癲癇幼鼠海馬絲裂酶原蛋白活化激酶表達的特點及其對巨噬細胞炎性蛋白-α/趨化因子受體5表達的影響

王靜茹，朱曉波，馬宇，陳少杰，王一彪

癲癇幼鼠海馬絲裂酶原蛋白活化激酶表達的特點及其對巨噬細胞炎性蛋白-α/趨化因子受體5表達的影響

王靜茹，朱曉波，馬宇，陳少杰，王一彪

目的 探討癲癇幼鼠海馬絲裂酶原蛋白活化激酶(MAPKs)表達的特點及其對巨噬細胞炎性蛋白-α(MIP-1α)/趨化因子受體5(CCR5)表達的影響。方法 應(yīng)用立體定向技術(shù)對側(cè)腦室內(nèi)注射海人酸(KA)，建立幼鼠驚厥模型。將出生21 d的Wistar幼鼠分為空白對照組、磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組及KA 4 h、8 h、16 h、24 h、3 d組，比較各組MAPKs表達的差異。另將出生21 d的幼鼠分為PBS+二甲亞砜(DMSO)組、KA+DMSO組、KA+PD98059(ERK1/2抑制劑)組和KA+SB203508(p38MAPK抑制劑)組，比較各組MIP-1α、CCR5表達的差異。采用Western Blot方法檢測MAPKs蛋白水平及CCR5的表達。采用ELISA方法檢測MIP-1α的表達。采用免疫組化染色方法檢測各組大鼠海馬P-ERK1/2、P-p38MAPKs等蛋白的表達。采用免疫熒光雙標(biāo)染色探討P-ERK1/2和P-p38MAPK的膠質(zhì)細胞來源。結(jié)果 與空白對照組比較，KA 4 h、8 h、16 h、24 h、3 d組P-ERK1/2水平明顯增高；KA 8 h、16 h、24 h、3 d組P-P38MAPK水平明顯增高(均P<0.05)。側(cè)腦室注射KA后大鼠P-ERK1/2與P-P38MAPK表達主要分布在齒狀回門區(qū)和錐體細胞層等神經(jīng)元損傷明顯的海馬組織中。在側(cè)腦室注射KA后，部分P-ERK1/2來源于活化的小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞，而P-p38MAPK僅在小膠質(zhì)細胞中出現(xiàn)免疫活性表達。與PBS+DMSO組比較，KA+DMSO組、KA+PD98059組和KA+SB203508組大鼠海馬組織中MIP-1α、CCR5蛋白水平均明顯增高，OX-42陽性細胞數(shù)明顯增加(均P<0.05)。與KA+DMSO組比較，KA+PD98059組、KA+SB203508組大鼠海馬組織中MIP-1α、CCR5蛋白水平均明顯降低，OX-42陽性細胞數(shù)明顯減少(均P<0.05)。結(jié)論 在幼鼠癲癇發(fā)生的早期階段，MAPKs(ERK1/2、p38MAPK)可部分地調(diào)控MIP-1α/CCR5的表達。

