付 虹，戎有和

HDL對(duì)HepG2細(xì)胞糖原合成的影響及機(jī)制研究

付 虹1，戎有和2*

目的 探討HDL對(duì)HepG2細(xì)胞糖原合成的影響及其機(jī)制。方法 采用肝糖原/肌糖原試劑盒測(cè)定HDL對(duì)糖原合成的影響，并用Western blot實(shí)驗(yàn)探討其機(jī)制。結(jié)果 HDL可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞對(duì)糖原的合成。此過(guò)程中發(fā)生了PI3K-AKT-GSK-3蛋白通路的磷酸化。結(jié)論 HDL促進(jìn)HepG2細(xì)胞糖原的合成有胰島素信號(hào)途徑及其下游PI3K/AKT-GSK-3的參與。

高密度脂蛋白；HepG2細(xì)胞；糖原合成；胰島素抵抗

0 引言

胰島素抵抗是外周組織對(duì)胰島素反應(yīng)性下降的一種病理生理狀態(tài)，是糖尿病、血脂異常和肥胖癥等代謝性疾病共同的生理病理基礎(chǔ)[1-2]。肝臟的胰島素抵抗是導(dǎo)致2型糖尿病的主要原因，在HepG2細(xì)胞中，表達(dá)很多胰島素信號(hào)途徑和葡萄糖代謝過(guò)程中的基因。因此，在分析葡萄糖、脂質(zhì)代謝和肝臟胰島素抵抗的研究中，HepG2細(xì)胞是一個(gè)很適用的工具細(xì)胞[3]。因此，本文采用HepG2細(xì)胞作為工具細(xì)胞，研究外源性給予HDL對(duì)其糖原合成的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2細(xì)胞購(gòu)自上海中科院研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑和藥品 肝糖原/肌糖原測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物技術(shù)有限公司；MEM-α培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Clark公司；單克隆GSK-3抗體、單克隆PI3K(P85)抗體、AKT抗體、磷酸化的單克隆GSK-3抗體、PI3K(P85)抗體、AKT抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；ECL發(fā)光液試劑購(gòu)自北京普利萊公司；單克隆β-actin抗體購(gòu)自武漢博士德公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗來(lái)自Bioward公司；PVDF膜(0.2 μm)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器 生物分光光度計(jì)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；水平電泳儀、電泳槽、垂直電泳儀、電泳槽：美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；JS-380C全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀：上海培清科技有限公司產(chǎn)品；Biofuge fresco低溫離心機(jī)：德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品；WH-2微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；EC-5型恒溫水浴儀：德國(guó)Julabo公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 HepG2細(xì)胞呈聚集型生長(zhǎng)，培養(yǎng)基為MEM-α (含10%的胎牛血清，1%鏈霉素-青霉素的雙抗)置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2天更換培養(yǎng)基1次，至細(xì)胞單層融合達(dá)80%以上時(shí)，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用EDTA-胰蛋白酶1 mL消化細(xì)胞1 min，待細(xì)胞變圓并從瓶壁上脫落，立即加入含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基終止消化。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為(2～3)×105個(gè)/mL，接種于10 cm的塑料培養(yǎng)皿中或六孔板中。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用傳代10代以內(nèi)的分化后的HepG2細(xì)胞，分為4組：正常組(Normal組)、高密度脂蛋白組(HDL組)、胰島素組(Insulin組)、高密度脂蛋白+胰島素組(HDL+Insulin組)。

2.3 給藥 生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞給予無(wú)血清MEM培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)基中加入30 nM葡萄糖，之后分組給藥，收集細(xì)胞。

2.4 肝細(xì)胞內(nèi)糖原含量的測(cè)定 嚴(yán)格按照肝糖原/肌糖原試劑盒的說(shuō)明，對(duì)HepG2細(xì)胞中的糖原含量進(jìn)行測(cè)定。

2.5 Western blot 各組分別給藥10 min后，用胰酶消化細(xì)胞，收集，用RIPA裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞的總蛋白并測(cè)定其各組濃度。之后按以下步驟檢測(cè)p-AKT、p-P85、p-GSK-3β、p-GSK-3α蛋白的表達(dá)。

