謝 慧，閆麗君，張國平，董瑞霞，何博琳，王子勻，榮翠林，劉 煒，孫 偉

（海南師范大學 化學與化工學院，海南 ?？?571158）

基于石墨烯-TiO2復合材料的蛋白質電化學傳感器的研究

謝 慧，閆麗君，張國平，董瑞霞，何博琳，王子勻，榮翠林，劉 煒，孫 偉*

（海南師范大學 化學與化工學院，海南 海口 571158）

采用層層涂布法把石墨烯-二氧化鈦（GR-TiO2）復合材料、血紅蛋白（Hb）和Nafion滴涂在固體電極表面制備出相應的蛋白質電化學傳感器.為了證明Hb與復合材料混合后其原始構象基本不變，采用光譜技術進行表征.利用循環(huán)伏安掃描在Hb修飾電極上出現(xiàn)一對良好對稱峰形的準可逆氧化還原峰，表明電活性的Hb發(fā)生反應.同時利用此方法求解了電化學參數(shù)如電子傳遞系數(shù)和異相電極反應速率常數(shù)，考察了該電化學傳感器對三氯乙酸的電催化行為.

血紅蛋白；離子液體；石墨烯-二氧化鈦復合材料；電化學傳感器

離子液體是一種具有特殊性能的有機化合物，其結構完全由離子組成，表現(xiàn)出很高的離子導電性.同時它具有較寬的電化學窗口范圍、較好的穩(wěn)定性、良好的生物相容性、不易揮發(fā)、溶解性好等優(yōu)良性質，在電化學分析中得到了廣泛的應用[1].

石墨烯（GR）是由單層的碳原子緊密堆積成的二維納米片，具有電導率高和比表面積大等優(yōu)點，在電化學和電化學分析方面均有綜述報道[2].石墨烯納米片是良好的平面載體，可以負載其它多種材料從而構建復合材料，發(fā)揮各組分之間協(xié)同作用[3].二氧化鈦（TiO2）微粒具有良好的生物相容性、較高的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性、高比表面積、易分散、易燒結和低熔點等獨特性能，在材料化學和電化學中應用廣泛[4-5].近年來已有多種合成GR-TiO2復合材料的方法報道并且被廣泛應用在生物傳感器、超級電容器、光電化學等不同領域[6-9].

本文以離子液體修飾碳糊電極為基底電極（CILE），利用層層涂布法將GR-TiO2復合材料、Hb和Nafion滴涂固定在基底電極表面制得修飾電極（Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE）.此蛋白質修飾電極綜合了離子液體和GR-TiO2的優(yōu)點，形成一個比表面積大和導電性好的傳感界面，血紅蛋白（Hb）在該界面上能得到良好的固定并且保持其原有的二級結構與生物活性.該修飾電極界面表現(xiàn)出較大的比表面積和較高的導電性，有利于Hb的固定和電子轉移反應的進行，所制備的蛋白質電化學傳感器對三氯乙酸（TCA）表現(xiàn)出較好的電催化還原效應.

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

1.1.1 試劑

Hb（MW64500，美國Sigma公司）；離子液體（HPPF6，蘭州雨陸精細化工公司）；光譜純石墨粉（上海膠體化工有限公司）；石墨烯-二氧化鈦納米復合材料（GR-TiO2）由實驗室合成；TCA（天津科密歐化學試劑公司）；Nafion（0.5%乙醇溶液）；0.1 mol/L磷酸鹽系列緩沖溶液（PBS）為支持電解質.實驗所需儀器及廠家如表1所示.

1.1.2 儀器

電化學分析儀（CHI 660D型，上海辰華儀器公司），三電極體系：工作電極為Nafion/HRP/Pd-GR/CILE，參比電極為飽和甘汞電極（SCE），輔助電極為鉑電極；掃描電子顯微鏡（SEM，JSM-7100F型，日本電子公司）；傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet6700，美國賽默飛世爾科技公司）；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901型，北京普析通用儀器責任有限公司）.

