劉升，江雅麗，付強(qiáng)，史慧君，李爽，孟露萍，郭飛，張輝，陳創(chuàng)夫

(1.新疆石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；4.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832003)

新疆羊種布魯氏菌分離株的鑒定與L7/L12蛋白的原核表達(dá)和生物信息學(xué)分析

劉升1，江雅麗2，付強(qiáng)3，史慧君3，李爽1，孟露萍1，郭飛4，張輝1，陳創(chuàng)夫1

(1.新疆石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；4.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832003)

【目的】分離并鑒定新疆羊種布魯氏菌。原核表達(dá)該菌的L7/L12蛋白，檢測(cè)該蛋白的反應(yīng)原性及進(jìn)行部分生物學(xué)分析。【方法】采用細(xì)菌劃線培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、PCR檢測(cè)以及生化試驗(yàn)進(jìn)行布魯氏菌分離鑒定。利用常規(guī)分子生物學(xué)方法表達(dá)并純化羊種布魯氏菌分離株的L7/L12蛋白，應(yīng)用Western Blot分析融合蛋白的反應(yīng)原性。使用生物信息學(xué)軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析?！窘Y(jié)果】分離鑒定確定該菌株為羊種布魯氏菌。經(jīng)過測(cè)序與酶切鑒定，正確構(gòu)建了表達(dá)載體pET-28a-L7/L12. SDS-PAGE試驗(yàn)顯示純化的L7/L12蛋白為單一條帶；經(jīng)過Western Blot檢測(cè)，該融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。生物信息學(xué)分析顯示，該蛋白無跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，不存在信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋為主并利用 Phyre2 服務(wù)器成功構(gòu)建了該蛋白的三維模型?！窘Y(jié)論】鑒定出該分離菌株，表達(dá)并純化了該菌的L7/L12融合蛋白，Western Blot證明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為后續(xù)該蛋白的亞單位疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

羊種布魯氏菌；L7/L12；蛋白純化；反應(yīng)原性；生物學(xué)

0 引 言

【研究意義】布魯氏菌病(Brucellosis)簡(jiǎn)稱布病，是由革蘭氏染色陰性、兼胞內(nèi)寄生的布魯氏菌(Brucella)引起的一種人獸共患傳染病[1]。動(dòng)物感染后，主要引起母畜的不孕、流產(chǎn)和公畜的睪丸炎等[2]。人感染后，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、脊柱炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者喪失勞動(dòng)力[3]。全世界每年超過50×104人被感染，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失近30×108美元[4]。新疆是我國(guó)重要的牧區(qū)，也是我國(guó)布魯氏菌病的高發(fā)區(qū)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，布魯氏菌病在新疆80余縣、市和13個(gè)兵團(tuán)師局均有不同程度的流行，造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)幾個(gè)億[5-6]。研究對(duì)新疆羊種布魯氏菌分離株L7/L12蛋白進(jìn)行表達(dá)、鑒定，生物信息學(xué)初步分析其結(jié)構(gòu)性質(zhì)，期待能對(duì)后續(xù)研制適合新疆本地化新型亞單位疫苗制備提供幫助?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】L7/L12是布魯氏菌的一種核糖體蛋白，該蛋白參與布魯氏菌胞內(nèi)蛋白合成[7]。目前，對(duì)L7/L12蛋白的研究主要集中于保護(hù)性抗原和布魯氏菌致病過程中的作用機(jī)制研究?，F(xiàn)有報(bào)道，利用L7/L12蛋白免疫動(dòng)物后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，并且具有一定的保護(hù)力[8]。利用減毒沙門氏菌異源表達(dá)牛種布魯氏菌的L7/L12融合蛋白免疫動(dòng)物后，可保護(hù)機(jī)體免受牛種布魯氏菌野毒株的感染[9]。此外，一些研究也發(fā)現(xiàn)，L7/L12蛋白能夠刺激牛外周血淋巴細(xì)胞的增殖，使其分泌IFN-γ，并且L7/L12蛋白對(duì)布魯氏菌脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用[10]。Sergio等證明L7/L12蛋白可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化，刺激CD4+細(xì)胞釋放IFN-γ因子，對(duì)牛布魯氏菌病具有較好的防御能力[11,12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】從新疆某羊場(chǎng)流產(chǎn)羔羊體內(nèi)分離出鑒定出布魯氏菌，并原核表達(dá)其L7/L12蛋白，進(jìn)行部分生物信息學(xué)分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究新疆該羊場(chǎng)布魯氏菌的感染情況，為該羊場(chǎng)免疫措施的制定提供了依據(jù)。對(duì)L7/L12蛋白原核表達(dá)、生物信息學(xué)分析，為制備本地化該分離株新型亞單位疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 羊胎兒與菌株