①灌膠、上樣：其中分離膠10%，濃縮膠5%。②SDS-PAGE電泳：先恒壓85 V、20 min，待樣品全部進(jìn)入分離膠后，改為恒壓110 V、2 h。③轉(zhuǎn)膜：PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜條件為4 ℃，恒壓110 V、2 h。④封閉：用5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉2 h。封閉液用TBST (50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.05% Tween 20)配制。⑤一抗結(jié)合：TBST稀釋一抗(p-P85抗體滴度為1∶1 000；p-AKT抗體滴度為1∶1 000；p-GSK-3β抗體滴度為1∶1 000；p-GSK-3α抗體滴度為1∶1 000；β-actin抗體滴度為1∶200)，4 ℃過(guò)夜。⑥洗膜：TBST漂洗3次，5 min/次。⑦二抗結(jié)合：TBST稀釋二抗，室溫孵育2 h。⑧洗膜：TBST漂洗4次，10 min/次。⑨顯色：使用化學(xué)發(fā)光顯色試劑進(jìn)行顯色，用成像系統(tǒng)儀器觀察拍照。

3 結(jié)果

3.1 HDL處理后不同時(shí)間段HepG2細(xì)胞內(nèi)的糖原含量 分組后的細(xì)胞給予HDL 100 μg/mL后，在不同的時(shí)間段終止孵育，收集細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)糖原含量的變化。研究顯示，給予HDL后1.5 h，HepG2細(xì)胞內(nèi)糖原含量明顯增加。見圖1。分別在給予HDL 100 μg/mL、Insulin 100 nM、HDL 100 μg/mL+Insulin 100 nM后30 min、1.5 h、3 h收集細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)糖原的含量對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)糖原含量的影響。結(jié)果顯示，給予HDL 100 μg/mL和Insulin 100 nmol/L促進(jìn)糖原合成的能力相當(dāng)，結(jié)果見圖2。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞內(nèi)糖原含量/蛋白比(n>3) 注：#與Normal組比較，P<0.05

圖2 各組糖原含量/蛋白比(n>3) 注：#與Normal組比較，P<0.05

3.2 HDL對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)的PI3K途徑中信號(hào)蛋白的影響 與Normal組相比，外源性給予HDL 100 μg/mL、Insulin 100 nM、HDL 100 μg/mL+Insulin 100 nmol/L組PI3K(P85)蛋白和AKT蛋白磷酸化明顯增強(qiáng)。與Normal組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 四組AKT的磷酸化圖(n>3) 注：#與Normal組比較，P<0.05

3.3 HDL對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)糖原合成相關(guān)蛋白(GSK-3)的影響 外源性給予HDL 100 μg/mL、Insulin 100 nM、HDL 100 μg/mL+Insulin 100 nmol/L組與Normal組相比，GSK-3β蛋白和GSK-3α蛋白磷酸化明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、圖6。

圖4 四組PI3K(P85)的磷酸化圖(n>3) 注：#與Normal組比較，P<0.05

圖5 四組GSK-3β的磷酸化圖(n>3) 注：#與Normal組比較，P<0.05

圖6 四組GSK-3α的磷酸化圖(n>3) 注：#與Normal組比較，P<0.05

4 討論

本次試驗(yàn)采用HepG2細(xì)胞作為工具細(xì)胞，研究外源性給予HDL后對(duì)糖原合成的影響。Insulin可以激活糖原合酶促進(jìn)糖原合成，因此，本研究應(yīng)用Insulin作為陽(yáng)性對(duì)照組。前期試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，Insulin的最佳給藥濃度為100 μg/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]。首先，我們將HepG2細(xì)胞在不同的時(shí)間段終止孵育，收集細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)糖原含量的變化。研究顯示，給予HDL后1.5 h，HepG2細(xì)胞內(nèi)糖原含量明顯增加。隨后，分組實(shí)驗(yàn)顯示，給予HDL組、Insulin組、HDL+Insulin組的糖原合成量均明顯高于空白組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

