朱曼利，郭會明，孫宏韜，李偉，洪厚勝，3*

火龍果酵素中原花青素含量測定方法的建立

朱曼利1，郭會明1，孫宏韜2，李偉2，洪厚勝2，3*

（1.南京工業(yè)大學化學與分子工程學院，江蘇南京211800；2.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800；

3.南京匯科生物工程設備有限公司，江蘇南京210009）

采用香草醛-鹽酸法對火龍果酵素中原花青素含量進行測定，考察反應溫度、反應時間、香草醛質(zhì)量濃度對溶液吸光度值的影響，并確定火龍果酵素中原花青素含量測定的方法。結(jié)果表明，原花青素含量的最適檢測條件為1 mL火龍果酵素稀釋液，5 mL 5 g/100 mL的香草醛甲醇溶液，4 mL 10%鹽酸甲醇溶液，混勻后，35℃條件下顯色反應20 min，在波長500 nm處測定吸光度值。精密度和重現(xiàn)性試驗結(jié)果的相對標準偏差（RSD）值分別為1.23%和1.47%；平均回收率為99.5%～104.4%，RSD值為1.21%～2.11%。表明該法操作簡便，精密度和重現(xiàn)性良好，準確性高，適用于火龍果酵素中原花青素含量的測定。

火龍果酵素；原花青素；香草醛鹽酸法；測定

原花青素（proantho cyanidins）屬于單聚體多酚物質(zhì)[1]，廣泛存在于植物的花、果實、根莖中，常被用作功能性成分添加到保健品中[2]。據(jù)研究，這種類黃酮類物質(zhì)是國際公認的天然植物抗氧化劑[3]，其作用大，用途廣。醫(yī)學上，原花青素用來促進血液循環(huán)、保護視力，甚至能改善夜盲癥患者的視力[4]；與維生素C結(jié)合后有利于降低膽固醇含量[5]；對皮膚病患者有抗過敏、滋潤呵護的作用[6-7]。

火龍果（Hylocereus undulatusBritt）屬于仙人掌科量天尺屬植物，是一種富含維生素和水溶性膳食纖維的亞熱帶低能量多肉水果[8-9]?；瘕埞退厥且曰瘕埞麨橹饕习l(fā)酵而成的營養(yǎng)發(fā)酵液，是一類具有生物催化活性的物質(zhì)總稱，含天然植物發(fā)酵后的營養(yǎng)元素、益生菌等活性成分，其中豐富的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），脂肪酶、維生素等對人體機能修復、保健作用十分重要[10]。國內(nèi)火龍果酵素工藝日趨成熟，塑形減肥產(chǎn)品、增強免疫保健產(chǎn)品等均為熱門市售酵素產(chǎn)品[11]。由于原花青素結(jié)構的復雜性及測試方法的多樣性，國內(nèi)外并沒有制定統(tǒng)一的對酵素產(chǎn)品標準定量的檢測方法[12]。目前原花青素含量測試方法主要有正丁醇-鹽酸法、香草醛法、鐵鹽催化法、Folin-Ciocaheau與高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）結(jié)合法、高鐵鹽-鐵氰化鉀分光光度法等。正丁醇-鹽酸法應用較多，但易受酚類物質(zhì)結(jié)構的影響，使測定結(jié)果偏低[13]；鐵鹽催化法操作簡便，特征明顯，但是對反應體系中的含水量和鐵離子濃度要求比較嚴格，因此重現(xiàn)性差[14]；Folin-Ciocaheau與HPLC結(jié)合法結(jié)果相對準確，但得到的是原花青素的相對含量，不能作為定量分析的方法[15]；高鐵鹽-鐵氰化鉀分光光度法是在鐵鹽催化反應的基礎上確定原花青素含量與吸光度的關系，測試結(jié)果易受雜質(zhì)的影響[16]。香草醛法操作方式較多，差別較大[17]。

本實驗為探索香草醛-鹽酸法檢測火龍果酵素中原花青素含量的最佳測試條件，考察了反應溫度、反應時間、香草醛質(zhì)量濃度等對火龍果酵素中原花青素的影響，并確定適合火龍果酵素中原花青素含量的檢測條件，以期為進一步測定保健飲品中原花青素含量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火龍果酵素原液：實驗室自制；兒茶素標準品（純度≥98%）、香草醛、甲醇、乙醇、鹽酸（均為分析純）：天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司；原花青素標準品（純度≥98.5%）：上海凌峰化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA124電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；FE20 pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器：常州國華電器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計：日本島津公司；3K15高速冷凍離心機：德國Sigma公司；手提式壓力蒸汽滅菌器：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 火龍果酵素溶液的制備

