胡蓉花，程淑君，王建峰，羅建軍，劉瓊光

（1.江西省吉安市煙草公司，江西 吉安 343009；2. 華南農業(yè)大學農學院，廣東 廣州 510642）

不同培養(yǎng)條件對煙草青枯病菌生長的影響

胡蓉花1，程淑君2，王建峰1，羅建軍2，劉瓊光2

（1.江西省吉安市煙草公司，江西 吉安 343009；2. 華南農業(yè)大學農學院，廣東 廣州 510642）

比較了9種陽離子、碳源、氮源和pH值對煙草青枯菌生長的影響，結果表明，不同陽離子對煙草青枯菌生長的影響具有差異，在1 mmol/L濃度條件下，Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+等離子間對青枯菌生長影響差異較小，而與Cu2+、Al3+差異較大；在10 mmol/L濃度條件下，Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Al3+等離子顯著抑制青枯菌生長；在30 mmol/L濃度條件下，Ca2+、K+明顯抑制青枯菌生長，而Mg2+在60 mmol/L濃度下，仍青枯菌生長良好。此外，研究結果還表明，青枯菌生長最適宜的pH值為7，最適宜的碳源為蔗糖，最適宜的氮源為蛋白胨，硝態(tài)氮氮源不利于青枯菌生長。

煙草青枯病菌；陽離子；碳氮源；pH值

由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum，俗稱青枯菌）引起的煙草青枯病，是煙草的毀滅性病害之一，也是典型的土傳病害。作物青枯病在我國華東、西南和華南地區(qū)發(fā)生尤為嚴重，目前尚未有理想的防治藥劑和有效措施［1-2］。植物抵抗病害的能力與其營養(yǎng)水平密切相關，平衡施肥技術從植物保護的角度來講，既要保證作物的最佳生長，又要兼顧使作物獲得最大抗性［3］。礦質元素是植物正常生長發(fā)育所必需的，包括大量元素和微量元素，其中有些礦質元素對真菌、細菌、病毒等病原物引起的侵染性病害有顯著影響［4］。礦質營養(yǎng)以多種不同的方式影響土傳病害的發(fā)生和病原菌的生長［5］。無論是在室內還是在田間條件下，礦質營養(yǎng)對各種植物病害的發(fā)生發(fā)展均有一定影響［6］，但其作用機理尚不十分清楚。。

目前，關于營養(yǎng)與青枯病關系方面的研究主要集中在有機肥或有機土壤改良劑［7-8］，單從某種或幾種礦質元素與青枯病發(fā)生關系的研究相對較少，盡管也有少量文獻報道某些元素對青枯菌生長的影響［9］，但是研究還不完善和深入。況且，來自不同地域的青枯菌，對一些營養(yǎng)元素的利用能力和敏感水平可能存在差異。本研究分析了不同的碳源、氮源及9種陽離子對煙草青枯病菌生長的影響，以期為青枯病防治的新型植物保護劑的研發(fā)和生產上青枯病的有效防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：煙草青枯病菌菌株Tb590，由華南農業(yè)大學細菌研究室保存提供。測定時，先將菌株活化，取單菌落接種到LB培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)24 h，用于各項測定實驗。

LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、氯化鈉 5 g/L，pH7.0。

不同陽離子培養(yǎng)基配制：在LB培養(yǎng)液的基礎上分別加入CaCl2、KCl、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、AlCl3、FeCl3、MnSO4等試劑，每種陽離子各自配制成終濃度為1、10、30、60、90 mmol/L的LB培養(yǎng)液，用HCl或NaOH調整pH值為7，試管分裝，每管5 mL，消毒滅菌。所有試劑均為國產分析純。

碳源利用基礎培養(yǎng)基：酵母膏 10 g/L、NaH2PO40.5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.1 g/L。

氮源利用基礎培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、Na2HPO42.13 g/L、KH2PO41.36 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.005 g/L、FeSO4·7H2O 0.5 mg/L。

