干旱處理對澳洲堅果光合特性的影響

王文林++陳海生++鄭樹芳++譚秋錦+覃振師++黃錫云++賀鵬++湯秀華++許鵬

摘 要 為探究澳洲堅果‘桂熱1號苗期對干旱的生理響應機制，研究該品種在持續(xù)干旱處理7 d的葉片含水量、光合色素含量、熒光參數、滲透調節(jié)物質和保護酶活性的變化規(guī)律。結果表明：隨著干旱程度的增加，‘桂熱1號土壤含水量和葉片含水量均呈逐漸下降趨勢，在斷水7 d最為明顯。干旱導致‘桂熱1號葉綠素含量顯著下降，但胡蘿卜素含量先升后降。光合速率在斷水5和7 d下降明顯，伴隨著活性氧清除酶活性下降。表明，‘桂熱1號對干旱的自身調控能維持5 d。

關鍵詞 澳洲堅果 ；桂熱1號 ；干旱 ；光合活性 ；活性氧

中圖分類號 S664 文獻標志碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.03.013

Effects of Drought on the Photosynthesis of Macadamia integrifolia

WANG Wenlin CHEN Haisheng ZHENG Shufang TAN Qiujing

QIN Zhenshi HUANG Xiyun HE Peng TANG Xiuhua XU Peng

（Guangxi Research Institute of South Subtropical Agriculture， Longcuan， Guangxi 532400）

Abstract The plants of macadamia variety‘Guire 1（Macadamia integrafolia） were treated with drought for 7 days， and their leaf water content， chlorophyll contents， fluorescence parameters， osmoregulation substance and protective enzyme activities were determined to elucidate the mechanisms of their physiological response to drought. The results showed that soil water content and leaf water content of macadamia‘Guire 1tended to decrease gradually with an increase in drought stress， most obviously at the 7th day of drought stress. Under drought stress the leaf chlorophyll content decreased significantly while the leaf β-carotene content first increased and then decreased. Both photosynthetic rate and ROS scavenging enzyme activities decreased at the days 5 and 7 under drought stress. This indicated that the macadamia Guire 1 could regulate drought stress by itself for 5 days.

Keywords Macadamia integrafolia ；‘Guire 1； drought ； photosynthetic activity ； ROS

澳洲堅果（Macadamia integrifolia Maiden & Betche.）又名昆士蘭果、夏威夷果、澳洲胡桃，屬山龍眼科澳洲堅果屬果樹[1]。干旱是植物重要的非生物脅迫之一，抑制植物生長和產量[2-3]。研究表明，干旱會影響植物線粒體的呼吸作用[4]，影響根系生長和根際養(yǎng)分的吸收，抑制植物生長并導致光合作用下降[5-6]。植物受到干旱脅迫后，首先是通過關閉氣孔以減少蒸騰作用，進而阻礙CO2進入葉內，通過氣孔和非氣孔因素影響玉米葉片光合作用[7]。至今，葉綠素熒光動力學參數是快速、靈敏、無損傷的研究和探測干旱逆境對植物光合作用影響的理想方法[8-9]。在干旱脅迫下，植物體內會產生過量的活性氧，滲透調節(jié)物質如脯氨酸、可溶性糖和一些重要的保護酶不斷積累，清除體內活性氧，降低細胞滲透壓維持葉片水分含量，維持植物體內的平衡和正常代謝[10-14]。雖然，堅果類抗旱研究已有一定進展[15-16]，但相對較少。國外學者發(fā)現，干旱對澳洲堅果的發(fā)育和成熟具有顯著影響，應及時灌水防止產量和品質的損失[17]。然而，堅果抗旱的生理機制尚不清楚。為了能在干旱或貧瘠地區(qū)推廣該品種，本文利用‘桂熱1號進行為期7 d的干旱處理，通過測定土壤含水量、葉片含水量來研究‘桂熱1號受旱程度，測定葉綠素含量和葉綠素熒光動力學參數來探究干旱對‘桂熱1號光合作用的影響，測定‘桂熱1號體內的滲透調節(jié)物質的含量和活性變化，研究它們在干旱脅迫下所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

