李信，余永建，朱勝虎，張俊紅，趙迪，姚清

(江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江，212000)

鎮(zhèn)江香醋釀造過程中種子醅的優(yōu)化

李信，余永建*，朱勝虎，張俊紅，趙迪，姚清

(江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江，212000)

鎮(zhèn)江香醋的醋酸發(fā)酵采用傳統(tǒng)套醪方式進行接種，是鎮(zhèn)江香醋釀造的重要環(huán)節(jié)，直接決定了產品的品質。對不同季節(jié)的不同種子醅中醋酸菌的相對豐度和乙醇脫氫酶活性進行分析，并將其接種到新的醅池中進行醋酸發(fā)酵，通過研究接種后醋醅的溫度、總酸及不揮發(fā)酸含量的變化，以此獲得最佳種子醅。結果表明，春季和秋季，鎮(zhèn)江香醋釀造過程最佳種子醅為第7天的醋醅；夏季和冬季，最佳種子醅分別為第6天和8天的醋醅。最佳種子醅中醋酸菌的相對豐度高，乙醇脫氫酶活性強，對提高出醋率、降低成本、提高產品品質具有重要影響。

種子醅；醋酸菌；乙醇脫氫酶； 醋酸發(fā)酵；優(yōu)化

鎮(zhèn)江香醋作為我國四大名醋之一，是我國傳統(tǒng)固態(tài)釀造食醋的典型代表，其“固態(tài)分層發(fā)酵工藝”是我國寶貴的民族文化遺產，2006年“鎮(zhèn)江恒順香醋釀造技藝”被列入首批國家級非物質文化遺產名錄。鎮(zhèn)江香醋以優(yōu)質江南糯米為主要原料，依靠天然多菌種混合發(fā)酵體系，結合傳統(tǒng)的固態(tài)分層發(fā)酵工藝，先后經過40多道工序，最終生產出獨具“酸而不澀，香而微甜，色濃味鮮，愈存愈鮮”特色的鎮(zhèn)江香醋[1]。

鎮(zhèn)江香醋的醋酸發(fā)酵時間為18～21 d，發(fā)酵過程中醋醅(醋醅指醋酸發(fā)酵過程中各原輔料及微生物的混合物)的溫度維持在40～45 ℃，含水量約60%～70%。鎮(zhèn)江香醋的醋酸發(fā)酵采用傳統(tǒng)套醪的方式進行接種，即將麩皮、稻殼和酒精醪液充分混合均勻之后，將上一批次發(fā)酵至一定時間的醋醅作為種子(即種子醅)，接入下一批新鮮混勻的醋醅中進行擴大培養(yǎng)。百年來，鎮(zhèn)江香醋的醋酸發(fā)酵一直延續(xù)套醪接種，此生產過程中不接種任何外源微生物，在長期的醋醅環(huán)境中馴化而形成的微生物群落結構是形成鎮(zhèn)江香醋獨特風味的重要因素。有研究表明[2]，在套醪接種過程中，醋醅中的主體微生物群落結構基本保持穩(wěn)定，這也從科學的角度解釋了鎮(zhèn)江香醋采用傳統(tǒng)套醪接種方式其產品品質保持穩(wěn)定的原因。

江蘇省鎮(zhèn)江市為北亞熱帶季風氣候，四季分明，但不同季節(jié)的鎮(zhèn)江香醋釀造均采用發(fā)酵至第7天的醋醅作為種子醅，該種子醅的確定由車間師傅以口頭的方式代代相傳而來，缺乏科學的依據和深入的研究。目前，在國內外關于鎮(zhèn)江香醋釀造過程種子醅的優(yōu)化研究尚未見報道。因此，本課題針對不同季節(jié)的不同種子醅進行研究并對其進行優(yōu)化，為鎮(zhèn)江香醋套醪接種時種子醅的選擇提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

種子醅：取自鎮(zhèn)江香醋釀造車間；細菌基因組提取試劑盒：美國MO BIO Laboratories；溶菌酶：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電泳儀、凝膠成像儀，美國伯樂公司；漩渦混合儀，賽默飛世爾(中國)有限公司；高速冷凍離心機，艾本德(上海)國際貿易有限公司；紫外分光光度儀，美國瓦里安公司；電子天平、精密pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子醅的取樣