1.2 電極的制備

按照文獻[10]制備CILE，以CILE為基底電極，采用滴涂法將6 μL 0.5 mg/mL的GR-TiO2分散液均勻涂布在CILE表面，室溫晾干后繼續(xù)滴涂6 μL 15.0 mg/mL Hb水溶液，晾干后滴涂8 μL Nafion溶液，自然晾干后即制得所需的工作電極.

1.3 實驗方法

利用紫外-可見吸收光譜和傅立葉變換紅外光譜檢測蛋白質是否變性.用循環(huán)伏安掃描考察Hb的直接電化學行為.在測試前需利用通N2除氧30 min來除去支持電解質中的溶解氧，并在測試中保持N2氣.

2 結果與討論

2.1 光譜圖分析

圖1 （A）Hb在水中（a）和GR-TiO2混合液（b）中的紫外可見光譜圖;（B）（a）Hb和（b）Hb-GR-TiO2復合材料的紅外光譜圖Fig.1(A)UV-Vis spectra of(a)Hb and(b)Hb-GR-TiO2mixture;(B)FT-IR spectra of(a)Hb and(b)Hb-GR-TiO2

紫外可見吸收光譜法是研究蛋白質構象變化的常用手段，Hb的結構變化可以觀察Fe(Ⅲ)的Soret吸收帶的變化[11].Hb在水和GR-TiO2混合液中的紫外可見吸收結果如圖1A所示.Hb水溶液的最大吸收波長為414 nm（曲線a），與在GR-TiO2混合液中的吸收波長410 nm（曲線b）基本相同，表明Hb在GR-TiO2混合液中仍能良好地保持其原始構象.

紅外光譜也常用于研究蛋白質的結構，因為肽鏈骨架的C=O伸縮振動與蛋白質結構中的酰胺I（1700～ 1600 cm-1）有關，N-H彎曲振動和C-N伸縮振動與蛋白質結構中的酰胺Ⅱ（1620～1500 cm-1）有關，酰胺Ⅰ和Ⅱ特征吸收峰可以反映多肽鏈二級結構的變化[12].Hb及其與GR-TiO2復合材料的紅外吸收結果如圖1 B所示.在GR-TiO2中Hb的特征吸收峰分別位于1645.05 cm-1和1547.54 cm-1（曲線b），與Hb的特征吸收峰1643.32 cm-1和1542.20 cm-1（曲線a）非常接近，可以認為Hb基本保持了其天然構象而沒有發(fā)生變性.

2.2 電化學交流阻抗譜圖分析

圖2為不同修飾電極（a）Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE，（b）Nafion/CILE，（c）CILE和（d）Nafion/Hb/CILE的交流阻抗圖.CILE（曲線c）的阻抗值為70.15 Ω，而Nafion/CILE（曲線b）的阻抗值為119.66 Ω，這是由于不導電的Nafion膜阻礙了鐵氰化鉀向電極表面的擴散.Nafion/Hb/CILE（曲線d）的阻抗值增大到251.28 Ω，這是由于Hb分子進一步阻礙了電子轉移.而Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE（曲線a）的阻抗值降低為23.92 Ω，這是由于GRTiO2復合材料具有高導電性和大表面積，加快了電子轉移，有效地減小電子傳遞電阻.

2.3 Hb的直接電化學行為

通過循環(huán)伏安法研究了在0.1 mol/L pH 3.0 PBS中Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE的電化學行為，結果見圖3（a）.可以發(fā)現(xiàn)一對峰形對稱且準可逆的氧化還原峰，為典型的血紅素蛋白質特征峰，其還原峰電位（Epc）為-0.237 V（vs.SCE），氧化峰電位（Epa）為-0.166 V（vs.SCE），峰電位差（△Ep）為71 mV.根據(jù)公式Eo′=（Epc+Epa）/2，可得Hb的式電位（Eo′）為-0.202 V（vs.SCE），氧化還原峰電流之比接近于1.而在Nafion/ GR-TiO2/CILE（曲線b）和CILE（曲線c）上均無氧化還原峰，說明這對峰是Hb電化學反應產生的，GR-TiO2復合材料的獨特物理化學性質可以為Hb提供一個很好的微環(huán)境，有利于電化學活性中心的電子轉移，加快了反應速率.