參試澳洲堅果品種為通過國家品種審定的‘桂熱1號，為3年生嫁接繁殖苗。幼苗于6月中旬定植，隨機區(qū)組設計，3個重復，每小區(qū)每品種20株。采用斷水處理7 d的方法，樣品采集后每隔1 d采樣分析。選取生長健壯、無病蟲害的成熟枝條，采集頂部往下第2輪葉1片（要求葉色好、無病蟲），共80片。

1.2 方法

1.2.1 土壤和葉片含水量測定

土壤和葉片含水量測定采用烘干法。在烘干前稱取土壤和葉片的鮮重，在45℃烘箱中烘干24 h后稱重，計算相對含水量。公式如下：

葉片相對含水量=（鮮重-干重）×100%/鮮重；

土壤相對含水量=（鮮重-干重）×100%/鮮重。

1.2.2 葉綠素含量測定

稱取一定量的葉片置于80% 5 mL冰凍丙酮中，快速研磨，在5 000 r/min轉速下離心5 min，取上清。用紫外—可見分光光度計（GE UltrospecTM 2100 pro UV/Visible Spectrophotometer，USA）分別測量上清在470、645、663 nm波長下的OD值，以80%丙酮作為對照，進行3次生物學重復，按Lichtenthalerl[18]方法計算單位鮮重的葉綠素（Chl）和β-胡蘿卜素（β-Car）的含量。

1.2.3 光合熒光參數測定

利用PAM-2500便攜式熒光儀（Walz，Germany）測定干旱處理后的玉米葉片葉綠素熒光誘導動力學參數，先暗處理30 min再測定，可獲得初始熒光F0、最大熒光FM、PSⅡ的最大光量子產量FV/ FM、處理后的最小熒光F0′、光下最大熒光 FM′、實際PSⅡ的量子產量ΦPSⅡ、光化學淬滅系數qP、非光化學熒光淬滅系數qN、非光化學熒光淬滅NP、PSⅡ天線光化學熒光淬滅系數qL、PSⅡ有效光化學量子產量Y（Ⅱ）、非調控熱耗散和熒光發(fā)射的量子產量Y（NO）、光誘導非光化學熒光淬滅量子產量Y（NPQ）和相對電子傳遞速率ETR等參數。

1.2.4 脯氨酸和可溶性糖含量測定

脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮比色法。取適量葉片稱重，再置于5 mL 3%磺基水楊酸快速研磨，沸水煮10 min，取2 mL提取液加2 mL 冰醋酸和2 mL茚三酮，水浴40 min，冷卻后用4 mL甲苯震蕩抽提，吸取上層甲苯相，以甲苯為對照，測定OD520值。根據脯氨酸含量（μg/g）=[（OD520-0.015 7）×5/2]/（樣品鮮重×0.062 1×1 000），計算葉片單位鮮重中脯氨酸含量。

可溶性糖含量測定采用蒽酮法，取適量葉片稱重，置于5 mL蒸餾水，直接沸水浴30 min，取0.5 mL上清依次加入1.5 mL蒸餾水、0.5 mL 蒽酮、5 mL 濃硫酸，水浴1 min，對照組依次加入2 mL蒸餾水、0.5 mL蒽酮、5 mL濃硫酸，水浴1 min，測OD630，進行2次生物學重復?？扇苄蕴堑挠嬎愎綖椋?/p>

可溶性糖含量（μg/g）=[（OD630-0.002 5）×5/2]/（0.675 2×1 000×樣品鮮重）[19]。

1.2.5 過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性測定

過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，稱取適量的玉米葉片，置于5 mL 100 mmol/L磷酸緩沖液快速研磨，4 000 r/min，4 ℃，10 min 離心，取750 μL上清加3倍上清的現配現用反應液（10 mL磷酸緩沖液加5.6 μL愈創(chuàng)木酚、3.8 μL過氧化氫）測OD470，對照以750 μL的100 mmol/L磷酸緩沖液加3 倍上清反應液。