取1 mL火龍果酵素原液5 000 r/min離心5 min，取上清液以蒸餾水稀釋30倍，稀釋后的酵素溶液備用。

1.3.2 標準品的選擇及檢測波長的確定

配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的兒茶素和原花青素標準品溶液，準確吸取1 mL兒茶素標準品溶液（或原花青素標準品溶液）至試管中，分別加入5 mL 5 g/100 mL香草醛甲醇溶液，4 mL 10%鹽酸甲醇溶液，并于刻度試管中搖勻，于35℃水浴中反應20 min，以甲醇為空白對照，在波長350～750 nm范圍進行全波段掃描，并確定最大吸收波長。

1.3.3 標準曲線的繪制

分別吸取1.0mg/mL兒茶素標準溶液各0.05mL、0.10mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL、0.45 mL、0.50 mL于刻度試管中，以甲醇定容至1 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.40mg/mL、0.45mg/mL、0.50mg/mL的系列梯度溶液，搖勻后加入5 mL 5g/100mL香草醛甲醇溶液，4mL10%鹽酸甲醇溶液，混勻，以甲醇為空白對照，35℃恒溫反應20 min后于波長500 nm處測定吸光度值，以兒茶素標準品質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。按照標準曲線回歸方程計算樣品中原花青素含量。

1.3.4 火龍果酵素與香草醛—鹽酸反應的影響因素

反應溫度的影響：取1mL火龍果酵素稀釋液于試管中，加入5 mL 5 g/100 mL香草醛甲醇溶液，4 mL 10%鹽酸甲醇溶液，搖勻，以甲醇為空白對照，分別在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃條件下反應20 min，在波長500 nm處測定吸光度值?？疾旆磻獪囟葘瘕埞退嘏c香草醛—鹽酸反應后溶液吸光度值的影響[18]。

香草醛質(zhì)量濃度的影響：當香草醛甲醇溶液質(zhì)量濃度分別為1 g/100 mL、2 g/100 mL、3 g/100 mL、4 g/100 mL、5 g/100 mL、6 g/100 mL時，考察香草醛質(zhì)量濃度對火龍果酵素與香草醛—鹽酸反應后溶液吸光度值的影響。

反應時間的影響：當反應時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min時，考察反應時間對火龍果酵素與香草醛—鹽酸反應后溶液吸光度值的影響。

1.3.5 測定方法的評價[19-21]

通過精密度、重復性、加標回收率試驗，判斷所建立的火龍果酵素中原花青素檢測方法是否穩(wěn)定、可靠和準確?；厥章视嬎愎饺缦拢?/p>

式中：A為樣品所含被測成分的質(zhì)量濃度，mg/mL；B為加入

標準品的質(zhì)量濃度，mg/mL；C為實測值，mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準品的選擇及最大吸收波長的確定

兒茶素和原花青素標準品在波長350～750 nm范圍進行全波長掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 兒茶素及原花青素標準品紫外掃描圖Fig.1 UV scanning graph of catechin and proanthocyanidins standard substance

由圖1可知，兒茶素標準品和原花青素標準品顯色反應后，溶液的最大吸收波長均為500 nm，以兒茶素為標準品時，吸光度值比原花青素標準品高很多，靈敏度也高，且經(jīng)濟成本較低，故選擇兒茶素為標準品較為合適，且測定最大吸收波長為500 nm。

2.2 標準曲線的制作

按照1.3.3實驗步驟，以兒茶素標準品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，吸光度值A500nm（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，標準曲線回歸方程為Y=2.034 3X+ 0.046 7，相關系數(shù)R2=0.996 3，結(jié)果表明在0.1～0.45 mg/mL范圍內(nèi)，兒茶素質(zhì)量濃度與吸光度值具有良好的線性關系。

圖2 兒茶素標準曲線Fig.2 Standard curve of catechin

2.3 火龍果酵素與香草醛—鹽酸反應的影響因素

2.3.1 反應溫度的影響

圖3 反應溫度對原花青素吸光度值的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on absorbance value of proanthocyanidins

由圖3可知，隨著反應溫度的增加，火龍果酵素與香草醛顯色反應溶液的吸光度值呈先增加后減小的趨勢，溫度的升高使香草醛—鹽酸與火龍果酵素稀釋液中原花青素顯色反應強烈，吸光度值變高，當反應溫度為35℃時，反應溶液吸光度值達到最大；當反應溫度超過35℃后，吸光度值快速減小，因此確定最適宜反應溫度為35℃。