圖2 不同修飾電極（a）Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE，（b）Na?fion/CILE，（c）CILE，（d）Nafion/Hb/CILE的交流阻抗圖Fig.2 EIS for Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE(a),Nafion/ CILE(b),CILE(c),Nafion/Hb/CILE(d)Nafion/Hb/CILE

圖3 （a）Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE，（b）Nafion/GR-TiO2/CILE和（c）CILE在pH 3.0的PBS中的循環(huán)伏安圖，掃速為0.1 V/sFig.3 Cyclic voltammograms of(a)Nafion/Hb/GR-TiO2/ CILE,(b)Nafion/GR-TiO2/CILE and(c)CILE in pH 3.0 PBS with scan rate as 0.1 V/s

2.4 掃速的影響

圖4A展示了不同掃速對Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE電化學響應的影響.循環(huán)伏安掃描表明在100～700 mV/s掃速范圍內均出現(xiàn)一對準可逆氧化還原峰，峰電流隨掃速的增加而增大，陽極峰電位和陰極峰電位分別發(fā)生正移和負移，式電位(Eo′)相對穩(wěn)定.由準可逆薄層電化學過程的Laviron理論[13-14]可以計算導出Ep與ln ν的關系，結果如圖4 B所示，根據(jù)公式可計算求得電子轉移數(shù)（n）和異相電極反應電子轉移系數(shù)（α）分別為1.04和0.55，進一步求得電極反應速率常數(shù)（ks）為2.03 s-1，ks值比一些文獻值要高，如GR/Fe3O4/Hb/GCE（0.3 s-1）[15]，Hb-IL-MWCNT-CPE（0.84 s-1）[16]，C60-MWCNT/GCE（0.39 s-1）[17]等，說明GR-TiO2復合材料可以加快Hb的反應速率.

圖4C展示了峰電流（Ip）與掃描速度的關系，其與掃速（ν）呈線性關系，表現(xiàn)出薄層電化學行為.線性回歸方程分別為Ipc（μA）=103.14 ν（V/s）+19.98（n=13，γ=0.998）和Ipa（μA）=-92.28 ν（V/s）–11.2（n=13，γ=-0.998）.由方程Q=n A F г*[18]可計算求得電活性的Hb在電極表面覆蓋度（г*）為1.35×10-9mol/cm2，為Hb總濃度（1.11×10-8mol/cm2）的12.27%.

圖4 （A）Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE不同掃速下的循環(huán)伏安圖（由m到a分別為700，650，600，550，500，450，400，350，300，250，200，150，100 mV/s）；（B）峰電位（Ep）與掃描速度的對數(shù)（ln ν）之間的關系；（C）為氧化峰電流（Ipa）和還原峰電流（Ipc）與掃速（ν）的關系曲線Fig.4 (A)Influence of scan rate on electrochemical responses of Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE with scan rates from m to a as 700,650,600,550,500,450,400,350,300,250,200,150,100 mV/s,respectively;(B)Linear relationship of the re?dox peak potentials versus ln ν;(C)Linear relationship of the redox peak currents versus scan rate(ν)

2.5 pH的影響

圖5展示了不同酸堿度PBS對Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE電化學行為的影響.Hb的氧化還原峰電位均隨著pH值的增大而發(fā)生負移，這是典型的準可逆過程，兩者之間可得一個良好的線性關系，線性方程為Eo′（mV）=-56.83 pH-48.39（γ=0.988）.式電位隨著pH的增大而增加且斜率為-56.83 mV/pH，稍小于25°C條件下可逆體系中的理論值（-59.0 mV/pH），因此Hb在修飾電極上發(fā)生單電子和單質子的反應，方程為Hb Fe (Ⅲ)+H++e→Hb Fe(Ⅱ).