POD 酶活性（μg/min）=（△A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）

△A470：反應時間內吸光值變化；Vt：提取溶液總體積，mL；W：鮮重，g；t：反應時間，min；Vs：測定時溶液體積，mL。

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）法，稱取適量的玉米葉片，置于5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液快速研磨，1 000 r/min，4℃，20 min，向玻璃管中分別1.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液、0.3 mL 130 mmol/L MET 溶液、0.3 mL 750 μmol/L NBT溶液、0.3mL 100 μmol/L EDTA-Na2 溶液、0.3 mL 20 μmol/L核黃素溶液，最后處理組加0.3 mL上清，對照組2份都加0.3 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（一支放冰箱作為對照，一支用光照），4 000 lx 光照20 min。

SOD 酶活性=[（Ack-AE）×V]/（0.5×Ack×W×Vt）

其中，Ack：照光對照管的吸光度；AE：樣品管的吸光度；V：樣品溶液總體積，mL；W：樣品鮮重，g；Vt：測定時樣品體積，mL。

1.2.6 統(tǒng)計分析

試驗均為3次重復，采用Microsoft Excel 2013計算試驗數據平均值，SAS 9.0進行差異顯著性分析，作圖使用origin8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 干旱對‘桂熱1號土壤含水量和葉片含水量的影響

干旱對‘桂熱1號土壤含水量和葉片含水量的影響見圖1。從圖1可看出，隨著干旱天數的延長，土壤含水量從干旱第3天起顯著下降，由干旱初期的48.03%下降到7 d的6.77%。葉片含水量在處理的前5 d無明顯差異性變化，在處理7 d顯著性下降，從干旱0 d的89.80%下降到7 d的73.65%。

2.2 干旱對‘桂熱1號色素組成的影響

在干旱處理下，‘桂熱1號葉片中的色素含量變化如圖2所示。葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和總葉綠素（Chla+b）的變化趨勢相似，在處理1 d，二者的含量均顯著性下降。隨著干旱程度的加重，二者的含量仍然呈現出先顯著下降，再顯著上升。Chla/b在處理初期含量變化不顯著，在處理第5天顯著下降。β-Car在處理第3天呈顯著上升，隨后顯著下降。

2.3 干旱對‘桂熱1號光合熒光參數的影響

干旱對‘桂熱1號光合熒光參數的影響見圖3。由圖3可知，玉米在干旱脅迫下的葉綠素熒光參數的變化。F0在干旱處理的7 d中略有下降，但變化趨勢不顯著。應用飽和閃光后，測得的FM在干旱脅迫過程中持續(xù)減少，直到處理7 d FM顯著下降。FV/FM在處理前期無顯著性變化，干旱第7 天顯著減少。qL、Y（NO）和qP在干旱期間無明顯變化，qN在干旱第3 天顯著下降，隨后又顯著上升，Y（NPQ）變化趨勢與之相同。NPQ在處理第3天也存在下降的現象，但其在處理的第1天和第5天均顯著上升。ΦPSⅡ、Y（Ⅱ）、ETR在干旱處理前期無明顯變化，至第5天顯著下降。

2.4 干旱對‘桂熱1號抗旱相關生理指標的影響

在干旱處理的7 d中，‘桂熱1號葉片中Pro含量在處理第3天顯著性下降，第5天呈顯著上升現象，至第7 d葉片中檢測到的脯氨酸含量極低（圖4）?？扇苄蕴堑暮坑商幚黹_始的顯著下降到處理第3天的最低值，再到處理第5天的顯著上升，但含量始終低于處理前。POD在干旱中，其活性在脅迫開始時就顯著下降，隨著干旱天數的增加，POD的活性不發(fā)生顯著性變化。干旱處理下，‘桂熱1號葉片中SOD活性無顯著性變化。