新疆地區(qū)某羊場(chǎng)流產(chǎn)胎兒1只，12 h內(nèi)收集新鮮病料；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)為研究室保存；pMD19-T Simple載體購(gòu)自Takara公司；表達(dá)載體pET-28a購(gòu)自Promega公司。

1.1.2 主要試劑

卡那霉素、氨芐霉素、IPTG和NC膜購(gòu)自Solarbio公司；2×EsTaqMasterMix、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒、DNA分子量Marker、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物公司；限制性核酸內(nèi)切酶(BamHⅠ、XhoⅠ)、T4DNA連接酶、solutionⅠ連接酶均購(gòu)自Takara公司；膜封閉液、DAB增強(qiáng)型顯色試劑盒從天根生化科技有限公司購(gòu)置；蛋白分子量Marker購(gòu)自Thermo公司；蛋白純化HisTrapTM FF柱購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司，弗氏完全佐劑購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器

PCR儀(BIO-RAD)；UVP凝膠成像系統(tǒng)；高速冷凍離心機(jī)(Sigma，2-16K)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162)；Nanodrop 2000分光光度計(jì)；AKTAxpress智能多維純化系統(tǒng)(蛋白純化儀)；生物安全柜(Esco，Class Ⅱ-biohazard safe cabinet)；微量移液器(eppendorf)。

1.1.4 培養(yǎng)基

布魯氏菌固體培養(yǎng)基(TSA)、布魯氏菌液體培養(yǎng)基(TSB)、布魯氏菌鑒別培養(yǎng)基(BMB)、酵母提取物、胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；氯化鈉購(gòu)置于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物

研究所用的引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。列出引物序列。表1

表1 PCR引物序列
Table 1 Nucleotide sequences of PCR primers

引物Primer序列(5’→3’)Sequences(5’→3’)omp25-NGAATTCATGCGCACTCTTAAGTCTCTCGTA(EcoRⅠ)omp25-CGTCGACGAACTTGTAGCCGATGCCGAC(SalⅠ)L7/L12-NGGATCCATGGCTGATCTCGCAAAGATC(BamHⅠ)L7/L12-CCTCGAGTTACTTGAGTTCAACCTTGGCG(XhoⅠ)

1.2.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

P2級(jí)別實(shí)驗(yàn)室內(nèi)于生物安全柜中，取流產(chǎn)胎兒的脾臟劃線培養(yǎng)于布魯氏菌鑒別培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)菌。48～72 h后對(duì)細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，利用改良萋-尼染色法對(duì)細(xì)菌染色后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，初步鑒定陽(yáng)性的布魯氏菌。

1.2.3 PCR鑒定

將初步鑒定為陽(yáng)性的布魯氏菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，取0.5 mL菌液熱滅活后，作為PCR模版，利用omp25-N和omp25-C引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 55 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.4 生化鑒定

將PCR鑒定為陽(yáng)性的布魯氏菌按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》送至中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，對(duì)布魯氏菌進(jìn)行生化鑒定，并命名。

