葛根素納米晶的制備工藝及其表征

杜俊鋒，涂亮星，胡凱莉*，奉建芳,2*（.上海中醫(yī)藥大學，上海 20203;2.桂林醫(yī)學院，廣西 桂林 45004）

葛根素納米晶的制備工藝及其表征

杜俊鋒1，涂亮星1，胡凱莉1*，奉建芳1,2*
（1.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203;2.桂林醫(yī)學院，廣西 桂林 451004）

目的 研究葛根素納米晶的制劑處方、制備工藝及其對粒徑的影響，并對葛根素納米晶進行表征。方法 采用高壓均質(zhì)法制備葛根素納米晶，以粒徑為指標，考察穩(wěn)定劑、藥輔比、投料量、制備溫度等參數(shù)對納米晶制備的影響。在此基礎(chǔ)上，考察干燥工藝對葛根素納米晶固化的影響。采用掃描電鏡（SEM）及透射電鏡（TEM）進行葛根素及納米結(jié)晶形態(tài)學的觀察。結(jié)果 采用聚維酮K30作為穩(wěn)定劑、藥輔比為1∶2、制備溫度43℃以上時，可制得粒徑為20～50 nm的葛根素納米晶。投藥量對納米晶粒徑?jīng)]有顯著性影響，投藥量為10%（w/v）時，采用700 bar 5次的高壓均質(zhì)條件即可制得所需的納米晶。冷凍干燥可以用于納米晶的干燥。將葛根素制成納米結(jié)晶之后，其外觀由不規(guī)則狀態(tài)變?yōu)閳A整的球形。結(jié)論 所確定的葛根素納米晶制劑處方與制備工藝條件可行，可有效地制備100 nm以下的葛根素納米晶。

葛根素；納米晶；制備工藝；粒徑；表征

從中藥葛根（Pueraria lobata）提取的異黃酮類有效成分葛根素具有擴張血管、增加心肌收縮力、抗氧化及肝保護等作用，臨床上主要用于心腦血管疾病的治療，如心肌缺血、心絞痛及高血壓等。葛根素溶解度低，口服生物利用度較差（約3.7%）[1]，目前臨床上只能注射給藥。在葛根素注射液中，加入了50%（v/v）的丙二醇作增溶劑。增溶劑的刺激作用及注射給藥易造成高血藥濃度，使用過程中易產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，如溶血、發(fā)熱、皮膚瘙癢和胸悶氣短等。葛根素在人體內(nèi)的消除半衰期較短，為了達到治療目的，需要經(jīng)常靜脈注射高劑量的葛根素注射液，導(dǎo)致藥物中毒等嚴重的不良反應(yīng)。如果能把葛根素制備成口服制劑，將解決注射劑使用過程中的不良反應(yīng)且大大提高患者的順應(yīng)性。

納米粒是利用天然高分子或合成的化學物質(zhì)為載體制成的直徑10～1 000 nm的載藥微粒，葛根素制備成固體脂質(zhì)納米粒等對葛根素口服生物利用度提高有限，達不到臨床理想的治療要求，此外還存在有機溶劑殘留及輔料使用量大等問題。上世紀90年代初，納米晶技術(shù)首次由Liversidge等[2]引入制藥領(lǐng)域，系直接將藥物制備成納米級結(jié)晶。該技術(shù)因載藥量高、制備簡單、易于放大、對物料理化性質(zhì)沒有要求等優(yōu)點，得到迅速發(fā)展，并在口服給藥、靶向給藥等多種給藥途徑上顯示出較大的優(yōu)勢，可以很好地避免上述納米粒所存在的局限性。目前已有近10個基于納米晶技術(shù)的上市產(chǎn)品和超過20個處于臨床研究不同階段的品種[3]，而納米晶技術(shù)在口服給藥上表現(xiàn)的優(yōu)勢最大，被關(guān)注也最多。本研究擬運用納米晶技術(shù)制備葛根素納米晶，以期提高葛根素口服給藥的生物利用度。本文考察了葛根素納米晶的制備工藝并對其特性進行表征。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料與試劑