1.2 不同陽離子對青枯菌生長的影響測定方法

取培養(yǎng)24 h的新鮮Tb590菌液50 μL，分別接種到陽離子培養(yǎng)液中，每種陽離子每個濃度3個重復，30℃搖床培養(yǎng)24h。以接種和不接種培養(yǎng)0 h的LB培養(yǎng)基為對照，用分光亮度計測定λ = 600 nm的光吸收值（OD600）。

1.3 不同pH對煙草青枯病菌生長的影響

在LB培養(yǎng)基中，用HCl或NaOH調節(jié)其pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10。接種青枯菌和測定方法同1.2。

1.4 不同碳、氮源對煙草青枯病菌生長的影響

以1%的量分別將葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘露醇、甘油加入碳源基礎培養(yǎng)基，制成不同碳源培養(yǎng)基；以1%的量分別加入NaNO3、NH4H2PO4、（NH4）2SO4、NH4Cl、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等制成不同氮源培養(yǎng)基。接種青枯菌和測定方法同1.2。

2 結果與分析

2.1 不同陽離子對煙草青枯病菌生長的影響

不同濃度Ca2+對煙草青枯菌生長的影響具有明顯差異。Ca2+濃度為1 mmol/L和10 mmol/L時，青枯菌生長較好，OD600均為1.0左右。當Ca2+濃度≥30 mmol/L時，青枯菌生長受到明顯抑制，OD600降為0.0805，且Ca2+濃度為90 mmol/L時，完全抑制了青枯菌的生長（表1）。

從表1可以看出，K+濃度為10 mmol/L和1 mmol/L時，青枯菌生長較好，當K+濃度≥30 mmol/L時，青枯菌生長受到明顯抑制。當Mg2+濃度≤60 mmol/L時，青枯菌生長較好，且它們之間的OD600值差異不明顯；只有當Mg2+濃度≥90 mmol/L時，青枯菌的生長才受到明顯的抑制。

表1 不同離子濃度對煙草青枯病菌生長的影響

不同濃度的Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+對煙草青枯菌生長的測定結果（表1）表明，當濃度為1 mmol/L時，青枯菌生長較好，而當其濃度≥10 mmol/L時，青枯菌的生長則受到明顯抑制。但Fe2+濃度為60 mmol/L和90 mmol/L，其OD值稍高于30 mmol/L時，可能是實驗誤差導致，有待進一步研究。

不同濃度Al3+對煙草青枯菌生長的測定結果（表1）表明，Al3+濃度為10 mmol/L時，其生長明顯比在1 mmol/L和30 mmol/L濃度下要好，當Al3+濃度≥60 mmol/L時，青枯菌生長受到明顯抑制。

此外，從表1還可以看出，濃度為1 mmol/L時不同陽離子對煙草青枯菌生長的影響具有明顯差異，且在此濃度下，Mg2+、 Fe3+、Fe2+對青枯菌生長較好。Ca2+、K+、Mn2+和Zn2+對青枯菌生長受到一定影響，且與Mg2+、 Fe3+、Fe2+差異顯著。Cu2+和 Al3+對青枯菌生長受到明顯抑制，與其他各離子均有顯著差異。

當陽離子濃度為10 mmol/L時，Mg2+對青枯菌生長最好，其次是Ca2+和K+，Cu2+、Mn2+、Al3+、 Fe3+、Fe2+和Zn2+對青枯菌生長受到明顯抑制，與Ca2+、K+差異顯著。當陽離子濃度為30 mmol/L時，除了Mg2+對青枯菌生長影響較小外，其他離子均明顯抑制青枯菌生長，且與10 mmol/L濃度的生長差異顯著。

