李盼，閆麗君，張曦，盤婷，何艷陽，文作瑞，劉煒，孫偉

（海南師范大學 化學與化工學院,海南 ?？?571158）

納米鈀/石墨烯-辣根過氧化物酶修飾電極的制備與性能

李盼，閆麗君，張曦，盤婷，何艷陽，文作瑞，劉煒，孫偉*

（海南師范大學 化學與化工學院,海南 ?？?571158）

以離子液體修飾碳糊電極（CILE）作為基底電極，將納米鈀-石墨烯（Pd-GR）復(fù)合材料和辣根過氧化物酶（HRP）分層涂布在電極上后用Nafion膜固定，制備了修飾電極（Nafion/HRP/ Pd-GR/CILE）.光譜法證明HRP在膜中結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化.循環(huán)伏安掃描出現(xiàn)一對峰形良好的電化學氧化還原峰，表明HRP與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移得以實現(xiàn)，Pd-GR復(fù)合材料的高導(dǎo)電性有利于加快電子傳遞速率.該HRP修飾電極對三氯乙酸的電催化還原有較好的效果.

納米鈀-石墨烯復(fù)合材料；辣根過氧化物酶；直接電化學；電催化還原

氧化還原蛋白質(zhì)和酶的電化學行為研究常用于作為其生物功能的模型，但是由于其電活性中心常被包埋在多肽結(jié)構(gòu)之中而難以傳遞電子，因此修飾電極常被用作工作電極來提高電極表面蛋白質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移速率[1-2].辣根過氧化物酶（HRP）是一種常用的生物酶，由于其極易被提取和純化，已被廣泛應(yīng)用于酶的物理化學性質(zhì)研究，并用于推導(dǎo)此類酶在生命體系中的電化學與氧化還原性質(zhì)[3-4].

離子液體被廣泛應(yīng)用于電化學與化學修飾電極[5]，常用的離子液體有吡啶類和咪唑類等，具有化學穩(wěn)定性高、導(dǎo)電性好、電化學窗口寬等優(yōu)點[6].鈕智剛等合成一種新型的胺基化咪唑類離子液體[7].李靜等將電沉積鉍膜和離子液體修飾電極應(yīng)用于痕量鉛離子的測定[8].

石墨烯是一種具有單原子層結(jié)構(gòu)的新型碳材料，具有表面積大、導(dǎo)電性好、易于功能化和修飾等特點，已經(jīng)成為電分析化學研究的熱點[9].金屬鈀是一種性能優(yōu)良的催化劑，Malekia等將鈀納米粒子修飾在碳離子液體電極（CILE）上形成Pd/CILE[10]，并用于電催化氧化肼，表現(xiàn)出良好的電催化活性.石墨烯具有大的比表面積，有利于負載尺寸小、分散度高的鈀納米顆粒，所形成的復(fù)合材料具有較好的電催化活性[11].胡忠良等人用插層還原法制備了納米鈀/石墨烯復(fù)合材料[12].郭盼等人研究了石墨烯/鈀復(fù)合材料對乙醇的電催化氧化[13].

本文制備了鈀-石墨烯（Pd-GR）復(fù)合材料修飾電極，對HRP的直接電化學行為進行了研究，通過掃描電鏡表征了復(fù)合材料形貌，紫外可見光譜和傅里葉變換紅外光譜研究了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，實驗結(jié)果表明Pd-GR復(fù)合材料具有良好的生物相容性，其在電極表面的存在有效地促進HRP的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

石墨粉（上海膠體化工廠，顆粒度≤30 μm）；1-己基吡啶六氟磷酸鹽（HPPF6，蘭州雨陸精細化工有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP，上海雪滿生物科技有限公司）；Pd-GR納米復(fù)合材料（南京先豐納米材料公司）；三氯乙酸（TCA，國藥集團化學試劑公司）；0.1 mol/L PBS緩沖液；其它試劑為分析純.實驗所需儀器及廠家如表1所示.

1.1.2 儀器

電化學分析儀（CHI 660D型，上海辰華儀器公司），三電極體系：工作電極為Nafion/HRP/Pd-GR/CILE，參比電極為飽和甘汞電極（SCE），輔助電極為鉑電極；掃描電子顯微鏡（SEM，JSM-7100F型，日本電子公司）；傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet6700，美國賽默飛世爾科技公司）；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901型，北京普析通用儀器責任有限公司）.