葛根素（質(zhì)量分數(shù)＞98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；羥丙基甲基纖維素（HPMC），泊洛沙姆188 （P188）及十二烷基苯磺酸鈉均由美國Sigma公司提供；甲基纖維素（MC），普流尼克127（F127），吐溫80 （P80），十二烷基硫酸鈉（SDS），聚乙烯醇（PVA），司盤60（Span 60），聚維酮K30（PVP K30）等其它試劑均由國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 實驗儀器

高剪切分散乳化機（德國Fluko公司）；高壓均質(zhì)機 （AH-100D，加拿大ATS公司）；NICOMP 380 ZLS Zeta電位/粒度分析儀（美國PSS公司）；ME分析天平 （瑞士Mettler Toledo公司）；JY電子天平（上海上天精密儀器有限公司）；冷凍干燥機（MODULYOD，美國Thermo Fisher公司）；噴霧干燥儀（SD-06AG，英國Labplant公司）；場發(fā)射掃描電鏡（SEM，S-4800，日本Hitachi公司）；高分辨透射電鏡（TEM，JEM-2100，日本JEOL公司）。

2 方法

2.1 制劑處方及制備工藝篩選

2.1.1 穩(wěn)定劑的篩選 以粒徑為考察指標，對穩(wěn)定劑的種類、用量等進行篩選。粒徑測定采用動態(tài)光散射法（Dynamic Light Scattering，DLS），具體操作：將制劑置于比色皿，在25℃下，于粒度儀中測其粒徑，每份樣品平行測定3次，粒徑結(jié)果以強度徑表示并記錄粒子的多分散系數(shù)（P.I）。

穩(wěn)定劑考察時，按藥物∶輔料=1∶2的比例，投藥量1%（w/v），于16 000 r/min高剪切分散后，在高壓均質(zhì)機中于1 000 bar均質(zhì)20次，制備體積為40 mL?？疾斓姆€(wěn)定劑有MC、HPMC、P188、F127、P80、SDS、十二烷基磺酸鈉、PVA、Span 60、PVP K30，另外，保持藥輔比不變，考察了SDS、P80、P188及PVP K30之間等比例聯(lián)用對制劑的影響。

考察不同藥輔比對制劑的影響，保持總固體含量不變，即葛根素和穩(wěn)定劑的總量為3%（w/v），以HPMC、P188、PVA、SDS、PVP K30為研究對象，設(shè)定藥輔比為1∶1、1∶2，于1 000 bar下均質(zhì)20次。

此外，分別以SDS、PVP K30為穩(wěn)定劑，保持藥物∶輔料=1∶2的比不變，設(shè)定投藥量為1%、1.5%、2%、3%（w/v），考察投藥量對制劑的影響。

2.1.2 制備溫度對制劑制備的影響 對制備過程的溫度進行測定，以制劑達到理想的較小粒徑并在至少6 h內(nèi)穩(wěn)定為制備成功，每個溫度段均進行了不同均質(zhì)條件（均質(zhì)壓力、均質(zhì)體積等）的實驗，且制劑例數(shù)均不小于5。統(tǒng)計數(shù)據(jù)并分析，以期發(fā)現(xiàn)制備溫度對制劑制備的影響規(guī)律。

2.1.3 投藥量對制劑性質(zhì)的影響 保持藥輔比不變，增加投藥量，按1 000 bar 20次的均質(zhì)方法制備2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10% 投藥量的制劑，并測定其在24 h內(nèi)的粒徑，考察投藥量對納米晶制備的影響。

2.1.4 不同均質(zhì)壓力對制劑制備的影響 取Pue 6.0 g+PVP K30 12.0 g，加入300 mL純凈水，攪拌分散，再經(jīng)高剪切分散（16 000 r/min×1 min）后于700 bar或1000 bar均質(zhì)10次，維持制備溫度在43℃左右。制劑在進行700 bar或1 000 bar均質(zhì)前于200 bar和500 bar各均質(zhì)2次，均質(zhì)后記為均質(zhì)0次?？疾觳煌|(zhì)壓力對制劑粒徑的影響。

2.2 干燥工藝的選擇

2.2.1 冷凍干燥 選用Pue投藥量為10%（w/v)的納米晶進行凍干工藝研究。為避免凍干過程中納米晶的破壞，分別加入2%、6%、10%甘露醇和6%葡萄糖及6%蔗糖，另外取適量不加凍干保護劑的納米晶液體，于-20℃預(yù)凍后，置于凍干機中進行凍干，考察凍干保護劑對納米晶粒徑的影響。冷凍干燥條件如下：冷凍干燥溫度-45℃；真空度200 μbar；時間24 h。