2.3.2 香草醛質(zhì)量濃度的影響

圖4 香草醛質(zhì)量濃度對原花青素吸光度值的影響Fig.4 Effect of vanillin concentration on absorbance value of proanthocyanidins

由圖4可知，隨著香草醛質(zhì)量濃度的增加，吸光度值先迅速增加后趨于平緩，當香草醛質(zhì)量濃度為5 g/100 mL時，吸光度值達到最大，繼續(xù)增加香草醛質(zhì)量濃度，吸光度值變化不大，為避免香草醛濃度過高而引起自身縮合發(fā)生變色的情況，最佳香草醛質(zhì)量濃度采用5 g/100 mL。

2.3.3 反應時間的影響

圖5 反應時間對原花青素吸光度值的影響Fig.5 Effect of reaction time on absorbance value of proanthocyanidins

由圖5可知，吸光度值隨反應時間的延長先增后減，當反應20 min時，吸光度值達到最大，反應20 min后，光照及顯色反應過程中香草醛自身縮合引起吸光度值不斷減小，最終趨于平緩。此時香草醛和火龍果中原花青素的顯色得到充分反應，因此，確定最佳反應時間為20 min。

2.4 測定方法的評價

2.4.1 精密度試驗

精確吸取1 mL火龍果酵素稀釋液，按照優(yōu)化后的測定方法，平行測定6次，計算原花青素的質(zhì)量濃度及其相對標準偏差（relativestandarddeviation，RSD），結(jié)果見表1。由表1可知，檢測結(jié)果RSD值為1.23%，表明該方法精密度良好。

表1 精密度試驗結(jié)果Table 1 Results of precision tests

2.4.2 重復性試驗

為驗證方法的重現(xiàn)性，精密吸取1 mL火龍果酵素稀釋液6份，此測定由不同測試人員在同一臺儀器上完成，按照優(yōu)化后測定方法，測定火龍果酵素中原花青素的吸光度值，計算原花青素的質(zhì)量濃度，結(jié)果如表2所示。由表2可知，重復測定6次檢測結(jié)果的RSD值為1.47%，表明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

表2 重現(xiàn)性試驗結(jié)果Table 2 Results of reproducibility tests

2.4.3 回收率試驗

取火龍果酵素稀釋溶液1mL，加入質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL、2.5 mg/mL、3.7 mg/mL的兒茶素標準溶液，按照優(yōu)化后測定方法，測定火龍果酵素中原花青素的吸光度值，計算原花青素的含量，每組試驗平行測定6次，并計算其回收率，結(jié)果如表3所示。由表3可知，原花青素的平均回收率為99.5%～104.4%，RSD為1.21%～2.11%。表明該方法準確度高，符合檢測方法標準，可用于火龍果酵素中原花青素的檢測。

表3 回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of recovery rate tests

2.5 火龍果酵素中原花青素含量的測定

表4 不同火龍果酵素樣品中原花青素含量的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of proanthocyanidins content in different pitaya enzyme

由表4可知，市售5種不同的火龍果酵素中原花青素含量有所差異，其中廣州康瀅生物科技有限公司生產(chǎn)的火龍果酵素產(chǎn)品中原花青素含量最高，為3.42 mg/mL。

3 結(jié)論

本實驗采用香草醛-鹽酸法建立火龍果酵素中原花青素含量的測定方法，同時考察了反應溫度、時間、香草醛質(zhì)量濃度對反應溶液吸光度值的影響，最終確定適合火龍果酵素中原花青素含量測定的方法。結(jié)果表明，香草醛-鹽酸法測定火龍果酵素中原花青素含量的最適條件為：1 mL火龍果酵素溶液，5mL5g/100mL的香草醛甲醇溶液，4mL 10%鹽酸甲醇溶液，混勻后35℃條件下顯色反應20 min后在波長500 nm處測得吸光度值。在此條件下，該法操作簡便，精密度和重現(xiàn)性試驗結(jié)果的RSD值分別為1.23%和1.47%，平均回收率為99.5%～104.4%，RSD為1.21%～2.11%，表明該法具有較好的精密度、重現(xiàn)性，且回收率較高，適用于火龍果酵素中原花青素含量的測定。為火龍果酵素中原花青素含量提供有效的檢測方法。

[1]董銀卯，何聰芬，王領，等.火龍果酵素生物活性的初步研究[J].食品科技，2009，34（3）：192-196.

[2]周秋枝，黃蕾，沈丹華，等.火棘果中原花青素含量測定方法的建立[J].食品工業(yè)科技，2013，34（7）：314-318.

[3]孟玉彩，趙文，李慧玲，等.薔薇紅景天中原花青素含量的測定方法[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（4）：133-136.