1.2.5 L7/L12基因的擴(kuò)增

以熱滅活的該分離株為模板，用L7/L12-N和L7/L12-C的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.6 pMD19-T-L7/L12克隆載體的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收后，與pMD19-T simple載體連接。連接產(chǎn)物通過熱擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)過氨芐抗性篩選和PCR鑒定后，將陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI進(jìn)行酶切鑒定。將酶切鑒定正確的陽(yáng)性菌送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序分析。

1.2.7 pET-28a-L7/L12表達(dá)載體的構(gòu)建

將pMD19-T-L7/L12質(zhì)粒和pET-28a質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，酶切后的pET-28a載體片段和L7/L12目的基因片段進(jìn)行凝膠回收，將兩個(gè)片段使用solution I連接。連接產(chǎn)物通過熱擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)過抗性篩選和PCR鑒定后，將陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI進(jìn)行酶切鑒定。將酶切鑒定正確的陽(yáng)性菌送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序分析。

1.2.8 重組蛋白L7/L12的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的克隆菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)后，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)OD600nm≈0.4～0.6，取1 mL作為對(duì)照，剩余菌液中加入IPTG(終濃度為1 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)。在至誘導(dǎo)后0、2、4、6和8 h分別取樣1 mL，離心后，棄去上清，對(duì)細(xì)菌沉淀進(jìn)行處理后，SDS-PAGE電泳分析。

1.2.9 重組蛋白L7/L12的純化

將重組蛋白L7/L12誘導(dǎo)表達(dá)的菌體重懸于Lysis Buffer(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，pH 8.0)中，液氮和42℃水浴反復(fù)凍融三次后超聲破菌，每次超聲10s，間歇10s，99次/周期，直至菌體清亮為止。12 000 r/min離心15 min，取上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)位置。根據(jù)重組蛋白的表達(dá)位置，用AKTA express智能多維純化系統(tǒng)(蛋白純化儀)純化目的蛋白。將純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)蛋白的純化效果。

1.2.10 重組蛋白L7/L12的反應(yīng)原性檢測(cè)

利用Western Blot分析重組蛋白L7/L12的反應(yīng)原性。純化后的重組蛋白L7/L12經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜至NC膜上，用封閉液37℃封閉1 h，隨后用TBST Buffer(20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.05%(v/v) Tween 20)漂洗三次；用布魯氏菌陽(yáng)性血清作為一抗，37℃孵育1 h，TBST Buffer漂洗三次；用辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG(1∶5 000)作為二抗，37℃孵育1 h，TBST Buffer漂洗三次；利用DAB底物顯色試劑盒進(jìn)行顯色，觀察重組蛋白L7/L12的反應(yīng)原性。

1.2.11 生物信息學(xué)分析目的蛋白

通過 TMHMM Server v.2.0 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ ) 在線分析L7/L12蛋白的氨基酸序列，預(yù)測(cè)其蛋白跨膜區(qū)；應(yīng)用SignalP 4.1 Server在線預(yù)測(cè) L7/L12 蛋白的信號(hào)肽 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；SOPMA在線軟件預(yù)測(cè) L7/L12蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl )；Phyre2 構(gòu)建L7/L12蛋白三維結(jié)構(gòu)模型(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/webscripts/jobmonitor.cgi? Jobid = d97 9042d57b9240b)；使用 PDBsum Generate( http: //www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/ pdb-sum / Generate.html ) 在線對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 布魯氏菌形態(tài)學(xué)觀察及omp25 PCR鑒定結(jié)果

取流產(chǎn)羊胎兒脾臟病料，培養(yǎng)72 h后，肉眼觀察到5個(gè)邊緣整齊、呈露滴狀、折光較亮的單克隆菌落，符合布魯氏菌的菌落形態(tài)。對(duì)5個(gè)單克隆菌落進(jìn)行改良萋-尼染色，發(fā)現(xiàn)其中有1個(gè)菌落鏡下為單一的紅色短球桿菌。將該菌落擴(kuò)繁后，進(jìn)行PCR鑒定，在大約650 bp處出現(xiàn)了預(yù)期大小的條帶。通過以上的結(jié)果，初次判定布魯氏菌，命名為015株。圖1