綜合分析以上結果，表明煙草青枯菌能在1 mmol/L和10 mmol/L 的Ca2+、K+、Mg2+離子條件下較好地生長，其中Mg2+對青枯菌生長影響較小；9種陽離子在較高濃度（90 mmol/L）下對煙草青枯菌生長均具有抑制作用，其中Ca2+和Cu2+抑菌作用最明顯。在同一濃度10 mmol/L下，Mg2+對青枯菌的生長最好，其次是Ca2+和K+離子，Cu2+、Zn2+和Fe2+離子對青枯菌抑菌作用較明顯。研究結果還表明，1mmol/L濃度的不同陽離子對青枯菌生長影響較小，青枯菌生長較好，但1 mmol/L的Cu2+和Al3+離子對青枯菌生長有抑制作用。

2.2 不同pH對煙草青枯病菌生長的影響

煙草青枯病菌在pH3～9條件下均能生長，pH6～8生長較好，其中pH7生長最好，為最適宜pH，pH6較pH8生長好（表2）。

2.3 不同碳、氮源對煙草青枯病菌生長的影響

測定結果發(fā)現(xiàn)，煙草青枯菌在不同碳源培養(yǎng)條件下生長差異不顯著，但在以蔗糖和甘露醇為唯一碳源的條件下生長較好（表2）。

測定結果發(fā)現(xiàn)，煙草青枯菌在不同的氮源條件下生長存在差異，在NaNO3條件下生長受到抑制，而在蛋白胨和牛肉膏條件下生長較好，其中蛋白胨中生長最好。NaNO3和NH4Cl等無機氮對其生長不利（表2）。

3 結論與討論

以往研究表明，鈣營養(yǎng)對番茄青枯病具有較好的控病效果，增加營養(yǎng)液中鈣濃度可減輕青枯病嚴重度［10］。低、中、高鈣濃度處理番茄，青枯病的嚴重度分別為100%、77.1%和56.8%，表明鈣能降低青枯病的發(fā)生［11］。本試驗結果表明，Ca2+濃度≥30 mmol/L時，青枯菌生長受到明顯抑制，與濃度為10 mmol/L的差異顯著。且Ca2+濃度為90 mmol/L時，完全抑制了青枯菌的生長。由此推測，高濃度鈣能降低青枯病的發(fā)生可能與其具有抑制青枯菌生長有關，但需要進一步驗證。

表2 不同pH值、碳源和氮源對青枯菌生長的影響

鄭世燕等［12］室內試驗表明，在保證煙株正常生長營養(yǎng)的基礎上增施Ca、B、Mg、Mo 等4種礦質元素對煙草青枯病均有一定的控病效果。吳衛(wèi)玲［13］研究表明，硼酸鈉對青枯雷爾氏菌的抑菌效果與其濃度呈正相關，當硼酸鈉濃度≥0.5 mmol/L時，對煙草青枯病菌的生長有顯著影響，本研究也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象（結果未顯示）。

譚軍等［9］研究指出，在添加有微量元素的培養(yǎng)基中，鋅和銅對青枯菌的生長影響較大，當鈣濃度為 2 mmol/L 時，青枯菌的生長明顯受到抑制。本研究的9種陽離子對青枯菌生長測定結果表明，在1 mmol/L濃度條件下，Ca2+、Zn2+、Cu2+、Al3+等離子對煙草青枯菌生長的抑制作用最明顯，基本上支持譚軍等［9］的研究結果。然而，譚軍等［9］設定的離子濃度范圍較小，最高濃度只有2 mmol/L，不能真實反映影響青枯菌停止生長的最大濃度，而本研究測定的離子濃度范圍較大，能較好反映隨著離子濃度升高，明顯抑制青枯菌生長的真實情況。如Mg2+只有在較高濃度（90 mmol/L）時，青枯菌生長才明顯受到抑制，而在1～60 mmol/L范圍內，Mg2+對青枯菌生長并無明顯抑制作用。綜合本研究結果表明，不同陽離子影響青枯菌生長的濃度范圍不完全一致，這為生產上植物的平衡施肥提供了有價值的參考。