幼鼠；癲癇發(fā)生；絲裂原活化蛋白激酶；巨噬細胞炎性蛋白-1α；趨化因子受體5

癲癇是人類神經(jīng)系統(tǒng)最常見的疾病之一，成年后的癲癇發(fā)作或相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)的認(rèn)知功能等缺陷與嬰幼兒期或兒童期的癇性發(fā)作有密切的關(guān)系。目前，已知癲癇形成過程包含了大量事件，如即刻早期基因的誘導(dǎo)、離子通道及其受體的改變、神經(jīng)炎性反應(yīng)、突觸重塑及神經(jīng)發(fā)生等。其中神經(jīng)炎性反應(yīng)事件在近幾年來受到廣泛關(guān)注。近年來，趨化因子作為多種神經(jīng)疾患炎性反應(yīng)的參與者受到廣泛關(guān)注[1]。前期研究[2]表明，巨噬細胞炎性蛋白-α(MIP-1α)/趨化因子受體5(CCR5)生物軸在癲癇發(fā)生的早期階段發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，但是其表達調(diào)控機制尚不清晰。體外研究[3-4]表明，絲裂酶原蛋白活化激酶(MAPKs)信號通路分子可能在調(diào)控MIP-1α/CCR5的表達方面發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討側(cè)腦室注射海人酸(KA)后幼鼠海馬MAPKs的變化規(guī)律，及其對MIP-1α和CCR5表達的影響，為進一步的臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 幼年健康雄性wistar 大鼠(出生21 d)，體質(zhì)量(55±3)g，由山東大學(xué)動物實驗中心提供。具體分組如下：實驗1：側(cè)腦室注射KA對幼鼠海馬內(nèi)MAPKs活性的影響。大鼠隨機分為空白對照組、側(cè)腦室注射磷酸鹽緩沖液(PBS)后24 h組(PBS對照組)及側(cè)腦室注射KA后4 h、8 h、16 h、24 h、3 d組(KA 4 h、8 h、16 h、24 h、3 d組)，各實驗組6～12只大鼠，分別用于Western Blot和/或免疫組化染色檢測。實驗2：MAPKs對于MIP-1α/CCR5表達的調(diào)控。大鼠隨機分為PBS+二甲亞砜(DMSO)組、KA+DMSO組、KA+PD98059(ERK1/2抑制劑)組和KA+SB203508(p38MAPK抑制劑)組，每組18只大鼠。在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，分別選取0.5 mmol/L PD98059和1 mmol/L SB203580預(yù)處理KA大鼠。在KA(PBS)側(cè)腦室注射后24 h處死所有大鼠，分別用于之后的Western Blot、免疫組化染色及ELISA。

1.1.2 主要試劑和儀器 兔抗P-ERK1/2和ERK1/2抗體、兔抗P-p38MAPK和p38MAPK抗體、兔抗P-CREB和CREB抗體(美國CST公司)；兔抗P-JNK和JNK抗體、兔抗P-NF-κB/p65和NF-κB/p65抗體、兔抗P-IκBα和IκBα抗體、兔抗P-MAPKAPK-2和MAPKAPK-2抗體(美國bioworlde 公司)；小鼠抗大鼠OX-42單克隆抗體(英國Serotec公司)；小鼠抗大鼠ED-1、GFAP單克隆抗體(美國Abcam 公司)；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz 公司)；生物素標(biāo)記山羊抗小鼠或兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG(北京中杉生物技術(shù)公司)；AMCA標(biāo)記的山羊抗兔IgG、FICT標(biāo)記的山羊抗兔IgG、Texas Red 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(美國Vector Laboratories)。鼠腦立體定向儀(西安西北光電儀器廠)；Leica CMl900恒冷切片機、ST5010型HE 自動染色機、封片機(德國Leica 公司)；紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；BL-420生物數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)(成都泰盟生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立癲癇模型及側(cè)腦室給藥 參考大鼠大腦定位立體圖譜及相關(guān)文獻[5-6]，側(cè)腦室注射的穿刺坐標(biāo)定位：前囟后0.6 mm，旁開1.2 mm，深度2.5 mm。將2 nmol KA(2 nmol/μl)以0.2 μl/min速度緩慢注入大鼠側(cè)腦室，建立幼鼠驚厥模型[7]。與KA注射的坐標(biāo)一致，取其對側(cè)進行干預(yù)性藥物注射，PD98059、SB203508或DMSO于PBS或KA注射前30 min側(cè)腦室注射。

1.2.2 組織切片和標(biāo)本的制備 水合氯醛(10%，400 mg/kg)腹腔麻醉、多聚甲醛(4%)主動脈灌注，解剖取腦組織。多聚甲醛固定，梯度酒精脫水、透明、包埋、切片，按照順序每隔20張取6張為一組，每組取一張成一套，每套約8～10張，切片烤干備用。

