羅婷婷，王睿，顧川佳，何平，華允芬

1. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014； 2. 上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，上海 200025

·綜述·

噬菌體治療細(xì)菌性感染及其限制因素

羅婷婷1,2，王睿2，顧川佳2，何平2，華允芬1

1. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014； 2. 上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，上海 200025

近年來，細(xì)菌耐藥性已成為抗感染領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻問題，臨床對一些細(xì)菌性感染疾病束手無策。噬菌體療法是一種通過噬菌體裂解細(xì)菌來治療病原菌感染的治療手段。噬菌體在抗菌領(lǐng)域表現(xiàn)出顯著的優(yōu)越性，成為目前治療細(xì)菌性感染的研究熱點。本文對近年來噬菌體治療動物和人類病原菌感染、限制其臨床應(yīng)用的因素及解決措施進(jìn)行綜述。

細(xì)菌耐藥性；噬菌體；噬菌體療法；細(xì)菌性感染

細(xì)菌耐藥性已成為抗感染領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)，也是全世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛關(guān)注的問題之一。為解決這一問題，科學(xué)家們開始尋找更為有效的對抗耐藥病原菌感染的治療手段，噬菌體這一傳統(tǒng)的抗菌療法重新成為研究者關(guān)注的焦點。

噬菌體療法是一種通過噬菌體裂解細(xì)菌來治療病原菌感染的治療手段。其針對特定的宿主菌，一般不會干擾宿主體內(nèi)其他正常菌群。此外，噬菌體在裂解宿主菌的同時會自我增殖，小劑量給予噬菌體后即可完成噬菌體擴(kuò)增，進(jìn)而達(dá)到治愈目的；其還具有自限性，一旦靶細(xì)菌群被消滅，噬菌體數(shù)量將銳減。在藥物劑量依賴性方面，噬菌體治療優(yōu)于一般的化學(xué)治療，其開發(fā)周期短，成本低，為生物治療耐藥菌感染提供了新思路。

1 噬菌體治療

1.1 噬菌體動物治療

自1917年Félix d’Hérelle發(fā)現(xiàn)噬菌體侵染細(xì)菌現(xiàn)象后，人們開始了噬菌體動物治療的研究。之后，由于技術(shù)限制及抗生素普及應(yīng)用，噬菌體治療相關(guān)研究發(fā)展緩慢。除某些東歐國家，其他國家?guī)缀醴艞壛藢κ删w治療的研究。近幾年來，隨著多重耐藥菌數(shù)量不斷上升，特別是“超級細(xì)菌”的出現(xiàn)，有關(guān)噬菌體動物治療的研究陸續(xù)發(fā)表，展現(xiàn)出噬菌體抗耐藥菌感染的巨大潛力。

革蘭陽性菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)以其高致病性和多重耐藥性成為人類健康的巨大威脅。近年來，利用噬菌體成功治療MRSA所致動物感染的相關(guān)研究陸續(xù)發(fā)表[1-2]。而革蘭陰性菌作為院內(nèi)感染的重要病原體，其逐年上升的感染率和耐藥性給臨床治療帶來極大困難。越來越多的研究證明，噬菌體療法對革蘭陰性菌所致動物感染同樣有效，甚至效果好于抗生素治療。還有研究[3]通過構(gòu)建肺炎克雷伯菌感染小鼠模型，比較5種噬菌體分別作用及聯(lián)合使用的效果，結(jié)果顯示5種噬菌體均能有效降低細(xì)菌數(shù)量，而雞尾酒療法效果最佳，表明多種噬菌體聯(lián)用可更好地對抗多重耐藥菌感染。

噬菌體單獨作用或噬菌體雞尾酒療法均能展現(xiàn)出有效的殺菌能力，其與抗生素聯(lián)用還可恢復(fù)抗生素對宿主菌的敏感性。有研究[4]表明，多重耐藥銅綠假單胞菌通過改變外排泵機(jī)制，在抵抗噬菌體攻擊的同時可導(dǎo)致多種抗生素敏感性增加。此外，噬菌體對細(xì)菌生物膜也具有很好的消除作用。有報道[5]發(fā)現(xiàn)噬菌體與抗生素聯(lián)用可明顯消除MRSA形成的生物膜，還可提高骨感染大鼠的治療效果，這也為解決細(xì)菌生物膜形成所致抗生素治療效果不佳的問題提供了新的思路。

隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，科學(xué)家在治療細(xì)菌性感染的過程中將目光投向噬菌體相關(guān)蛋白。裂解酶是一類噬菌體編碼的細(xì)胞壁水解酶。1959年，F(xiàn)reimer等[6]首次證實噬菌體裂解酶具有殺菌能力。近年來，研究者開始應(yīng)用裂解酶來對抗臨床常見的多重耐藥菌。有研究[7]證明，噬菌體產(chǎn)生的裂解酶CF-301能降低MRSA所致敗血癥小鼠的死亡率，其與抗生素聯(lián)用還可降低耐藥性的產(chǎn)生。另一種噬菌體蛋白——多糖解聚酶也逐漸應(yīng)用于各類抗菌治療中。有研究[8]證實，重組多糖解聚酶制劑可有效消除小鼠體內(nèi)炭疽芽胞桿菌莢膜的形成，防止炭疽相關(guān)癥狀的發(fā)生，從而降低小鼠死亡率。以上研究表明，噬菌體在耐藥菌感染動物實驗中有很好的治療效果，也為臨床上使用噬菌體來對抗多重耐藥菌感染提供了更多的依據(jù)。

1.2 噬菌體治療人類病原菌感染

早在抗生素發(fā)現(xiàn)之前，噬菌體療法曾用于治療人類病原菌感染，并取得了一定成果。20世紀(jì)上半葉，700多篇關(guān)于噬菌體治療人類感染性疾病的研究陸續(xù)發(fā)表[9]。同時，在看到噬菌體治療的無限潛力后，法國、德國、美國等國家開始生產(chǎn)噬菌體制劑來應(yīng)對各類細(xì)菌感染[9]。如今，隨著細(xì)菌耐藥性的不斷上升及噬菌體療法在動物感染模型中獲得大量成功案例的報道，促進(jìn)了噬菌體臨床研究的進(jìn)一步開展。

噬菌體的安全性問題一直是臨床應(yīng)用的前提。大量人體安全性試驗證明噬菌體幾乎不產(chǎn)生任何不良反應(yīng)。在孟加拉國展開的一項隨機(jī)臨床試驗[10]中，研究人員讓患有急性細(xì)菌性腹瀉的兒童服用兩種大腸埃希菌噬菌體試劑，均未產(chǎn)生任何不良反應(yīng)。除口服噬菌體療法的安全性得到驗證外，還有文獻(xiàn)[11]匯總了靜脈注射噬菌體的相關(guān)實驗，同樣表明噬菌體療法具有較高的安全性。此外，在一項由美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗[12]中，研究人員用噬菌體治療銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌造成的慢性下肢靜脈潰瘍，對39例患者進(jìn)行12周的治療并隨訪至24周，期間亦未發(fā)現(xiàn)任何安全問題。

噬菌體臨床治療的有效性也陸續(xù)得到證實。波蘭一家研究所1987—1999年使用噬菌體治療了1 307例多重耐藥菌感染患者，85.9%的患者完全康復(fù)或局部傷口愈合。值得注意的是，噬菌體療法對化膿性腦膜炎和癤病的治療最為有效，治愈率達(dá)100%[13]。在一項由英國開展的隨機(jī)雙盲、安慰劑對照的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗[14]中，研究人員利用噬菌體治療耐藥性銅綠假單胞菌所致慢性耳部感染，將24例患者隨機(jī)分成2組，分別進(jìn)行噬菌體或安慰劑治療。結(jié)果顯示，與對照組相比，噬菌體治療組患者銅綠假單胞菌數(shù)量顯著下降，且未發(fā)生明顯不良反應(yīng)。另有報道，在格魯吉亞噬菌體治療中心，醫(yī)療人員利用噬菌體局部治療和靜脈注射成功治愈了1例耐萬古霉素金黃色葡萄球菌所致角膜膿腫和間質(zhì)性角膜炎患者[15]。噬菌體療法在治療人類病原菌感染方面具有巨大發(fā)展前景，但要真正應(yīng)用于臨床，其安全性和治療效果需更多研究證據(jù)支持；其也存在一定的局限性，有待進(jìn)一步探索和解決。