本研究在測定不同陽離子對煙草青枯菌生長的抑制作用時，所使用的化學試劑分別為CaCl2、KCl、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、AlCl3、FeCl3和MnSO4等，其中的陰離子均為Cl-和SO42-。譚軍等［9］通過在培養(yǎng)基中加入Na2SO4并設置培養(yǎng)基終濃度為0.5～5 g/L等6個濃度梯度時，發(fā)現(xiàn)不同濃度SO42-對青枯菌生長的影響不明顯。而關于氯離子對青枯菌的影響也較少［14］，因此，我們認為，本研究不同陽離子對煙草青枯菌生長的測定結果真實可靠，Cl-和SO42-對煙草青枯菌生長的影響不大，對本研究結果不會產生較大影響。

營養(yǎng)物質是微生物新陳代謝和一切生命活動的物質基礎，失去這個基礎，生命將停止。本研究結果表明，煙草青枯菌最適生長的pH為7，相對來說，青枯菌在堿性條件下比在酸性條件下生長更差，抑制作用更明顯，這與生產上通過增施石灰、提高土壤堿性［15］抑制青枯菌數(shù)量，達到減輕青枯病目的相符合。此外，研究結果還發(fā)現(xiàn)，煙草青枯菌在蛋白胨和牛肉膏等有機氮中生長較好，而在以NH4Cl和NaNO3為氮源的無機氮中生長明顯受抑制，因此，在生產實踐過程中，可通過施用硝態(tài)氮，控制煙草青枯病的發(fā)生。

本研究結果為煙葉生產上的青枯病防治提供了理論依據和指導，生產上可通過營養(yǎng)調控措施，較大限度地抑制病原菌的生長，從而達到控制作物青枯病的目的。

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（責任編輯 楊賢智）

Influence of different culture conditions on Ralstonia solanacearum growth

HU Rong-hua1，CHENG Shu-jun2，WANG Jian-feng1，LUO Jian-jun2，LIU Qiong-guang2
（1.Ji’an Municipal Tobacco Company，Ji’an 343009，China；2. College of Agriculture， South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Tobacco bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is a widespread and serious disease in China and is difficult to control. Nutrition is the material basis of microbial metabolism and all life activities. Analyzing the effects of nutrition elements on the growth of R. solanacearum is important for inhibiting the growth of pathogenic bacteria through nutrition regulation measures so as to the bacterial wilt disease control. The growth of R. solanacearum under nine kinds of cations，carbon source，nitrogen source and pH were compared in this study. The results showed that R. solanacearum growth under different cations was different. Under the concentration of 1 mmol/L，little influence of Ca2+，K+，Mg2+，Mn2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+were observed on R. solanacearum growth，and their effects were different from Cu2+and Al3+. Under the conditions of 10 mmol/L of Mn2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Cu2+and Al3+respectively，the R. solanacearum growth was inhibited significantly. When the concentration of Ca2+and K+was 30 mmol/L，the R. solanacearum growth was inhibited，while the concentration of Mg2+was 60 mmol/L，R. solanacearum grew well. In addition，the results also showed that pH value 7，sucrose and peptone were the best for R. solanacearum growth. Nitrate nitrogen source was against R. solanacearum growth.

Ralstonia solanacearum；cation；carbon and nitrogen sources；pH

S432.4+2

A

1004-874X（2017）02-0124-05

2016-09-15

中國煙草總公司江西省公司科技項目（贛煙司［2015］7 號，贛煙司［2016］81 號）；江西省吉安市煙草專賣局（公司）科技項目（吉煙科［2014］3 號）；國家公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303015-07）

胡蓉花（1970-），女，高級農藝師，E-mail：1908479316@qq.com

劉瓊光（1964-），男，博士，副教授，E-mail：qgliu@scau.edu.

胡蓉花，程淑君，王建峰，等. 不同培養(yǎng)條件對煙草青枯病菌生長的影響［J］.廣東農業(yè)科學，2017，44（2）：124-128.