3 討論與結論

植株對干旱脅迫的第一響應就是通過氣孔關閉避開低水勢，由于氣孔關閉導致CO2同化量的減少，是光合作用下降的主要原因之一[20]。另一個原因是葉綠體結構發(fā)生變化[21]，光合色素降解，使光合電子傳遞系統(tǒng)遭到破壞，光合磷酸化受到抑制，引起水解酶的活性上升而合成酶的活性下降，從而導致光合速率下降[22]。Chla多位于葉片葉綠體類囊體膜PSII反應中心蛋白復合體，而Chlb多位于葉片葉綠體類囊體膜捕光色素天線蛋白復合體，二者的比值反映葉綠體類囊體結構的變化。本研究中，土壤含水量在干旱處理3 d后顯著減少，Chla和Chlb含量在干旱處理開始就顯著下降，在處理3 d后，其含量又顯著上升，推測是植物體自身對干旱的調節(jié)作用。但Chlb含量仍比處理前的低，其降解的速率比Chla快。β-Car在干旱第3天時顯著上升，但隨后顯著下降。說明通過β-Car吸收光能，來抵抗干旱脅迫只能維持到第3天。Chla/b在干旱前3 d無明顯變化，但至第5天時顯著下降，說明‘桂熱1號在干旱脅迫下，光合色素的正常有效生成只能維持3 d。

干旱引起的光合速率下降和氣孔關閉，都會使光合機構PSⅡ中光能過剩，導致PSⅡ活性和卡爾循環(huán)電子需求間能量的不平衡，最終損傷光合機構[20-21]。在本研究中，FM在干旱處理下持續(xù)下降，至第7天顯著下降，即通過PSⅡ的電子傳遞發(fā)生變化。同樣FV/FM也是在處理第7天顯著性下降，說明PSⅡ反應中心內光能轉化效率減弱。非光合化學淬滅是植物的一種自我保護機制，能夠以熱能的形式消耗植物體內多余的光能，防止植物在遭受環(huán)境脅迫時引發(fā)的光合結構破壞。干旱第1天 NPQ顯著上升，但至第3天 qN和NPQ都顯著下降。ΦPSⅡ和ETR在干旱5 d顯著下降，Y（Ⅱ）在干旱3 d顯著下降。說明‘桂熱1號在干旱第5天時，PSⅡ反應中心已受到傷害。

當植物體內能量過剩時，會引發(fā)過量的活性氧產生，造成氧化脅迫，使膜系統(tǒng)受到破壞[18]。植株體內具有一套活性氧的清除體系，如滲透調節(jié)物質脯氨酸、可溶性糖和一些保護酶。該體系能夠清除逆境脅迫下植物體內的自由基和活性氧，維持植物體內的平衡和正常代謝。在本研究中，‘桂熱1號隨著干旱程度加重SOD的含量略有上升，但變化不顯著。在部分植物中SOD的活性會隨著脅迫的強度不斷增大呈先升后降[25]，呈先降后升的趨勢，或一直下降[26]，或保持不變[27]。POD在干旱初期就顯著下降，隨著干旱程度的加重，其含量無明顯變化。在‘鄭單958和‘陜單902品種中，干旱脅迫使Pro、可溶性糖、SOD、POD含量升高[28-29]。本研究中，Pro和可溶性糖的含量在土壤含水量明顯減少時均顯著性下降，在干旱5 d時，可溶性糖含量顯著上升，但仍低于處理前的水平。這些物質的下降與植物體內的活性氧大量爆發(fā)，對植物體造成傷害。研究表明，‘桂熱1號對干旱有一定的抗性，它的耐旱性能維持5 d，農業(yè)種植時應在干旱5 d后進行灌溉。

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