取樣季節(jié)：春季(2015年4月)、夏季(2015年7月)、秋季(2015年10月)、冬季(2016年1月)。

取樣時間：發(fā)酵時間為5、6、7、8、9 d的醋醅。

取樣數(shù)量：各取3份作為平行樣，每份樣品從不同的醅池中取樣。

取樣方式：翻醅前，醅池的中間位置，從表層依次向下至深度40cm均勻取樣至無菌桶中，混合均勻后備用。

用途：1份留存于-80 ℃冰箱，用于細菌基因組的提??；另1份作為種子醅，接種到新的醅池中進行醋酸發(fā)酵。

1.3.2 細菌基因組的提取與測序

準確稱取1 g醋醅樣品置于無菌研缽中，加入液氮快速研磨至粉末狀，按照細菌基因組提取試劑盒中的說明對醋醅中的細菌基因組DNA進行提取。提取結束后，用1.0 g/100 mL的瓊脂糖凝膠電泳對所提取的細菌基因組DNA進行檢測[3]。

檢測合格后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，利用Illumina Miseq PE300平臺進行細菌基因組的16S rRNA測序分析，每個樣品至少提供2萬條測序數(shù)據，其中引物序列為338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

1.3.3 乙醇脫氫酶測定

采用瓦勒-霍赫法測定乙醇脫氫酶活性[4-5]。

1.3.4 溫度測定

采用溫度計直接測定醋醅的溫度，測量深度為30 cm，不同醅池測量深度相同。

1.3.5 總酸含量測定

采用氫氧化鈉標準溶液滴定法測定，參照《GB/T 18623—2011》。

1.3.6 不揮發(fā)酸含量測定

采用蒸餾收集，氫氧化鈉標準溶液滴定法測定，參照《GB/T 18623—2011》。

2 結果與分析

2.1 種子醅中醋酸菌相對豐度的測定

醋酸菌是鎮(zhèn)江香醋釀造過程中最重要的微生物，主要以巴斯德醋桿菌為主。醋酸菌的相對豐度是選擇種子醅的重要指標之一。本研究對不同季節(jié)的不同種子醅 (第5天、第6天、第7天、第8天、第9天)中醋酸菌相對豐度進行測定，結果如圖1所示。

由圖1可知，不同發(fā)酵時間的種子醅中醋酸菌的相對豐度具有明顯的差異，隨著發(fā)酵時間的延長均會出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。發(fā)酵起始階段營養(yǎng)物質豐富，隨著發(fā)酵時間的延長醋酸菌的數(shù)量迅速增加，當達到一定的豐度以后，隨著營養(yǎng)物質的逐漸消耗，代謝產物的積累，部分醋酸菌的增殖速度降低，并出現(xiàn)死亡、裂解的現(xiàn)象，與此同時其他微生物出現(xiàn)一定程度的增殖，導致醋酸菌的相對豐度逐漸降低。

圖1 不同季節(jié)的不同種子醅中醋酸菌的相對豐度Fig.1 The relative abundance of acetobacter in different starter solid-state vinegar culture

從圖1還可以看出，不同季節(jié)的種子醅中醋酸菌相對豐度也有差異。春季和秋季，種子醅中醋酸菌的相對豐度均在第7天達到最高，分別為21.11%和21.07%，此時醋酸菌在整個菌群中的優(yōu)勢程度最高；夏季，第6天的種子醅中醋酸菌的相對豐度最高，達到20.01%；冬季，醋醅中醋酸菌達到最高相對豐度的時間較長，于第8天達到最高，但相對豐度值也最大，為21.92%，原因可能與冬季氣溫較低，醋酸菌啟動發(fā)酵的時間延長，且低溫導致雜菌增殖速度慢、數(shù)量偏低有關。

WANG等人[2]在研究鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過程中微生物的動態(tài)變化時發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時間的延長，醋酸菌的相對豐度逐漸增加，直至發(fā)酵結束，該結論與本研究結果不符，其原因主要在于取樣深度的不同，本研究僅取中上層的醋醅進行研究，而WANG等人從表層取至底部。此外，有研究表明[6]，醋酸發(fā)酵前期醋酸菌的生物量呈逐漸上升趨勢，第 7天時達最高生物量，然后逐漸減低，與本研究結果相似，但不同季節(jié)、不同位置的醋醅中醋酸菌含量及水分含量均具有一定的差異，對醋醅中的微生物進行絕對定量時有一定的偏差。

2.2 種子醅中乙醇脫氫酶的測定

在醋酸發(fā)酵過程中，醋酸菌通過乙醇脫氫酶(ADH)將乙醇氧化成乙醛，然后再通過乙醛脫氫酶(ALDH)將乙醛氧化成醋酸[7]，其中前者尤為重要[8]。ADH的活性是衡量種子醅活力的重要的指標之一[9]，通過測定ADH活性，可以預測菌株的發(fā)酵能力，保證生產順利進行。本研究對不同季節(jié)的不同種子醅中ADH的活性進行測定，結果如圖2所示。

圖2 不同季節(jié)的不同種子醅中ADH的活性Fig.2 The alcohol dehydrogenase in different starter solid-state vinegar culture