2.2.2 噴霧干燥 控制制備溫度為43～50℃，分別制得投藥量為2%、4%和10%的制劑，按如下條件進行噴霧干燥：A-2%投藥量，進風溫度180℃，流速8 r/mim。B-4%投藥量，進風溫度180℃，流速 4 r/min。C-4%投藥量，進風溫度200℃，流速 6 r/min。D-10%投藥量，進風溫度200℃，流速 4 r/min。

2.3 形態(tài)學觀察

分別采用SEM和TEM對原料藥和納米晶進行形態(tài)學觀察。納米晶的形態(tài)學研究采用凍干粉末，將其用水再分散后，滴至銅網(wǎng)上，自然晾干后，置于TEM下進行觀察。

3 實驗結(jié)果

3.1 制劑處方及制備工藝篩選

3.1.1 穩(wěn)定劑的篩選結(jié)果 在1%（w/v）投藥量，藥輔比為1∶2條件下，以納米晶16 h內(nèi)穩(wěn)定為成功制劑，優(yōu)選出的穩(wěn)定劑有HPMC、P188、SDS、PVA及PVP K30。

將上述穩(wěn)定劑按藥輔比為1∶1與1∶2進行納米晶制備，其制備結(jié)果及粒徑如表1所示。能夠使制劑達到穩(wěn)定狀態(tài)的藥輔比最低為1∶2。其中，PVP K30為穩(wěn)定劑的葛根素納米晶的粒徑能夠達到27.3 nm，粒徑最小。

在藥鋪比為1∶2，投藥量為1%、1.5%、2%、3%時，以SDS、PVP K30為穩(wěn)定劑的制劑粒徑結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，以PVP K30為穩(wěn)定劑的制劑投藥量可達3%（w/v）以上，以SDS為穩(wěn)定劑的制劑最大投藥量應(yīng)在1%（w/v）左右。

表1 不同穩(wěn)定劑和輔藥比對葛根素納米晶粒徑的影響（n=3，nm）

表2 不同穩(wěn)定劑和投藥量對納米晶粒徑的影響 （n=3，nm，±s）

表2 不同穩(wěn)定劑和投藥量對納米晶粒徑的影響 （n=3，nm，±s）

穩(wěn)定劑PVP K30 PVP K30 PVP K30 PVP K30 SDS SDS投藥量(w/v) 1.0% 1.5% 2.0% 3.0% 1.0% 2.0% 0 h 25.2±2.3 27.4±1.1 34.1±0.7 36.5±1.8 305.9±5.9 601.5±24.8 14 h 26.2±1.1 27.1±0.5 34.1±0.3 33.8±0.1 298.9±21.0大量沉淀

3.1.2 制備溫度對制劑制備的影響 當溫度為30～35℃時，納米晶制劑的成功率為0；當溫度升至35～40℃時，成功率達到約80%；當溫度升至40～43℃時，成功率達到96%左右；當溫度大于43℃時，成功率達到100%，表明提高制備溫度對葛根素納米晶的成功制備非常有利。

3.1.3 投藥量對納米晶制備的影響 投藥量對納米晶制備的影響結(jié)果如表3，表明，采用PVP K30為穩(wěn)定劑的葛根素納米晶，在制備過程中，投藥量對粒徑的影響不大；基于固含量太高，高壓均質(zhì)有難度的考慮，最大投藥量設(shè)定為10%（w/v）。

表3 不同投藥量不同時間點納米晶粒徑 （n=3，nm，±s）

表3 不同投藥量不同時間點納米晶粒徑 （n=3，nm，±s）

注：測量前未稀釋。

投藥量（%）2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 20 min 31.6±0.3 41.3±0.9 51.9±0.6 56.8±2.4 91.4±4.0 144.7±2.5 144.3±2,5 110.9±4.8 124.2±5.1 1 h 32.8±0.6 43.2±0.6 53.6±2.3 58.4±1.3 99.7±1.8 141.9±1.9 140.2±0.6 111.7±5.1 120.5±4.0 2 h 32.5±1.9 43.4±1.5 57.3±2.3 57.2±1.8 102.1±2.3 147.2±3.8 140.9±4.4 112.3±3.4 122.4±4.8 4 h 33.0±0.8 41.0±2.3 57.3±2.2 59.1±2.2 118.6±2.0 145.9±3.2 143.7±6.6 108.2±1.2 119.0±2.6 24 h 31.7±1.7 41.2±2.8 58.6±1.2 51.2±3.1 115.4±2.2 154.4±3.0 138.6±4.4 105.6±2.1 122.8±8.5