1.2.3 Western Blot 稱重海馬組織，加入蛋白裂解液，研磨，離心，取上清，-80℃保存；溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定各樣本蛋白濃度。樣品SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗的封閉雜交、顯影，數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描，以蛋白條帶光密度值計算海馬內(nèi)MAPKs的磷酸化、非磷酸化蛋白水平及CCR5的表達。一抗P-ERK1/2、ERK1/2、P-p38MAPK、p38MAPK、P-JNK、JNK、P-MAPKAPK和MAPKAPK-2的稀釋比例均為1∶100，CCR5的稀釋比例為1∶250，β-actin的稀釋比例為1∶5000；二抗為稀釋比例為1∶5000的HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG或稀釋比例為1∶5000～1∶15000的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG。

1.2.4 ELISA 依據(jù)Western Blot 中海馬組織蛋白提取及測定方法，完成各樣本蛋白濃度測定；按照試劑盒說明配制相關(guān)工作液，按照既定步驟完成MIP-1α濃度監(jiān)測。

1.2.5 酶標(biāo)法免疫組化 切片復(fù)溫、晾干，PBS液沖洗，3%過氧化氫處理，5%BSA/10%兔血清工作液封閉(室溫孵育1h)，先后滴加一抗(1∶100 P-ERK1/2、1∶100 P-p38MAPK或1∶100 OX-42)、二抗(生物素標(biāo)記山羊抗小鼠或兔IgG)、三抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素)處理，沖洗，DAB顯色、復(fù)染、脫水、封片，鏡下觀察。

1.2.6 免疫熒光雙重標(biāo)記技術(shù) 切片復(fù)溫、晾干，0.1% Triton-X 100 PBS液漂洗3次，5%BSA/5%正常驢血清工作液封閉孵育1 h，用1∶100 P-ERK1/2或1∶100 P-p38MAPK，分別與1∶100 ED-1和1∶100 GFAP共同孵育(4℃過夜)，二抗37℃避光1 h(1∶500 AMCA標(biāo)記的山羊抗兔IgG和1∶500 Texas Red標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG)，PBS沖洗，DAPI 染核，抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.7 細胞計數(shù)分析 每個標(biāo)本選取6張片， 200倍視野下采用雙盲法對相應(yīng)海馬亞區(qū)進行計數(shù)分析。每張切片的每個海馬區(qū)于2個不同視野下分別計數(shù)2次，然后取平均值；觀察CA3和CA1區(qū)時，以錐體細胞層為中心計數(shù)。每張片隨機選取6個視野，取其平均值，計數(shù)海馬內(nèi)OX-42的陽性細胞。在熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記的細胞。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠海馬組織中MAPKs蛋白水平的比較

見表1。與空白對照組比較，KA 4 h、8 h、16 h、24 h、3 d組P-ERK1/2水平明顯增高；KA 8 h、16 h、24 h、3 d組P-P38MAPK水平明顯增高(均P<0.05)。

2.2 KA組大鼠海馬組織中P-ERK1/2表達的分布

見圖1。KA 8 h組CA3區(qū)的錐體細胞層和門區(qū)可見少量棕黃色顆粒，體積偏大，成神經(jīng)元狀態(tài)，整個海馬區(qū)(CA1錐體細胞層、顆粒細胞層除外)可見明顯深染的陽性顆粒，體積較小。KA 24 h組CA3錐體細胞層和門區(qū)可見呈圓形或橢圓形的大量陽性染色顆粒，可能為膠質(zhì)細胞。KA 3 d整個海馬組織陽性染色顆粒明顯減少，主要分布于CA3、CA1的椎體細胞層和海馬門區(qū)，海馬裂附近也見少許陽性顆粒。