2.2 生化鑒定

經(jīng)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所對(duì)布魯氏菌的鑒定結(jié)果表明，從流產(chǎn)胎兒脾臟中分離獲得的布魯氏菌為羊種布魯氏菌生物3型。表2

2.3 L7/L12基因的擴(kuò)增

以金屬浴滅活的015株為模板，高保真擴(kuò)增出目的片段，位于375 bp左右，鑒定結(jié)果與預(yù)期一致。圖2

1：布魯氏菌015株；2：布魯氏菌16M株；3：陰性對(duì)照；M：DNA marker DL2 000

Lane 1:Brucella015; Lane 2:Brucella16M; Lane 3: negative control; Lane M: DNA marker DL2,000

圖1 布魯氏菌omp25基因PCR鑒定
Fig.1 Identification ofBrucellaomp25 gene PCR

1-3:PCR產(chǎn)物，4:陰性對(duì)照，M: DNA markerⅡ

Lane 1-3: the product of L7/L12 gene; Lane 4: negative control; Lane M: DNA markerⅡ

圖 2 L7/L12基因的擴(kuò)增
Fig.2 Amplification of L7/L12 gene by PCR表2 布魯氏菌015株的生化鑒定結(jié)果
Table 2 Biochemical identification of theBrucella015 strain

項(xiàng)目Item015標(biāo)準(zhǔn)株 Thestandardstain16M544A1330SCO2需求 CO2requirement————H2S產(chǎn)生 H2Sproduction—++++++三勝黃素 Acriflavin————染料抑菌aDyeinhibition硫堇++—+復(fù)紅+++—噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)(RTDb)LysitictestofphageTbRTD——+—Tb104RTD——++Iz+BK2++++單項(xiàng)特異性血清凝集cAgglutinationtestofMonospecificserumA+—++M++——R————鑒定結(jié)果Results種羊羊牛豬生物型3111

a： 布魯氏菌固體培基中染料濃度20 μg/mL (1:50 000)；b：RTD：常規(guī)試驗(yàn)稀釋度(在增殖菌中完全裂解的最高稀釋度)；c：A=A單因子血清，M=M單因子血清，R=R單因子血清；d：16M、544A、1 330S分別為羊種、牛種、豬種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株

a: Dye concetration ofBrucellaagar medium 20 μg/mL (1:50,000); b: RTD: The rac of rational test dilution (the highest dilution rate, at which the Tb phage completely lysesBrucellaspp; c: A-A mono-specific serum， M=M mono-specific serum， R=R mono-specific serum; d: 16M, 544A, 1,330S are the standard stains ofBrucellamelitensis,Brucellaabortus,Brucellasuis

2.4 pET-28a-L7/L12表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pET28a-L7/L12經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，電泳圖片顯示得到5 369 bp的pET-28a 載體片段和375 bp 的目的條帶。結(jié)果表明pET28a-L7/L12原核表達(dá)載體已成功構(gòu)建。圖3

1:陰性對(duì)照;2:質(zhì)粒pET-28a-L7/L12雙酶切;M：DNA marker DL10 000

Lane 1: the double digested plasmid of pET-28a-L7/L12 ; Lane 2: negative control;Lane M: DNA marker DL10,000

圖3 pET-28a-L7/L12雙酶切鑒定
Fig.3 The double digestion identification of pET-28a-L7/L12

2.5 重組蛋白L7/L12的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確的pET-28a-L7/L12的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性重組菌后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果表明目的蛋白位于大約19 ku處，與預(yù)計(jì)大小一致，且在8 h時(shí)表達(dá)量最高。圖4

0: BL21(DE3)空菌誘導(dǎo)表達(dá)；1:轉(zhuǎn)化pET-28a質(zhì)粒的BL21誘導(dǎo)表達(dá);M:蛋白Marker；2-6:轉(zhuǎn)化pET-28a-L7/L12 質(zhì)粒的BL21誘導(dǎo)表達(dá)0、2、4、6和8 h 0：induce expression BL21(DE3)；1：induce expression BL21 transformed with pET-28a plasmid；M: Protein Marker; 2-6：induce expression BL21 transformed with pET-28a-L7/L12 plasmid for 0 h,2 h,4 h,6 h,8 h