胰島素介導(dǎo)的糖原合成途徑包括PI3K及其下游的AKT[5-7]。胰島素與胰島素受體結(jié)合，激活胰島素受體底物-1(IRS-1)，隨后激活下游的PI3K、AKT、PDK-1等分子[8-11]。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇肌酶，本身具有絲氨酸/蘇氨酸肌酶的活性，由調(diào)節(jié)亞基P85和催化亞基P110構(gòu)成。給予PI3K的抑制劑(LY294002或者wortmannin)可以阻止胰島素誘導(dǎo)的糖原合酶的活性增加[12-13]。AKT 是胰島素刺激糖原合成途徑中GSK-3的上游調(diào)節(jié)元件[14-16]。AKT激活后，可以使GSK-3α第21位的絲氨酸(Ser21)和GSK-3β第9位的絲氨酸(Ser9)位點(diǎn)磷酸化并失活，從而阻止GSK-3對(duì)糖原合酶的磷酸化，促進(jìn)糖原的合成[17-18]。有研究證實(shí)，在HepG2細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中，給予胰島素刺激后，糖原合酶活性增加也是通過(guò)PI3K途徑及其下游的AKT和GSK-3蛋白實(shí)現(xiàn)的[19-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在外源性給予HDL后，PI3K和AKT蛋白都出現(xiàn)了明顯的磷酸化表現(xiàn)，與Normal組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明HDL促進(jìn)HepG2細(xì)胞內(nèi)糖原合成是有胰島素信號(hào)途徑參與的。

GSK-3是糖原合酶的一個(gè)負(fù)性調(diào)控因子[21]，是一種調(diào)節(jié)糖原代謝的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，其在糖原合酶的失活過(guò)程中起重要作用[22]。目前，大量資料已經(jīng)對(duì)GSK-3在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中的作用進(jìn)行了廣泛研究。在靜息狀態(tài)下，GSK-3一直處于有活性狀態(tài)[23]，GSK-3磷酸化狀態(tài)是沒(méi)有活性的，處于活性狀態(tài)的GSK-3可以使糖原合酶的活性降低，失活，從而使糖原合成減少[24-26]。有報(bào)道，在L6肌肉細(xì)胞和小鼠離體骨骼肌細(xì)胞中，過(guò)量表達(dá)GSK-3或者是絲氨酸9位點(diǎn)變異的GSK-3，會(huì)抑制胰島素誘導(dǎo)的糖原合酶的活性[27-28]。研究顯示，在給予HDL后，GSK-3α和GSK-3β蛋白也出現(xiàn)了明顯的磷酸化表現(xiàn)，與Normal組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，我們認(rèn)為，HDL促進(jìn)糖原合成有胰島素信號(hào)途徑及其下游PI3K/AKT-GSK-3的參與。最近研究發(fā)現(xiàn)，AMPK在肝糖代謝的過(guò)程中也起著重要的作用，在胰島素抵抗相關(guān)的2型糖尿病的過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn)AMPK信號(hào)途徑的缺陷[29-31]。因此，需要進(jìn)一步探索該過(guò)程的作用機(jī)制，以闡明這一現(xiàn)象。

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Effect of HDL on glycogen synthesis in HepG2 cells and its mechanism

FU Hong1,RONG You-he2*

(1.Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China;2.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of HDL on glycogen synthesis in HepG2 cells.Methods The effect of HDL on glycogen synthesis was studied by liver glycogen/muscle glycogen Kit,and the mechanism of the effect was explored by Western blotting experiment.Results HDL could promote the glycogen synthesis in HepG2 cells;meanwhile,the phosphorylations of PI3K-AKT-GSK-3 proteins appeared.Conclusion HDL stim ulates glycogen synthesis in HepG2 cells,which involves the insulin signaling pathway and its downstream PI3K-AKT- GSK-3 signaling pathways.

HDL;HepG2 cell;Glycogen synthesis;Insulin resistance

2016-09-08

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210029

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201704005