[4]李利敏.八種油茶蒲提取物活性物質(zhì)研究及其抗氧化活性比較[D].杭州：浙江大學，2013.

[5]夏宏義，楊勇，夏樂晗，等.柿果成熟過程中總酚和縮合單寧含量的變化[J].食品科學，2014，35（19）：66-71.

[6]譚美亭.蓮房原花青素的提取與分離純化工藝研究[D].鄭州：鄭州大學，2012.

[7]孫皓，伍麗娜.石油醚提取葡萄籽中原花色素工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（25）：12669-12670.

[8]張妍，吳秀香.原花青素研究進展[J].中藥藥理與臨床，2011（6）：112-116.

[9]張晶瑩，胡文效，高德艷，等.葡萄籽原花青素檢測方法的比較[J].中外葡萄與葡萄酒，2013（6）：18-20.

[10]黃啟亮.松針原花青素的制備及主要生物活性研究[D].金華：浙江師范大學，2012.

[11]張素華.沙棘及其提取物中原花青素含量的分析測定[J].沙棘，2008，21（1）：16-18.

[12]楊磊，蘇文強，汪振洋，等.落葉松樹皮提取物中低聚原花青素含量測定方法的研究[J].林產(chǎn)化學與工業(yè)，2004，24（s1）：111-114.

[13]陶鈺.山竹果皮植物多酚及其抗氧化活性的研究[D].南寧：廣西大學，2009.

[14]蔣其忠.茶籽殼原花青素的分離純化、穩(wěn)定性及抗氧化活性研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學，2010.

[15]鄢又玉，夏婷，張育，等.三氯化鋁比色測定火棘總黃酮方法的系統(tǒng)考察[J].食品研究與開發(fā)，2015，36（5）：89-94.

[16]魏征，段漢林，李坤.一種能調(diào)節(jié)人體新陳代謝、分解體內(nèi)脂肪的火龍果酵素制劑及制備方法：CN103960657A[P].2014-08-06.

[17]徐慧，王秋玲，韋剛，等.火龍果的保健功效及其研究進展[J].廣西科學院學報，2010，26（3）：383-385.

[18]李春陽，許時嬰，王璋.香草醛-鹽酸法測定葡萄籽、梗中原花青素含量的研究[J].食品科學，2004，25（2）：157-161.

[19]何肖，王文凱，馬明波，等.香草醛鹽酸法定量薯莨色素提取液中的縮合單寧[J].現(xiàn)代紡織技術，2014，22（6）：5-8.

[20]姚開，何強，呂遠平，等.葡萄籽提取物中原花青素含量的測定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28（3）：17-19.

[21]單虹麗，卿鈺，杜曉，等.茶葉兒茶素總量比色測定的鹽酸（硫酸）香草醛顯色反應能力評價[J].林產(chǎn)化學與工業(yè)，2012，32（3）：71-76.

Establishment of determination method of proanthocyanidins content in pitaya enzyme

ZHU Manli1,GUO Huiming1,SUN Hongtao2,LI Wei2,HONG Housheng2,3*
(1.College of Chemistry and Molecular Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China; 2.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China; 3.Nanjing Highke Biotechnology Equipment Co.,Ltd.,Nanjing 210009,China)

The content of proanthocyanidins in pitaya enzyme was determined by vanillin-HCl method.The effects of reaction temperature,time and vanilline content on solution absorbance values were investigated,and the determination method of proanthocyanidins content in pitaya enzyme was established.The results showed that the optimum detection conditions were pitaya enzyme dilute solution 1 ml,5 g/100 ml vanillin methanol solution 5 ml,10%HCl methanol solution 4 ml,after blending,the reaction was carried out at 35℃for coloration 20 min and then absorbance value was detected at the wavelength of 500 nm.The relative standard deviation(RSD)of precision and reproducibility tests results were 1.23%and 1.47%, respectively.The average recovery rate 99.5%-104.4%,RSD was 1.21%-2.11%,which indicated that the method was easy and simple,and had good precision and reproducibility and high accuracy,and was suitable for the determination of proanthocyanidins content in pitaya enzyme.

pitaya enzyme;proanthocyanidins;vanillin-HCl method;determination

TS261.7；TS218；TQ920

0254-5071（2017）04-0184-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.038

2016-12-19

國家高技術研究發(fā)展計劃‘863計劃’（2012AA021201）

朱曼利（1992-），女，碩士研究生，研究方向為改善腸胃中藥酵素的制備工藝及其功能特性。

*通訊作者：洪厚勝（1965-），男，教授，博士，研究方向為生物過程裝備。