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig4 The SDS-PAGE of pET-28a-L7/L12

2.6 重組蛋白L7/L12的純化

誘導(dǎo)8 h后的菌使用裂解液裂解后，取上清和沉淀驗(yàn)證，SDS-PAGE結(jié)果表明，融合蛋白L7/L12在上清中存在(圖5a)。通過AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化后的蛋白條帶清晰，雜帶較少，說明純化效果較好(圖5b)。圖5

2.7 重組蛋白L7/L12的反應(yīng)原性檢測(cè)

將純化后的重組蛋白L7/L12轉(zhuǎn)至NC膜，采用羊布魯菌陽(yáng)性血清作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗羊抗體為二抗進(jìn)行免疫印跡分析。Western Blot結(jié)果顯示在19 ku的位置上有一條明顯的特異性反應(yīng)條帶，表明融合蛋白能被抗布魯氏菌的綿羊血清所識(shí)別，且目的蛋白具有良好的反應(yīng)原性，與理論分析相符合。圖6

1-2:純化后的 L7/L12蛋白；M:蛋白MarkerSDS-PAGE analysis the effect of purified L7/L12 fusion protein 1-2：the purified L7/L12 protein ;M：Protein Marker

圖5 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)L7/L12融合蛋白純化效果
Fig.5 SDS-PAGE analysis the effect of purified L7/L12 fusion protein

1-3:純化的His-L7/L12 融合蛋白；M:蛋白Marker

1-3: the purified His- L7/L12 fusion protein ;M: Protein Marker

圖6 融合蛋白His-L7/L12 Western Blot分析
Fig.6 The Western Blot analysis of fusion protein His-L7/L12

2.8 目的蛋白的生物信息學(xué)

通過TMHMM Server v.2.0在線軟件分析得出,目的蛋白無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(圖7)。SignalP 4.1 Server 對(duì)該蛋白氨基酸序列分析顯示，該蛋白有信號(hào)肽(圖8)。利用 SOPMA 在線軟件分析該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，85個(gè)氨基酸參與形成α-螺旋，占68.55%。延伸鏈占8.87%，有13個(gè)氨基酸參與形成β-折疊，占10.48%，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)占12.10%(圖9)。通過 Phyre2 在線服務(wù)器構(gòu)建出并優(yōu)化目的蛋白的三維結(jié)構(gòu)(圖10)。利用 PDBsum Generate在線評(píng)估(圖11)。從Ramachandran 圖中可以看出，在 121個(gè)氨基酸殘基中，有98個(gè)處于核心允許區(qū)，占 92.5% ，6 個(gè)處于額外允許區(qū)，占5.7% ，1個(gè)處于最大允許區(qū)，占 0.9% ，不可信區(qū)域?yàn)?,占 0.9%。這說明該模型具有一定的可信度。圖7～11

圖7 TMHMM Server v.2.0 預(yù)測(cè)L7/L12蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域
Fig.7 The prediction of transmembrane domain of L7/L12 protein by TMHMM Server v.2.0

圖8 Signal P 4.1 Server 預(yù)測(cè)L7/L12蛋白信號(hào)肽

Fig.8 The prediction of signal peptide of L7/L12 protein by Signal P 4.1 Server

圖9 SOPMA 軟件推測(cè)的L7/L12蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)
Fig.9 The prediction of secondary structure of L7/L12 protein by SOPMA Server

圖10 Phyre2 在線服務(wù)器預(yù)測(cè) L7/L12 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建
Fig.10 The construction of tertiary structure of L7/L12 protein by Phyre2