由圖2可以看出，不同季節(jié)的不同種子醅中ADH活性具有一定的差異，變化規(guī)律與醋酸菌的相對豐度基本保持一致。春季和秋季，第7天的種子醅中ADH活性最高；夏季和冬季，種子醅中ADH活性最高值分別出現(xiàn)在發(fā)酵的第6天和第8天。研究表明[10-11]，ADH活性最高的醋酸菌可以產生更高濃度的酸，且ADH的活力與醋酸菌的產酸速率有明顯的相關性，即產酸速率隨著ADH活力的升高而升高。

2.3 接種后醋醅溫度的測定

套醪接種后醋醅的溫度是醋酸發(fā)酵過程中的重要指標，尤其是發(fā)酵前期對醋酸發(fā)酵有重要影響。高品質的種子醅可快速提高醋醅的溫度，醋酸菌生長旺盛，產酸快，迅速抑制雜菌的生長，可提高產率和產品品質。本研究將不同季節(jié)的不同種子醅按照鎮(zhèn)江香醋傳統(tǒng)套醪接種的方式進行接種，然后測定接種后各組在發(fā)酵過程中的溫度變化，結果如圖3所示。

圖3 不同季節(jié)接種不同種子醅后醋醅溫度變化Fig.3 The changes of temperature in different vinegar culture

由圖3可以看出，接種不同季節(jié)的不同種子醅后，醋醅溫度的變化趨勢基本相同。發(fā)酵初期(1～8 d)醋醅溫度迅速上升至45 ℃左右；發(fā)酵中期(9～14 d)溫度趨于平穩(wěn)，基本保持在44～46 ℃，發(fā)酵后期(15～18 d)，醋醅溫度逐漸下降。

不同季節(jié)的不同種子醅接種后，發(fā)酵初期醋醅溫度升高的速度具有一定的差異。春季，第7天種子醅的升溫速度最快；夏季，第6天種子醅的升溫速度最快；秋季，第7天種子醅的升溫速度最快；冬季，第8天種子醅的升溫速度最快。溫度升高速度越快，說明該種子醅的活力較強，醋酸菌的增殖速度快，這與醋酸菌的相對豐度高、ADH活性強的結果相一致。

2.4 接種后醅鹵中總酸和不揮發(fā)酸的測定

醅鹵是醋酸發(fā)酵期間從醋醅中滲透到發(fā)酵池底部的液體，因醋酸及其他有機酸等代謝產物易溶于水，且能比較均勻的分布在醅鹵中，因此通過檢測醅鹵的總酸和不揮發(fā)酸可以評價醋酸發(fā)酵的產酸率和質量，是判斷發(fā)酵質量的重要指標之一。將不同季節(jié)的不同種子醅按照鎮(zhèn)江香醋傳統(tǒng)套醪接種的方式進行接種后，測定各組醅鹵中的總酸和不揮發(fā)酸含量，結果如圖4和圖5所示。

圖4 不同季節(jié)接種不同種子醅后醅鹵中總酸變化Fig.4 The changes of total acid in different vinegar culture

在醋酸發(fā)酵過程中，各組醅鹵中總酸的變化趨勢相同，隨著發(fā)酵的進行總酸含量逐漸增加，最后趨于平穩(wěn)，其中第1～10天的總酸含量上升速度最快。不同季節(jié)的不同種子醅接種后醅鹵中總酸含量最高，產酸速度最快的分別為：春季，接種第7天種子醅的醅鹵；夏季接種第6天種子醅的醅鹵；秋季接種第7天種子醅的醅鹵；冬季接種第8天種子醅的醅鹵。最佳的種子醅產酸速度快，對雜菌的抑制作用強，原料利用率高，提高產品出率，對生產具有重要影響。

不揮發(fā)酸是鎮(zhèn)江香醋風味的重要組成部分，是鎮(zhèn)江香醋品質的重要指標之一。由圖5可以看出，不同季節(jié)的不同種子醅接種后醅鹵中不揮發(fā)酸的變化趨勢基本相同，且不揮發(fā)酸含量無明顯的差異，說明不同季節(jié)的不同種子醅對鎮(zhèn)江香醋釀造過程中不揮發(fā)酸含量的影響較小。此外，各組種子醅接種后醅鹵中不揮發(fā)酸含量出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，原因可能是在發(fā)酵初期醋醅底部處于厭氧狀態(tài)，部分乳酸菌等厭氧微生物產生大量乳酸等不揮發(fā)酸，而隨著翻醅的進行，氧氣含量逐漸增加，乳酸菌等厭氧微生物菌的生長、代謝受到抑制，且產生的部分有機酸被其他微生物代謝利用(如醋酸菌會代謝利用部分乳酸)，從而使不揮發(fā)酸的含量出現(xiàn)一定程度的降低。