表1 各組大鼠海馬組織中MAPKs蛋白水平的比較(x±s)組別P/T-ERK1/2P/T-p38MAPKP/T-JNK空白對照組1.00±0.121.00±0.151.00±0.08KA4h組1.82±0.14*1.20±0.221.00±0.10KA8h組3.25±0.32*2.69±0.43*0.92±0.06KA16h組2.68±0.25*4.44±0.73*0.91±0.07KA24h組1.66±0.20*5.03±1.12*0.90±0.08KA3d組1.20±0.09*6.96±1.04*0.95±0.05PBS對照組0.86±0.090.81±0.120.92±0.08 注:與空白對照組比較*P<0.05

圖1 KA組大鼠海馬組織中P-ERK1/2表達的分布。KA8h：KA 8 h組；KA24h：KA 24 h組；KA3d：KA 3 d組；Hp：海馬；Hilus：齒狀回門區(qū)；CA3：海馬CA3區(qū)；CA1：海馬CA1區(qū)(高倍圖片標(biāo)尺50 μm，低倍圖片標(biāo)尺200 μm)

2.3 KA組大鼠海馬組織中P-p38MAPK表達的分布 見圖2。KA 8 h組可見少量染色淺的棕黃色顆粒，主要集中在海馬裂及海馬槽周圍。KA 24 h組整個海馬組織內(nèi)可見染色較深的陽性顆粒，以神經(jīng)元損傷明顯的CA3區(qū)、齒狀回門較為明顯。KA 3 d組海馬組織中見較多陽性染色顆粒，呈現(xiàn)顯著表達，主要集中在CA1區(qū)錐體細胞層，可見較多深染顆粒。

2.4 KA組大鼠P-ERK1/2和P-p38MAPK膠質(zhì)細胞來源的探究 見圖3。免疫熒光雙重標(biāo)記結(jié)果顯示，在GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細胞和ED-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細胞內(nèi)均可見P-ERK1/2陽性染色顆粒。與之相比，在GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細胞中未見P-P38MAPK陽性顆粒，而在ED-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細胞可見明顯陽性顆粒分布。

圖2 KA組大鼠海馬組織中P-p38MAPK表達的分布。KA8h：KA 8 h組；KA24h：KA 24 h組；KA3d：KA 3 d組；Hp：海馬；Hilus：齒狀回門區(qū)；CA3：海馬CA3區(qū)；CA1：海馬CA1區(qū)(高倍圖片標(biāo)尺50 μm，低倍圖片標(biāo)尺200 μm)

圖3 免疫熒光雙重標(biāo)記檢測P-p38MAPK 和P-ERK1/2 表達的膠質(zhì)細胞來源。A 和B： P-p38MAPK(藍光)分布于ED-1 標(biāo)記的小膠質(zhì)細胞(A 紅光)而不能表達于GFAP 標(biāo)記的星形膠質(zhì)細胞(B 紅光)；C 和D：P-ERK1/2(藍光)在小膠質(zhì)細胞(C)和星形膠質(zhì)細胞(D)均有表達(實線箭頭指示共分布的細胞，虛線箭頭指示非共分布細胞)

2.5 各組大鼠海馬組織中MIP-1α、CCR5蛋白水平和OX-42陽性細胞數(shù)的比較 見表2。與PBS+DMSO組比較，KA+DMSO組、KA+PD98059組和KA+SB203508組大鼠海馬組織中MIP-1α、CCR5蛋白水平均明顯增高，OX-42陽性細胞數(shù)明顯增加(均P<0.05)。與KA+DMSO組比較，KA+PD98059組、KA+SB203508組大鼠海馬組織中MIP-1α、CCR5蛋白水平均明顯降低，OX-42陽性細胞數(shù)明顯減少(均P<0.05)。