2 限制噬菌體臨床應(yīng)用的因素及解決措施

2.1 噬菌體具有較高的特異性，臨床單獨應(yīng)用范圍受限

由于宿主菌表面受體與噬菌體吸附結(jié)構(gòu)存在專一的相互作用[16]，大多數(shù)噬菌體只感染特定種類的細(xì)菌[17]。雖然噬菌體靶向病原可保護(hù)人體其他正常菌群免受破壞，但在多細(xì)菌感染臨床病例中，應(yīng)用單一噬菌體進(jìn)行治療顯然力度不足。針對這一問題，篩選兼具廣宿主譜和強(qiáng)裂解能力的噬菌體，有利于其在臨床病原菌感染中的應(yīng)用和控制環(huán)境中的微生物。Yu等[18]發(fā)明了連續(xù)多宿主分離噬菌體的方法，獲得的噬菌體不僅裂解能力增強(qiáng)，還能同時裂解大腸埃希菌和銅綠假單胞菌。此外，應(yīng)用噬菌體雞尾酒療法及對噬菌體進(jìn)行基因改造，亦可有效擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。研究表明，噬菌體M13通過基因改造攜帶RGD和多形態(tài)膜蛋白D (polymorphic membrane protein D，PmpD)，能顯著降低沙眼衣原體對HeLa細(xì)胞和PEC(primary endocervical)細(xì)胞的感染[19]。另有文獻(xiàn)對20例鏈球菌感染受試者進(jìn)行噬菌體雞尾酒療法，療效顯著提高[20]。此外，應(yīng)用生物信息學(xué)研究噬菌體基因組學(xué)，可為篩選廣譜噬菌體提供新思路。通過使用HostPhinder工具比對噬菌體基因組的同源性，可達(dá)到預(yù)測噬菌體宿主范圍的目的，且預(yù)測結(jié)果與實驗室所確定的噬菌體宿主譜有較好的相關(guān)性[21]。

2.2 細(xì)菌與噬菌體共同進(jìn)化，造成細(xì)菌更為頑固的耐藥機(jī)制

細(xì)菌與噬菌體的進(jìn)化是一場“拉鋸戰(zhàn)”[22]。Pal等[23]發(fā)現(xiàn)，實驗室條件下將熒光假單胞菌和對應(yīng)的烈性噬菌體共同培養(yǎng)后，25%菌株的突變速率增加了10～100倍，超過噬菌體的進(jìn)化速度。迄今為止，細(xì)菌進(jìn)化出的對抗噬菌體的機(jī)制[22]主要包括改變細(xì)菌表面噬菌體吸附受體、使用胞外多糖等物質(zhì)遮蔽噬菌體受體、應(yīng)用限制性酶切法對噬菌體DNA進(jìn)行識別并修飾，從而阻止噬菌體增殖及形成成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)/CRISPR-associated protein(Cas)，CRISPR/Cas〕系統(tǒng)而對外源DNA適應(yīng)性免疫響應(yīng)等。對此，有研究者提取位于鮑曼噬菌體ΦA(chǔ)B6尾部的多糖解聚酶，成功抑制了鮑曼不動桿菌生物膜的形成[24]。研究表明，噬菌體與鐵離子聯(lián)用亦能有效破壞肺炎克雷伯菌B5055形成的生物膜[25]。為了克服細(xì)菌的抗性，Merril等[26]發(fā)現(xiàn)連續(xù)予以噬菌體治療獲得的突變型噬菌體能延長其在循環(huán)系統(tǒng)中的存活時間并提高作用效果。此外，使用噬菌體雞尾酒療法可延緩噬菌體抗性菌株的演變。O’Flynn等[27]發(fā)現(xiàn)，采用兩種或三種混合噬菌體體外裂解大腸埃希菌O157∶H7，可使菌株的抗性頻率降至原來的1/100。

2.3 噬菌體的體內(nèi)作用機(jī)制未明，可能對人體造成危害

與體外實驗相比，噬菌體的體內(nèi)療效還受諸多理化因素影響，因此需開展大量體內(nèi)外及臨床試驗。首先，為保證噬菌體在到達(dá)感染部位發(fā)揮作用之前不被人體免疫系統(tǒng)清除，給藥途徑和方式一直是考慮的前提。研究發(fā)現(xiàn)[28]，與單純應(yīng)用噬菌體治療肺炎克雷伯菌所致小鼠肺部感染相比，脂質(zhì)體包裹的噬菌體治療效果更好，還有減少促炎細(xì)胞因子和增加抗炎細(xì)胞因子的作用。大多數(shù)噬菌體在強(qiáng)酸性環(huán)境下無法存活，故口服噬菌體治療胃腸道細(xì)菌性感染受到限制。有文獻(xiàn)報道[29]，用乳蛋白包裹的噬菌體可提高其在模擬胃液中的存活時間和濃度。其次，細(xì)菌被噬菌體裂解時釋放的大量內(nèi)毒素可引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。為此，有研究[30]添加T4噬菌體尾部黏附素gp12，發(fā)現(xiàn)其能被細(xì)菌表面的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)識別并結(jié)合，使小鼠體內(nèi)炎性因子白細(xì)胞介素1α(interleukin 1α，IL-1α)和IL-6水平及病理切片顯示的多器官炎癥程度降低，表明噬菌體gp12能調(diào)控并特異性對抗LPS引起的炎癥反應(yīng)，減輕細(xì)菌對機(jī)體的損害。為降低死亡率，亦可使用裂解缺陷或無復(fù)制能力的基因工程噬菌體。此外，有些噬菌體治療存在不確定因素，還需進(jìn)一步開展大量臨床試驗以明確其療效和不良反應(yīng)。雖然體外環(huán)境不能完全模擬復(fù)雜而多樣的體內(nèi)環(huán)境，但必須建立能預(yù)測噬菌體藥代動力學(xué)的數(shù)學(xué)模型，深入了解有效藥代動力學(xué)參數(shù)，為衡量其療效提供依據(jù)。