圖5 不同季節(jié)接種不同種子醅后醅鹵中不揮發(fā)酸變化Fig.5 The changes of non-volatile acid in different vinegar culture

3 結論

(1)春季和秋季，鎮(zhèn)江香醋釀造過程中的最佳種子醅為第7天的醋醅；夏季，最佳種子醅為第6天的醋醅；冬季，最佳種子醅為第8天的醋醅。

(2)不同季節(jié)、不同發(fā)酵時間的種子醅對鎮(zhèn)江香醋的釀造均具有一定的影響，可以按照季節(jié)的不同選取不同的種子醅，最佳的種子醅可以提高產酸速度，增加產品出率、降低生產成本、提高產品品質，對生產具有重要影響。

(3)相關種子醅的使用對產品的風味是否具有一定的影響，后續(xù)需進一步研究。

[1] 包啟安.鎮(zhèn)江香醋傳統(tǒng)生產工藝的剖析[J].中國釀造,2000,19(4): 1-4.

[2] WANG Z M, LU Z M, YU Y J, et al.Batch-to-batch uniformity of bacterial community succession and flavor formation in the fermentation of Zhenjiang aromatic vinegar [J]. Food Microbiology, 2015(50):64-69.

[3] VERMA D,SATYANARAYNA T. An improved protocol for DNA extraction from alkaline soil and sediment samples for constructing metagenomic libraries[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2011,165(2): 454-464.

[4] 肖仔君,黃國清,鐘瑞敏.醋酸桿菌醇脫氫酶粗酶液的特性研究[J].食品研究與開發(fā), 2010,31(9):170-173.

[5] 胡雪桃，朱瑤迪，鄒小波,等.近紅外光譜技術快速預測鎮(zhèn)江香醋乙醇脫氫酶活性的研究[J].中國調味品, 2016(2):20-25.

[6] 陶京蘭,陸震鳴,王宗敏,等.實時熒光定量PCR監(jiān)測鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過程中微生物變化[J].食品發(fā)酵與工業(yè), 2013, 39(2):156-160.

[7] YAKUSHI T，MATSUSHITA K. Alcohol dehydrogenase of acetic acid bacteria: structure, mode of action, and applications in biotechnology [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 86(5):1 257-1 265.

[8] 周炳辰.食醋生產中醋酸菌乙醇脫氫酶的活性與產酸速率關系的研究[J].中國釀造, 2009，28(11):58-59.

[9] KRISHNA C. Solid-state fermentation systems-an overview [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2008, 25(1-2):1-30.

[10] TRCEK J, TOYAMA H, CZUHA J, et al. Correlation between acetic acid resistance and characteristics of ADH PQQ-dependent in acetic acid bacteria[J]. Applied Microbiology Biotechnology,2006,70:366-373.

[11] 陳洋,高冰,汪超,等.巴氏醋酸桿菌AS1.41產醋酸關鍵酶研究[J].中國釀造, 2016,35(1):38-42.

Optimization of starter solid-state vinegar culture acetic fermentation of Zhenjiang aromatic vinegar

LI Xin, YU Yong-jian*, ZHU Sheng-hu, ZHANG Jun-hong, ZHAO Di, YAO Qing

(Jiangsu Hengshun Vinegar industry Co., Ltd.，Zhenjiang 212000, China)

A cycle-inoculation technique is used for the production of Zhenjiang aromatic vinegar, this technique is important to the acetic fermentation of Zhenjiang aromatic vinegar since it directly determines the quality of products. The relative abundance of acetobacter and alcohol dehydrogenase in different starter solid-state vinegar culture were analyzed. The culture from the last batch was taken as the starter for the new batch, and the changes of temperature, total acid and non-volatile acid in the new batch were studied. In this research it was found that the optimum starter solid-state vinegar culture fermentation time was 7th day in spring and autumn, the optimum starter solid-state vinegar culture fermentation time was 7th day in summer, and the optimum starter solid-state vinegar culture fermentation time was 8th day in winter. The optimum starter solid-state vinegar culture has maximum relative abundance of acetobacter and alcohol dehydrogenase. The optimum starter solid-state vinegar culture has a major impact on the quality of vinegar.

starter solid-state vinegar culture; acetobacter; alcohol dehydrogenase; acetic fermentation; optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703020

碩士研究生，工程師(余永建研究員級高級工程師為通訊作者,E-mail：hsjszx@aliyun.com)。

江蘇省博士后科研資助計劃(1501137C)

2016-10-11，改回日期：2016-11-24