表2 各組大鼠海馬組織中MIP-1α、CCR5蛋白水平和OX-42陽性細胞數(shù)的比較(x±s)組別MIP-1α(pg/mg)CCR5(pg/mg)OX-42陽性細胞數(shù)(個)PBS+DMSO組0.60±0.201.00±0.1229±5KA+DMSO組151.60±41.00*4.80±0.32*68±10*KA+PD98059組81.30±26.50*△2.90±0.39*△52±12*△KA+SB203508組68.50±35.40*△2.13±0.30*△44±12*△ 注:與PBS+DMSO組比較*P<0.05;與KA+DMSO組比較△P<0.05

3 討 論

MAPKs是細胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于真核細胞中，在將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞及其核內(nèi)、引起細胞生物學(xué)反應(yīng)(如細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡)的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在缺氧、缺血、腦外傷及驚厥等神經(jīng)病理條件下，MAPKs迅速被激活，調(diào)控多種細胞因子和炎性介質(zhì)的表達分泌，使多種底物發(fā)生磷酸化反應(yīng)，進一步調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮關(guān)鍵性作用[8]。

MAPKs主要包含3個經(jīng)典的亞家族途徑：ERK1/2(細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶)、P38MAPK(p38絲裂原活化蛋白激酶)和c-JNK(c-Jun 氨基末端激酶)，能夠在興奮毒性腦損傷的病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，本研究在探討MAPKs與MIP-1α/CCR5軸的潛在聯(lián)系之前，首先研究了MAPKs三個主要途徑在海馬組織中各自的表達特點。既往研究多集中在損傷早期、短暫的觀察時間窗內(nèi)，或者是驚厥模型中：Jeon 等[9]發(fā)現(xiàn)，在KA注射后，P-ERK1/2蛋白水平出現(xiàn)明顯增高，尤其在3 h后持續(xù)保持在較高水平，相對應(yīng)的P-p38MAPK和P-JNK在出現(xiàn)短暫升高后迅速下降至基礎(chǔ)水平(KA后2 h左右)。腦損傷相對長時間的研究[10]發(fā)現(xiàn)，海馬中P-p38MAPK的表達呈現(xiàn)雙時相趨勢。另有動物實驗[11-12]表明，P-p38MAPK在缺血性腦損傷后能夠即刻表達，在第二時相，即缺血后1～3 d，其分布多見于損傷區(qū)的小膠質(zhì)細胞。這與本研究結(jié)果相一致，在建立驚厥模型后短時間內(nèi)(8 h～3 d)，海馬損傷區(qū)內(nèi)P-ERK1/2和P-p38MAPK的表達出現(xiàn)明顯升高，但是P-JNK蛋白水平在KA注射后的表達未見明顯差異，結(jié)合先前相關(guān)研究分析，可能與該實驗選擇的觀察時間窗有關(guān)，尚需進一步分析。本研究結(jié)果顯示，KA注射后P-ERK1/2和P-p38MAPK蛋白水平之間的變化趨勢、顯著表達時間及表達高峰等存在一定差異；且二者在齒狀回門區(qū)和錐體細胞層等神經(jīng)元損傷明顯的海馬組織中均呈現(xiàn)顯著增高的表達，從而進一步提示MAPKs通路在癲癇形成(驚厥發(fā)生)過程中發(fā)揮著重要的生物調(diào)控作用。本研究中免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，部分P-ERK1/2在KA后24 h來源于活化的小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞，而P-p38MAPK僅在小膠質(zhì)細胞中出現(xiàn)免疫活性表達。結(jié)合前期研究[2]結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，P-ERK1/2、P-p38MAPK在很大程度上與MIP-1α、CCR5的免疫活性變化及分布相一致，從而進一步提示 MAPKs可能調(diào)控MIP-1α/CCR5誘導(dǎo)性表達。