3.1.4 不同均質(zhì)壓力對制劑制備的影響 不同均質(zhì)壓力下粒徑結(jié)果如圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩種制劑在高壓均質(zhì)過程中，粒徑先增大，后減??；700 bar與1 000 bar的均質(zhì)壓力在均質(zhì)5次左右時，差異很大，但在均質(zhì)5次后，沒有顯著差異，說明均質(zhì)壓力為700 bar及1 000 bar對納米晶的制備無影響。

圖1 700 bar和1 000 bar一系列均質(zhì)次數(shù)下葛根素納米晶粒徑（n=3）

3.2 干燥工藝的選擇結(jié)果

3.2.1 冷凍干燥 冷凍干燥前納米晶的粒徑為(27.1±1.5)nm，冷凍干燥后，粒徑的變化如表4所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，是否加入凍干保護劑，對納米晶的粒徑?jīng)]有顯著性的影響。

表4 加不同保護劑冷凍干燥后葛根素納米晶的粒徑 （n=3）

3.2.2 噴霧干燥 按照A、B、C、D條件制備了不同的葛根素納米晶，并對其進行不同的噴霧干燥工藝考察，各制劑噴霧干燥前后的粒徑測定結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果顯示，A、B條件下（進風口溫度180℃）噴霧干燥對粒徑?jīng)]有顯著性影響 （P＞0.05），C、D條件下（進風口濕度200℃）噴霧干燥對粒徑有顯著影響（P＜0.05）,因此，可以選擇A、B條件進行噴霧干燥。

圖2 噴霧干燥條件對葛根素納米晶粒徑的影響（n=3）

3.3 葛根素制備納米晶前后形態(tài)學觀察

分別采用SEM和TEM對原料藥和納米晶進行形態(tài)學觀察，結(jié)果如圖3。原料藥外觀不圓整，粒徑在20 μm以上且分布不均一；納米晶外觀圓整，粒徑集中在20～50 nm且分布較窄，TEM的觀察結(jié)果和采用DLS測得的粒徑結(jié)果一致。

圖3 葛根素原料藥（A）的SEM照片和納米晶（B）的TEM照片

4 討論

高壓均質(zhì)法 （high pressure homogenization）系Müller等人于1994年發(fā)明的一種納米晶制備方法。均質(zhì)壓力及均質(zhì)次數(shù)是影響均質(zhì)效果的主要因素。壓力越大，可能納米晶粒徑越小，制備過程中，所采用的壓力一般為500～1 500 bar。本研究發(fā)現(xiàn)采用700 bar與1 000 bar對納米晶粒徑?jīng)]有顯著性差異，故采用700 bar的均質(zhì)壓力進行制備。隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，粒徑逐漸減小，且均質(zhì)5次時，粒徑達到最小。納米晶的粒徑一般為200～500 nm，目前報道最小納米晶是60～80 nm[4]，本研究中制備的葛根素納米晶粒徑為30～40 nm，具有很好的研究價值。

制備溫度是影響高壓均質(zhì)效果的又一重要參數(shù)。葛根素具有較好的熱穩(wěn)定性，高溫制備對其穩(wěn)定性沒有顯著影響?？疾觳煌瑴囟认录{米晶制備后發(fā)現(xiàn)，低于35℃，無法得到所需的納米晶，而超過43℃，700 bar高壓均質(zhì)10次，納米晶制備成功率達到100%，表明提高制備溫度，對采用以PVP K30為穩(wěn)定劑的葛根素納米晶的制備非常有利，最后確定的制備溫度為43～50℃。