1.2 電極的制備

將1.6 g石墨粉和0.8 g HPPF6在研缽中充分研磨后填入潔凈的電極管（Φ=4 cm）中，并以銅絲為導(dǎo)線，即可得到CILE[8].將8 μL 0.5 mg/mL Pd-GR復(fù)合材料懸濁液均勻涂到CILE表面，室溫干燥后將8 μL 15.0 mg/ mL HRP溶液均勻涂到Pd-GR/CILE的表面，室溫干燥.最后將5.0 μL 0.5%Nafion溶液滴到電極表面干燥得到Nafion/HRP/Pd-GR/CILE.

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM圖分析

用SEM表征CILE和Pd-GR/CILE的表面情況.從圖1可以看出，CILE（a）表面較為光滑，表明離子液體與石墨粉充分粘合在一起.而Pd-GR/CILE（圖片b）上出現(xiàn)了典型的GR的片層多孔的疏松結(jié)構(gòu)，并有一定程度的團聚，納米Pd均勻分布在GR表面，有效增加其比表面積，為HRP的進一步固定化提供良好界面.

2.2 紫外可見吸收光譜圖分析

紫外可見吸收光譜中Soret吸收帶的位置可作為研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的常用手段[14].圖2是HRP（曲線a）和Pd-GR-HRP混合液（曲線b）的紫外可見吸收光譜圖，其Soret吸收帶均在403 nm出現(xiàn)，表明HRP與Pd-GR復(fù)合材料混合后仍然保持原有的構(gòu)象，沒有發(fā)生結(jié)構(gòu)變化.

2.3 紅外光譜圖分析

紅外光譜也可用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的酰胺I（1700～1600 cm-1）和酰胺Ⅱ（1620～1500 cm-1）吸收帶的變化可以說明其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[15].如圖3所示，HRP的酰胺I和II吸收帶為1652 cm-1和1542 cm-（1圖a），而HRP-Pd-GR混合物吸收帶在1642 cm-1和1548 cm-（1圖b）.從紅外光譜圖的相似性可以認為HRP在Pd-GR復(fù)合材料中基本保持其原有構(gòu)象.

圖1 (a)CILE和(b)Pd-GR/CILE的SEM圖Fig.1SEM images of(a)CILE and(b)Pd-GR/CILE

圖2 (a)HRP水溶液和(b)HRP-Pd-GR混合液的紫外可見吸收光譜圖Fig.2UV-Vis spectra of(a)HRP and (b)HRP-Pd-GR solution

圖3 (a)HRP和(b)HRP-Pd-GR的紅外光譜圖Fig.3FT-IR spectra of(a)HRP and(b)HRP-Pd-GR

2.4 電化學交流阻抗譜圖分析

EIS實驗結(jié)果常被用作判斷不同修飾電極表面的電子傳遞動力學依據(jù).圖4展示了不同修飾電極的交流阻抗圖，在CILE上的Ret值為66.9 Ω（曲線c），Nafion/CILE的Ret值增大為83.1 Ω（曲線d），表明Nafion的存在會阻礙鐵氰化鉀電對的電子轉(zhuǎn)移.而Nafion/Pd-GR/CILE的Ret值降為最小值33.3 Ω（曲線a），說明Pd-GR復(fù)合材料具有良好的導(dǎo)電性從而降低界面電阻.而Nafion/HRP/Pd-GR/CILE（曲線b）和Nafion/HRP/CILE（曲線e）的Ret值為48.2 Ω和92.8 Ω，說明HRP已被成功固定在電極表面，它的存在增大了界面電阻.

2.5 HRP的直接電化學研究

圖5為不同修飾電極在pH 3.0 PBS中的循環(huán)伏安掃描圖.在電位掃描范圍內(nèi)CILE（曲線a），Nafion/CILE（曲線b）和Nafion/Pd-GR/CILE（曲線c）上沒有電化學響應(yīng)，表明電極表面沒有電活性物質(zhì).在Nafion/HRP/ CILE（曲線d）上出現(xiàn)一對氧化還原峰，為HRP結(jié)構(gòu)中血紅素輔基Fe（III）/Fe（II）的特征峰.而在Nafion/HRP/ Pd-GR/CILE（曲線e）上氧化還原峰電流顯著增加，這是由于Pd-GR復(fù)合材料具有良好的生物相容性，高導(dǎo)電性和較大的比表面積，可以固定更多的HRP并加速電子轉(zhuǎn)移速率，因此使電化學信號增大.從曲線e上可以讀出峰電位值分別為Epc=-0.190 V和Epa=-0.129 V，峰電位差（△Ep）為61 mV.