2.4 從噬菌體中提取的酶類作用多樣，活性和質(zhì)量有待優(yōu)化

基因測序結(jié)果顯示，噬菌體基因編碼多種酶，共同參與核酸復(fù)制、代謝、識別并裂解宿主菌等多個過程。目前，關(guān)于裂解宿主菌的相關(guān)酶類研究較多，包括穿孔素、內(nèi)溶素和多糖解聚酶。研究表明[31]，抗生素與多糖解聚酶的協(xié)同療法，既可有效降低細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的可能，又可避免抗生素濃度過高而造成的毒害作用。然而，大部分酶類作為外源性蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)而喪失酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，在給藥前將酶類與機(jī)體血清共同孵育，亦不具有隱蔽抗原的能力[32]。噬菌體裂解酶通過裂解肽聚糖殺滅細(xì)菌，但革蘭陰性菌的肽聚糖被厚厚的外膜包圍，因此大部分噬菌體裂解酶需經(jīng)修飾才能穿過外膜裂解肽聚糖以發(fā)揮作用。此外，有些研究從噬菌體中提取酶類仍采用化學(xué)制劑(丙酮等)，所獲產(chǎn)物數(shù)量和質(zhì)量均不穩(wěn)定；而應(yīng)用分子克隆方法，可將酶類投入大規(guī)模生產(chǎn)及臨床應(yīng)用。

2.5 相關(guān)制度和法規(guī)有待健全，以推動噬菌體作為藥物的研究和應(yīng)用

由于受到制藥與醫(yī)療行業(yè)的種種限制，噬菌體作為藥物應(yīng)用的探索甚少。美國FDA針對噬菌體治療所設(shè)的金標(biāo)準(zhǔn)是小規(guī)模人群試驗以反映噬菌體的有效性和安全性[33]。基于QbD (Quality by Design)和EUTCD (European Union Tissue and Cell Directives)標(biāo)準(zhǔn)，2015年來自12個國家的32位噬菌體方面的專家制定了一套評價體系，涉及噬菌體制備的全過程[34]，包括規(guī)范生產(chǎn)設(shè)備、監(jiān)控環(huán)境質(zhì)量、改進(jìn)生產(chǎn)工藝等，有望規(guī)范噬菌體的生產(chǎn)流程。有學(xué)者提出[35]，噬菌體經(jīng)過小規(guī)模人群試驗后，在投入臨床使用前可能需以下步驟：首先，權(quán)威部門，如作為公共健康研究機(jī)構(gòu)的歐洲疾病預(yù)防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)和作為藥物把關(guān)機(jī)構(gòu)的美國FDA，需制定并推行一套權(quán)威認(rèn)證的噬菌體特性分析、純化及擴(kuò)增生產(chǎn)方法標(biāo)準(zhǔn)；其次，在權(quán)威部門監(jiān)管下，一部分生物科技公司可進(jìn)行營利性生產(chǎn)；再次，由世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)搭建法律監(jiān)管框架，以明確推行噬菌體專利的實施流程；最后，由部分公司銷售噬菌體制劑，并對抗來自抗生素市場的壓力。因此，還需考慮更加健全的監(jiān)督體系等因素，以應(yīng)對噬菌體臨床應(yīng)用的未知考驗。