事實上，多個體外研究結(jié)果[3-4,13]亦支持上述推測。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，S100B和新型隱球菌免疫復(fù)合物能夠分別參與調(diào)控MAPKs、NF-κB、AP-1和ERK1/2、NF-κB信號通路，從而誘導(dǎo)趨化因子MIP-1α的表達。人單核巨噬細胞系研究[4,13]已經(jīng)證實，多種外源性刺激因素能夠誘導(dǎo)MIP-1α等多種趨化因子及其受體表達，且ERK1/2、p38MAPK信號通路在其中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，側(cè)腦室內(nèi)ERK1/2、p38MAPK抑制劑的干預(yù)性治療能夠阻斷相應(yīng)的信號通路，從而進一步抑制KA 誘導(dǎo)的MIP-1α/CCR5的表達上調(diào)和活化小膠質(zhì)細胞的聚集。到目前為止，這是第一個關(guān)于驚厥模型中MAPKs調(diào)控MIP-1α/CCR5生物軸表達的體內(nèi)研究，而研究結(jié)果也暗示了MAPKs至少能夠在一定程度上調(diào)控MIP-1α/CCR5軸的表達，從而在癲癇形成的病理過程中發(fā)揮重要作用。

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Express characteristics of mitogen-actived protein kinases at hippocampus in immature rats with epilepsy and its influence on the expression of macrophage inflammatory protein-1α/chemokine receptor 5 axis

WANGJing-ru,ZHUXiao-bo,MAYu,etal.

DepartmentofPediatrics,theSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China

Objective To investigate the express characteristics of mitogen-actived protein kinases (MAPKs) at hippocampus in immature rats with epilepsy and its influence on the expression of macrophage inflammatory protein-1α (MIP-1α)/chemokine receptor 5 (CCR5) axis.Methods Seizures were induced by intracerebroventricular injection of Kainic acid (KA) with stereotaxic apparatus. Wistar rats (bron 21 d) were randomly divided into blank control group, phosphate buffer (PBS) control group and KA 4 h, 8 h, 16 h, 24 h, 3 d groups. The differences of MAPKs in hippocampus among these groups were compared. Wistar rats (bron 21 d) were divided into PBS+dimethyl sulfoxide (DMSO) group, KA+DMSO group, KA+PD98059 (ERK1/2 inhibitor) group and KA+SB203508 (p38MAPK inhibitor) group. The effects of MAPKs on the expression of MIP-1α/CCR5 in hippocampus were detected. Western Blot was used to detect the level of MAPKs and CCR5 protein in each group. ELISA was used to quantify the MIP-1α protein in each group. Immunohistochemistry was performed to examine the expression of P-ERK1/2 and P-p38MAPK in each group. Results Compared with blank control group, the levels of P-ERK1/2 in KA 4 h, 8 h, 16 h, 24 h and 3 d groups were significantly increased, and the levels of P-P38MAPK in KA 8 h, 16 h, 24 h and 3 d groups were significantly increased (allP<0.05). After KA treatment, the experssion of P-ERK 1/2 and P-P38MAPK in rats were mainly distributed in the hilus of the dentate gyrus and the pyramidal cell layer,obviously damaged in hippocampus. After KA treatment, part of P-ERK1/2 was derived from activated microglia and astrocytes, while P-p38MAPK only showed the immunoreactivity in microglia. Compared with PBS+DMSO group, the levels of MIP-1, CCR5 and the number of OX-42 positive cells in hippocampus of KA+DMSO group, KA+PD98059 group and KA+SB203508 group were significantly increased (allP<0.05). Compared with KA+DMSO group, the levels of MIP-1, CCR5 and the number of OX-42 positive cells in hippocampus of KA+PD98059 group and KA+SB203508 group were significantly decreased (allP<0.05).Conclusion The MAPKs (ERK1/2 and p38MAPK) can partly regulate and control the expression of MIP-1α/CCR5 axis in the early stage of epileptogenesis.

immature rats;epileptogenesis;mitogen-actived protein kinases;macrophage inflammatory protein-1α;chemokine receptor 5

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2014WSO154)

250033濟南，山東大學(xué)第二醫(yī)院兒內(nèi)科

王一彪

R742.1

A

1004-1648(2017)02-0124-06

2016-08-08

2016-09-02)