2.6 掃速的影響

圖6展示了掃速對Nafion/HRP/Pd-GR/CILE氧化還原峰的影響.在pH 3.0的PBS中，掃速在100～700 mV/s時，峰電流與掃速成正比，線性方程為Ipc（μA）=167.58 υ（V/s）+0.87 υ（γ=0.995）和Ipa（μA）=-138.20 υ（V/s）-3.53（γ=0.995），表明電極反應(yīng)為薄層電化學行為.由方程Q=nAFΓ*求出電活性物質(zhì)的表面濃度（Γ*）為8.93×10-10mol/cm2.峰電位差也隨掃速的增加逐漸增大，但式電位相對穩(wěn)定.氧化還原峰電位Ep與ln υ之間的線性回歸方程為Epc（V）=-0.059 ln υ（V/s）-0.241（γ=0.992）和Epa（V）=0.042 ln υ（V/s）-0.106（γ=0.996）.根據(jù)Laviron理論[16]，進而求得電子傳遞系數(shù)（α）為0.41和電極反應(yīng)速率常數(shù)（ks）為0.25 s-1.表明電極表面Pd-GR復(fù)合材料的存在為HRP的電子轉(zhuǎn)移提供了一個良好的媒介，可以加快電子轉(zhuǎn)移速率.

圖4 不同修飾電極(a)Nafion/Pd-GR/CILE,(b)Nafion/ HRP/Pd-GR/CILE,(c)CILE,(d)Nafion/CILE and(e) Nafion/HRP/CILE的交流阻抗譜圖Fig.4 EIS of different electrodes.(a)Nafion/Pd-GR/ CILE,(b)Nafion/HRP/Pd-GR/CILE,(c)CILE,(d)Na?fion/CILE and(e)Nafion/HRP/CILE

圖5 不同修飾電極(a)CILE,(b)Nafion/CILE,(c)Nafion/ Pd-GR/CILE,(d)Nafion/HRP/CILE and(e)Nafion/HRP/ Pd-GR/CILE的循環(huán)伏安圖（掃速為100 mV/s）Fig.5 Cyclic voltammograms of(a)CILE,(b)Nafion/ CILE,(c)Nafion/Pd-GR/CILE,(d)Nafion/HRP/CILE and (e)Nafion/HRP/Pd-GR/CILE(scan rate：100 mV/s)

圖6 (A)不同掃速下的循環(huán)伏安圖，a到m分別為100,150,200,250,300,350,400,450,500,550, 600,650,700 mV s-1；(B)氧化還原峰電流與掃速的關(guān)系曲線；(C)氧化還原峰電位與lnv的關(guān)系曲線Fig.6 (A)Influence of scan rate on electrochemical responses of CTS/HRP/Pd-GR/CILE in pH 3.0 PBS,scan rate(a→m):100,150,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700 mV s-1;(B) Linear relationship of Ip vs.υ;(C)Linear relationship of Ep vs.lnυ

2.7 緩沖溶液pH值的影響

圖7為Nafion/HRP/Pd-GR/CILE在不同pH PBS中的電化學行為.當pH在2.0～9.0范圍內(nèi)時氧化還原峰電位隨著溶液pH值增大均發(fā)生負移，且式電位（E0′）與pH值呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為E0′（V）=-0.043 pH-0.050（γ=0.946），表明電極反應(yīng)有質(zhì)子參加.

2.8 電催化行為研究

HRP修飾電極可以對穩(wěn)定性極強的有機鹵化物進行電催化還原.本文研究了Nafion/HRP/Pd-GR/CILE對TCA的電催化還原作用，循環(huán)伏安掃描結(jié)果如圖8所示.隨著TCA濃度的增加，在-0.21 V出現(xiàn)一個新的電催化還原峰.還原峰電流與TCA的濃度在2.0～45.0 mmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，方程為Iss（μA）=3.16 C（mmol/L）+11.57(γ=0.992），檢測限為0.69 mmol/L（3σ）.當TCA濃度大于45.0 mmol/L后還原峰電流保持不變，為Michaelis-Menten反應(yīng)過程.由Lineweaver-Burk方程[17]，根據(jù)（1/Iss～1/[TCA]）可求出電催化反應(yīng)的表觀米式常數(shù)KMapp為3.37 mmol/L.結(jié)果表明，具有良好的生物相容性和高導(dǎo)電性的Pd-GR復(fù)合材料可以作為電催化反應(yīng)的良好媒介.