圖11 拉氏圖
Fig.11 The Ramachandran plot

3 討 論

布魯氏菌病是世界上具有嚴(yán)重危害性的人畜共患的傳染病之一，幾乎世界各地都有分布。從20世紀(jì)50年代中期，我國(guó)就開始了有組織有計(jì)劃地對(duì)人畜布病調(diào)查及防治[13]。20世紀(jì)80年代中后期，布魯氏菌病在世界部分地區(qū)有回升趨向，尤其在亞洲更為明顯[14]。90年代以來，布病疫情呈持續(xù)愈演愈烈的態(tài)勢(shì)，在我國(guó)西部、東北及華北省區(qū)疫情尤為嚴(yán)重。進(jìn)入2000年以后，布病疫情強(qiáng)勢(shì)走高，每年報(bào)導(dǎo)的發(fā)病人數(shù)逐年上升，由總共報(bào)導(dǎo)的37種傳染病的第17位到2006年已上升至第10位，這種狀況在所有法定報(bào)告?zhèn)魅静≈惺菢O其罕見的，進(jìn)一步說明了當(dāng)前布病疫情的嚴(yán)重性，研究及防治的迫切性[15]。

L7/L12核糖體蛋白是布魯氏菌重要的免疫性抗原之一，結(jié)構(gòu)保守，是良好的疫苗候選抗原蛋白[16]。另外，L7/L12蛋白在布魯氏菌逃逸機(jī)體免疫應(yīng)答后所引起的Ⅳ型超敏反應(yīng)中也扮有重要角色[17]。除了引起細(xì)胞免疫反應(yīng)外，L7/L12也可以引起體液免疫應(yīng)答[18]。Tabynov 等[19,20]將L7/L12 蛋白與流感病毒載體結(jié)合包裹成類病毒顆粒作為疫苗抗原，免疫豚鼠和小鼠后發(fā)現(xiàn)該抗原可作為疫苗預(yù)防B.abortus544株所引起的動(dòng)物感染。Luo等[21]研究表明L7/L12作為布魯氏菌疫苗抗原的機(jī)制之一是天然的L7/L12蛋白內(nèi)含有T淋巴細(xì)胞的表位，從而能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生Th1類細(xì)胞免疫應(yīng)答，分泌IFN-γ刺激巨噬細(xì)胞活化，從而清除藏匿在巨噬細(xì)胞中的布魯氏菌。因此，研究由此構(gòu)建新疆地區(qū)分離株的L7/L12蛋白表達(dá)，對(duì)于進(jìn)一步研制新疆地區(qū)的亞單位疫苗具有現(xiàn)實(shí)意義。

試驗(yàn)成功分離到新疆羊種生物3型布魯氏菌并成功構(gòu)建L7/L12蛋白重組表達(dá)載體。表達(dá)的重組蛋白能與布魯氏菌陽(yáng)性血清反應(yīng)，說明表達(dá)的L7/L12在大腸桿菌中得到了正確折疊，其免疫學(xué)活性沒有受到影響。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明了L7/L12蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