3 結(jié)語

目前研究顯示噬菌體療法展現(xiàn)出抗生素所不具有的優(yōu)點，有些單一噬菌體與抗生素聯(lián)用具有更強(qiáng)的能力。Dalmasso等[36]發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星與φAPCEc03噬菌體聯(lián)用的殺菌效果優(yōu)于噬菌體雞尾酒或混用抗生素的雞尾酒制劑，環(huán)丙沙星刺激了噬菌體活性，提高了其裂解細(xì)菌的能力。因此，研究不同抗生素與新型噬菌體聯(lián)用可為臨床治療細(xì)菌性感染提供更好的保障。此外，分子生物學(xué)突飛猛進(jìn)的發(fā)展使越來越多的科學(xué)家認(rèn)識到，各種噬菌體編碼表達(dá)的蛋白也在抗病原體感染中起不可小覷的作用。噬菌體裂解酶可破壞細(xì)菌細(xì)胞壁并殺滅細(xì)菌，而多糖解聚酶能降解細(xì)菌生物膜中的莢膜成分，降低細(xì)菌的自我保護(hù)機(jī)制，使用小劑量噬菌體酶類試劑即可發(fā)揮強(qiáng)大的功能，也消除了人們將噬菌體視為病毒本身的擔(dān)心。在感染性疾病預(yù)防方面，大量動物實驗證明噬菌體具有預(yù)防細(xì)菌性感染的效果。還有研究[37]表明，細(xì)菌在對抗噬菌體的同時會削弱自身毒力作用。研究人員將這些低毒性細(xì)菌作為疫苗使用，在動物實驗中取得了滿意的保護(hù)效果。這一發(fā)現(xiàn)也為未來應(yīng)用噬菌體制備抗菌疫苗提供了一個嶄新的思路和方法，具有極大的臨床意義。

噬菌體作為一種極具潛力的治療手段，雖然還存在一定問題，限制了其臨床應(yīng)用，但其為解決嚴(yán)峻的細(xì)菌耐藥性問題開拓了一條新的道路。相信未來會有更多關(guān)于噬菌體治療的研究涌現(xiàn)，能解決目前應(yīng)用中遇到的困難，將噬菌體療法更好地應(yīng)用于臨床。

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“一健康基金”成立

本刊主編聞玉梅院士及其丈夫?qū)帀圯峤淌谝詡€人名義捐贈的“一健康基金”于2013年1月16日在復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院正式成立。

“一健康”，是英文“One Health”的中文縮寫，意指“一體化健康”。它突出了人的健康是一個“系統(tǒng)工程”，需要整合基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)和人文社會科學(xué)等諸多學(xué)科共同研究與實施保障。也就是說，人類健康問題絕不僅僅是醫(yī)學(xué)的事、醫(yī)生的事，而是涉及多個學(xué)科交叉的系統(tǒng)性科學(xué)領(lǐng)域，是“一體化”事業(yè)。

“一健康基金”，就是為了在中國大力倡導(dǎo)“一體化健康”的理念，鼓勵更多的醫(yī)科教師和學(xué)生開拓跨學(xué)科的視野，主動融合其他學(xué)科，一齊致力于“一體化健康”的創(chuàng)新性教學(xué)、科研和人才培養(yǎng)，從而更好地服務(wù)于人群的整體健康。

例如，在微生物傳染病的防控中，“一體化健康”理念要求醫(yī)學(xué)學(xué)者聯(lián)合人及動物微生物學(xué)、臨床微生物學(xué)、環(huán)境微生物學(xué)、感染病學(xué)與流行病學(xué)等其他領(lǐng)域的力量，共同為控制傳染與感染性疾病的蔓延作出貢獻(xiàn)。上述各領(lǐng)域的整合不僅可在研究、檢測技術(shù)方面互相借鑒，更重要的是通過微生物學(xué)各分支間的相互溝通能聚集科學(xué)問題，對從個體患者拓展至公共衛(wèi)生群體健康的重要問題提出解決措施。

據(jù)介紹，復(fù)旦大學(xué)“一健康基金”將以留本基金的方式，每年獎勵在微生物學(xué)、傳染病學(xué)、公共衛(wèi)生學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域為“一體化健康”研究與教學(xué)作出突出成績的品學(xué)兼優(yōu)的學(xué)生和教師。獎勵對象每年將由相關(guān)學(xué)者和專家評出。

《微生物與感染》編輯部

. HUA Yunfen, E-mail: huayfyxwd@hotmail.com

Phage therapy and its limiting factors

LUO Tingting1,2, WANG Rui2, GU Chuanjia2, HE Ping2, HUA Yunfen1

1.CollegeofPharmaceuticalScience,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310014,China; 2.DepartmentofMicrobiologyandImmunology,BasicMedicineFacultyofShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200025,China

Drug resistance is a consistent problem for anti-infectious therapy. Bacteriophage can eliminate specific species from a microflora and has a potential to be adapted as an option for specific clinical conditions. Current research on phage therapy is reviewed, and the limiting factors are discussed.

Bacterial resistance; Bacteriophage; Phage therapy; Bacterial infection

國家自然科學(xué)基金(81471908)

華允芬

2016-11-22)