圖7 Nafion/HRP/Pd-GR/CILE在不同pH緩沖液的循環(huán)伏安圖（a到h 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，掃速為100 mV/sFig.7 Cyclic voltammograms of Nafion/HR/Pd-GR/ CILE in different pH(form a to h:2.0,3.0,4.0,5.0,6.0, 7.0,8.0,9.0)with scan rate as 100 mV/s

圖8 修飾電極在不同濃度TCA下的循環(huán)伏安圖(a到j(luò)為2、4、6、10、20、25、30、35、40、45.0 mmol/L)(插圖：還原峰電流與濃度的線性關(guān)系)Fig.8 Cyclic voltammograms of HRP modified electrode with 2,4,6,10,20,25,30,35,40,45 mmol/L TCA(curves a to j)in pH 3.0 PBS,scan rate:100 mV/s(inset was the linear curve of peak currents with TCA concentration)

2.9 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

Nafion/HRP/Pd-GR/CILE在pH 3.0 PBS中連續(xù)掃描50圈，循環(huán)伏安結(jié)果表明其氧化還原峰電流沒有明顯的變化.將修飾電極放置在4℃冰箱內(nèi)保存4周后，進行電化學檢測，電流值為初始值的92.3%，說明該電極有很好的穩(wěn)定性.同一根電極對5.0 mmol/L的TCA溶液進行7次平行測定，相對標準偏差（RSD）為2.7%.將平行制備的6根修飾電極進行循環(huán)伏安掃描得到的RSD為3.9%，表明制備的Nafion/HRP/Pd-GR/CILE具有良好的重現(xiàn)性.

3 結(jié)論

將Pd-GR納米復(fù)合材料和HRP分層滴涂在CILE上后用Nafion固定，制備了一種新型修飾電極Nafion/ HRP/Pd-GR/CILE.Pd-GR復(fù)合材料具有優(yōu)良的導(dǎo)電性和生物相容性，促進HRP在修飾電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移.在pH 3.0 PBS中出現(xiàn)了一對峰形良好的氧化還原峰，對該氧化還原峰進行了詳細的研究.Pd-GR納米復(fù)合材料有較大的比表面積，可以用于固定HRP，其良好的導(dǎo)電性為HRP的電子轉(zhuǎn)移提供快速通道，加快電子轉(zhuǎn)移速率.該HRP修飾電極對TCA電催化還原表現(xiàn)出良好的效果.

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責任編輯：劉 紅

Preparation of Palladium/Graphene Nanocomposite and Horseradish Peroxidase Modified Electrode and Its Performances

LI Pan，YAN Lijun，ZHANG Xi，PAN Ting，HE Yanyang，WEN Zuorui，LIU Wei，SUN Wei＊
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou571158，China）

By using carbon ionic liquid electrode（CILE）as the basic electrode,platinum/graphene（Pd-GR）nanocom?posite and horseradish peroxidase（HRP）was modified on the electrode surface step by step by coating method,and fur?ther fixed by Nafion to prepare Nafion/HRP/Pd-GR/CILE.Spectroscopic studies showed that HRP maintained the native structure in composite film without denaturation.Electrochemical behavior of HRP was investigated in PBS（pH 3.0）with a pair of good-shape quasi-reversible peaks appeared,showing that electrochemistry of HRP was realized.The presence of high conductive Pd-GR nanocomposite could accelerate the electron transfer rate of HRP with CILE.Electrocatalytic re?sults demonstrated this HRP electrode had excellent catalytic property to trichloroacetic acid reduction.

palladium-graphene nanocomposite；horseradish peroxidase；direct electrochemistry；electrocatalytic reduc?tion

O 646；Q 554.6

A

1674-4942（2017）01-0034-06

2016-11-17

海南省自然科學基金（20162031）；海南省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201511658024）

*通訊作者：孫偉，教授，E-mail：swyy26@hotmail.com

10.12051/j.issn.1674-4942.2017.01.007