與3.0 mg/L沒有顯著性差異，而NAA濃度0.5與1.0 mg/L存在顯著性差異，NAA添加濃度1.0 mg/L時(shí)平均生根數(shù)達(dá)到6.53；添加不同濃度的活性炭對(duì)試管苗影響較為明顯，濃度在0.5 mg/L時(shí)，平均生根數(shù)可達(dá)7.49，顯著優(yōu)于其它處理，隨著濃度的增加，生根數(shù)顯著下降。添加活性炭后的鼓槌石斛小苗的根明顯變粗，在后續(xù)的生產(chǎn)實(shí)踐中，配方3/4 MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L AC培養(yǎng)出來的無菌苗表現(xiàn)良好，植株粗壯，根長(zhǎng)且壯（圖1-A，1-B）。

2.4 鼓槌石斛組培苗移栽后成活情況

鼓槌石斛的組培苗移栽到松樹皮作為栽培基質(zhì)的苗床上之后，經(jīng)過1個(gè)月的精細(xì)管理，絕大部分植株即可發(fā)出新根，成活率達(dá)到80%以上。移栽后要特別注意兩點(diǎn)，一是定期及時(shí)噴施殺菌劑，防止?fàn)€根爛苗。移栽前用1∶800倍的多菌靈和1∶800倍的百菌清混合液浸泡20 min，并及時(shí)取出攤晾2 h再移栽到苗床上，然后再定植到苗床上。以后每3 d 噴施1次1∶800倍的多菌靈和1∶800倍的百菌清混合液，連續(xù)15次，以后視苗情況和天氣再定。二是注意水分管理，不能噴水太多，太多容易導(dǎo)致爛苗爛根；太少則容易脫水枯萎而死苗。一般宜于晴天早上噴霧2～3 min，視情況決定是否再噴水1次，下午18：00 左右，如天氣太熱，基質(zhì)太干燥，再噴霧2～3 min。如為陰雨天氣，則不宜噴霧。栽培基質(zhì)太濕時(shí)，不噴水；中午不宜噴水。

3 討論

一般認(rèn)為，活性炭能吸附組培苗生長(zhǎng)發(fā)育過程中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物；而且加入一定量的活性炭之后，有助于在無菌苗的基部營(yíng)造出一個(gè)較暗的局部環(huán)境，進(jìn)而有利于根系生長(zhǎng)發(fā)育。因此，在眾多組培研究中，或在組培苗工廠化生產(chǎn)實(shí)踐中，在生根壯苗培養(yǎng)階段，往往會(huì)在培養(yǎng)基中加入一定濃度的活性炭。前人研究結(jié)果表明，添加0.5%活性炭和香蕉汁能促進(jìn)試管苗根的生成和生長(zhǎng)[8，12]。本研究注意到，對(duì)于鼓槌石斛而言，活性炭的最佳濃度為0.05%，當(dāng)活性炭的濃度≥0.10%時(shí)，開始產(chǎn)生抑制效應(yīng)，這與高燕[13]等研究結(jié)果有所差異，在生根壯苗培養(yǎng)基中添加0.1%AC生根壯苗效果并沒有0.05% AC效果好。因此，是否加入活性炭，以及加入的多少，均有必要通過一系列濃度梯度試驗(yàn)來驗(yàn)證。活性炭在吸附有毒或有害代謝產(chǎn)物時(shí)，也會(huì)強(qiáng)烈吸附培養(yǎng)基中所加入的外源激素、維生素以及大部分礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分。因此，活性炭的濃度一定要控制在恰到好處，否則會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面作用[14]。

本實(shí)驗(yàn)在使用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度及附加物的種類與前人有所不同，為的是進(jìn)一步尋找生根壯苗的最優(yōu)培養(yǎng)基配比。結(jié)果表明，鼓槌石斛幼苗在以生根培養(yǎng)基為：3/4 MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L CA+8%香蕉泥，（25±2）℃和2 000～2 500 lx光照條件下培養(yǎng)，每天用日光燈照明10 h條件下培養(yǎng) 90 d后苗高最高可達(dá)10～12 cm、生根數(shù)多（平均 7.49條），出苗整齊，適合批量生產(chǎn)。

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