2.6 Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE對TCA的電化學催化

圖6展示了Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE對TCA的電化學催化還原行為.在0.1 mol/L pH 3.0 PBS中加入不同濃度的TCA后循環(huán)伏安掃描，氧化峰電流逐漸減小甚至消失，而還原峰電流在-0.288 V處明顯增大，這是典型的電催化TCA反應現(xiàn)象，說明固定在Nafion/GR-TiO2膜內的Hb保持催化活性，能夠有效地將TCA催化還原.當TCA濃度在0.5～35.0 mmol/L范圍內還原峰電流與TCA濃度之間的線性回歸方程為Ip（μA）=2.49 C（mmol/L）+65.98（n=11，γ=0.965），檢測限為0.207 mmol/L（3 σ）.

2.7 穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

將該修飾電極放置在4℃冰箱中保存兩周后取出，對其進行循環(huán)伏安表征，發(fā)現(xiàn)峰電流值幾乎不變，這表明Hb在Nafion/GR-TiO2復合膜內能穩(wěn)定地保持生物活性和原始構型.為了說明制備修飾電極具有良好的重現(xiàn)性，平行制備四根電極對20.0 mmol/L TCA進行檢測，計算求得相對標準偏差為2.2%.

3 結論

圖5 不同pH緩沖溶液中Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE的循環(huán)伏安圖（a到e分別為3.0、2.0、4.0、5.0、6.0）Fig.5 Cyclic voltammograms of Nafion/Hb/GR-TiO2/ CILE in different pH PBS(from a to e as 3.0,2.0,4.0, 5.0,6.0)

圖6 Nafion/Hb/GR-TiO2/CILE在不同濃度TCA下的循環(huán)伏安圖（a到k TCA濃度分別為0，0.5，1.0，2.5，5.0，11.0，15.0，20.0，25.0，30.0，35.0 mmol/L）Fig.6 Cyclic voltammograms of Nafion/Hb/GR-TiO2/ CILE with 0,0.5,1.0,2.5,5.0,11.0,15.0,20.0,25.0, 30.0,35.0 mmol/L TCA(curve a to k)

運用光譜法和電化學法對Nafion/GR-TiO2復合膜內固定的Hb的結構與性能進行研究.紅外與紫外可見吸收光譜結果表明Hb在Nafion/GR-TiO2膜內沒有發(fā)生變性，保持了原始構型.電化學實驗結果表明GRTiO2的存在極大增加了Hb電活性中心與電極之間的電子轉移，循環(huán)伏安掃描出現(xiàn)一對準可逆的氧化還原峰，說明實現(xiàn)了直接電子轉移，Nafion/GR-TiO2膜中的Hb對TCA表現(xiàn)出良好的電催化行為.

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責任編輯：劉 紅

Electrochemical Protein Sensor Based on Graphene-TiO2Nanocomposite Modified Electrode

XIE Hui，YAN Lijun，ZHANG Guoping，DONG Ruixia，HE Bolin，
WANG Ziyun，RONG Cuilin，LIU Wei，SUN Wei＊
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou571158，China）

In this paper ionic liquid modified carbon paste electrode is used as the basal electrode（CILE）,which is coat?ed with GR-TiO2nanocomposite,hemoglobin（Hb）and Nafion to get an electrochemical protein sensor（Nafion/Hb/GRTiO2/CILE）.Spectroscopic results indicate that Hb almost keeps the original characteristics without denaturation.Cyclic voltammetry is used and on Hb modified electrode a pair of quasi-reversible redox peaks appear,which indicates that Hb is electroactive.Electrochemical parameters such as electron transfer number and heterogenous electron transfer coefficient are calculated.And this electrochemical sensor is applied to the electrocatalytic reduction of trichloroacetic acid.

hemoglobin；ionic liquid；graphene-TiO2nanocomposites；electrochemical sensor

O 646；Q 51

A

1674-4942（2017）01-0028-06

2016-11-17

海南省自然科學基金（20162031）；海南師范大學校級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（cxcyxj2015009）

*通訊作者：孫偉，教授，E-mail：swyy26@hotmail.com

10.12051/j.issn.1674-4942.2017.01.006