試驗(yàn)運(yùn)用生物信息學(xué)相關(guān)知識(shí)分析，結(jié)果表明該基因所表達(dá)的蛋白并沒有跨膜結(jié)構(gòu)，說明該蛋白可能不參與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。該蛋白沒有信號(hào)肽，說明該蛋白屬于非分泌性蛋白，不能被布魯氏菌分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主，和絕大多數(shù)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)一樣，都是通過骨架上的羰基和酰胺基團(tuán)之間形成的氫鍵維持該二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。利用生物信息學(xué)軟件Phyre2 等構(gòu)建了出了L7/L12蛋白的三維模型，這有利于蛋白結(jié)構(gòu)、功能的可視化分析。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，與其同源性的模型具有免疫調(diào)控功能，間接驗(yàn)證了該蛋白可能具有免疫調(diào)控的功能。布魯氏菌的免疫逃避是一個(gè)復(fù)雜的過程，其分子機(jī)制尚不完全清楚。試驗(yàn)通過構(gòu)建布魯氏菌L7/L12基因的原核表達(dá)載體并對(duì)其反應(yīng)原性進(jìn)行鑒定以及生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步探究布魯氏菌疫苗研究提供了一些參考。同時(shí)，該蛋白作為新疆該地區(qū)羊種布魯氏菌的疫苗候選分子具有一定的參考價(jià)值。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)以羊流產(chǎn)胎兒為病料，經(jīng)過劃線培養(yǎng)、改良萋-尼染色法染色觀察其形態(tài)，對(duì)疑似菌進(jìn)行omp25PCR鑒定，初步判斷出分離的菌中有布魯氏菌，命名為015。經(jīng)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所對(duì)布魯氏菌通過一系列的生化鑒定，最終確定了該菌為羊種布魯氏菌生物3型，這表明新疆該羊場(chǎng)存在羊種布魯氏菌3型的感染。L7/L12蛋白參與布魯氏菌的蛋白質(zhì)合成以及發(fā)揮保護(hù)性抗原的作用，為此通過原核表達(dá)的方式大量表達(dá)出L7/L12蛋白，并使用Western Blot方法檢測(cè)出該表達(dá)蛋白有良好的反應(yīng)原性。生物學(xué)軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行了一些常規(guī)的預(yù)測(cè)，為了解該蛋白性質(zhì)提供參考。

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Supported by: General Programs of the National Natural Science Foundation of China"Study on the molecular regulation of TceSR and TcfSR in the pathogenesis of Brucella" (31572491).

CHEN Chuang-fu(1962-), male, professor, doctoral supervisor, mainly engaged in the study of pathogenic microorganisms pathogenic mechanism

Identification of Isolate Strain of Brucella Melitensis in Xingjiang and Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of Its L7/L12 Protein

LIU Sheng1, JIANG Ya-li2, FU Qiang3, SHI Hui-jun3, LI Shuang1, MENG Lu-ping1, GUO Fei4, ZHANG Hui1, CHEN Chuang-fu1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity，ShiheziXinjiang832000，China; 2.CollegeofLifeTechnology,ShiheziUniversity，ShiheziXinjiang832000，China; 3.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China； 4.SchoolofMedicine,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832000，China)

【Objective】 To isolate and identify Xinjiang Brucella melitensis, this project focuses on prokaryotic expression of the L7/L12 protein of the bacteria，detection of its reactionogenicity and and partial biological analysis. 【Method】Isolation and identification of Brucella melitensis by using bacterial streak culture, morphological observation, biochemical test and PCR detection. Using conventional and molecular biological methods to express and purify the L7/L12 protein of this Brucella melitensis. Expression and purification isolate strain L7/L12 protein by using the conventional molecular biological methods, and analysis of the fusion protein reactionogenicity by Western Blot . Using bioinformatics software to analyze some functions of this protein. 【Result】After identification, the strain was identified as Brucella melitensis. After enzyme digestion and sequencing, the expression vector pET-28a-L7/L12 was correctly constructed. SDS-PAGE tests showed that the purified L7/L12 protein was a single band. The fusion protein had good reactionogenicity by Western Blot detection. Bioinformatics analysis showed the protein had no trans-membrane domain and no signal peptide．Its secondary structure was mainlyα-helix．And the three-dimensional structure of the protein was constructed by Phyre2 Server. 【Conclusion】The isolated strain was identified successfully and L7/L12 fusion protein of this isolate strain was expressed and purified. Blot Western test proved that the protein had a good reactionogenicity, which laid the foundation for the protein follow-up research of the subunit vaccine.

Brucellamelitensis；L7/L12; protein purification; reactionogenicity；biological analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.03.022

2016-11-24

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目“TceSR和TcfSR在布魯氏菌致病過程中的分子調(diào)控機(jī)制研究”(31572491)

劉升(1992-)，女，安徽宿州人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿硬《緦W(xué)，(E-mail)1341753096@qq.com

陳創(chuàng)夫(1962-)，男，廣東潮州人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)椴≡⑸镏虏C(jī)理，(E-mail)ccf-xb@163.com

S852.1；S188

A

1001-4330(2017)03-0564-10