研究發(fā)現(xiàn)，不加穩(wěn)定劑時，在1%（w/v）的投樣量下制備的納米晶粒徑最低為300 nm左右，但是其粒徑分布范圍較廣(P.I＞1)，所制得的納米晶穩(wěn)定性極差。故在制備過程中，加入穩(wěn)定劑。在納米晶的制備中穩(wěn)定劑一般為表面活性劑、聚合物或兩者的混合物。P80、SDS和P188等為常用的表面活性劑，常用的聚合物有HPMC、HPC及PVA等[5]。我們發(fā)現(xiàn)PVP K30為穩(wěn)定劑時，所制得的納米晶粒徑＜50 nm且分布范圍較窄 （P.I≈0.3），制劑具有良好的穩(wěn)定性。在制備的過程中，我們考察不同藥輔比對葛根素納米晶制備的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當藥輔比低于1:2時，體系不能維持穩(wěn)定狀態(tài)。

在冷凍干燥過程中，一般加入一定量凍干保護劑來減小冷凍損傷和固化損傷。常用的凍干保護劑為葡萄糖等糖類及甘露醇，使用比例一般為1%～10%（w/w）[6]。我們考察加入不同比例的凍干保護劑，對納米晶冷凍干燥粉末的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對冷凍干燥粉末的粒徑?jīng)]有明顯的改變。

[1]Pitha J,Milecki J,Fales H,et al.Hydroxypropyl-β-cyclodextrin: preparation and characterization; effects on solubility of drugs[J].Int J Pharm,1986,29:73-82.

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[4]B?hm BHL,Müller RH.Lab-scale production unit design for na nosuspensions of sparingly soluble cytotoxic drugs[J].Pharm Sci Tech Today,1999,2:336-339.

[5]Mosharraf M,Nystr?m C.The effect of particle size and shape on the surface specific dissolution rate of microsized practically insoluble drugs[J].Int J Pharm,1995,122:35-47.

[6]Müller RH,Peters K.Nanosuspensions for the formulation of poorly soluble drugs:I.Preparation by a size-reduction technique[J].Int J Pharm,1998,160:229-237.

（本文編輯 蘇 維）

Characteristics and Process Technology of Peurarin Nanocrystals

DU Junfeng1,TU Liangxing1,HU Kaili1*,FENG Jianfang1,2*
(1.Shanghai University of Chinese Medicine,Shanghai 201203,China;2.Guilin Medical University, Guilin,Guangxi 451004,China)

Objective In this study,the production,process technology and effects ofparticle size ofpuerarin nanocrystals were investigated,and the puerarin nanocrystals were characterized.Methods High pressure homogenization (HPH)was used for formula and production studies.Particle size as an indicator,we studied the effects of stabilizers,drug/ stabilizer ration,drug input and production temperature on the production of peurarin nanocrystals,and then drying method were introduced to study the solidification of nanocrystals.We introduced scanning electron microscopy(SEM)and transmission electron microscopy (TEM)formorphologic observation forcrystalline study.ResultsIn the production study,puerarin nanocrystal with diameter of 20～50 nm could be produced after using PVP K30 as stabilizer,with drug/stabilizer ratio 1∶2, temperature above 43℃.The amounts of puerarin input has no significant influence on nanocrystals production.In poilet scaled experiments,nanocrystals with puerarin input of 10% (w/v)were produced at 700 bar for 5 cycles,and the nanocrystals prepared were solidified by freezing drying and spray drying.We found that after transferred puerarin into nanocrystals,the irregular shape for puerarin was changed to spherical shape for nanocrystals.Conclusion The formula and production processes estabilished were reliable and repeatability,the puerarin nanocrystals with diameter below 100 nm could be prepared effectively.

puerarin;nanocrystals;process technology;particle size;superficial characteristics

R283

A

doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2017.04.006

2016-11-21

國家 “973”計劃項目 （2009CB930300）；上海市優(yōu)秀技術(shù)帶頭人計劃項目 （13XD1425300）；上海市科委納米專項項目（11nm0506700）。

杜俊鋒，男，在讀碩士，研究方向：中藥新劑型。

*胡凱莉，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail：kaili-hu@163.com；奉建芳，男，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：fengjianfang@vip.163.com。

本文引用：杜俊鋒，涂亮星，胡凱莉，奉建芳.葛根素納米晶的制備工藝及其表征[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（4）：369-372.