郭佳慧，文榮，王玉燕，張浩旸，劉紅，徐婭佳，葉榮

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，上海 200032

·論著·

鼠冠狀病毒核衣殼蛋白的抗體制備與抗原決定簇分析

郭佳慧，文榮，王玉燕，張浩旸，劉紅，徐婭佳，葉榮

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，上海 200032

核衣殼(nucleocapsid，N)蛋白有穩(wěn)定病毒基因組、調(diào)控病毒復(fù)制及細(xì)胞狀態(tài)的特殊作用。鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)為乙型冠狀病毒屬的原型病毒，是研究冠狀病毒N蛋白功能的經(jīng)典模型。本研究用去污劑處理鼠冠狀病毒粒子暴露N蛋白，另用原核表達純化的重組N蛋白分別免疫小鼠，制備多克隆及單克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示兩類抗體均具有高靈敏度和特異度，與甲型冠狀病毒豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)的N蛋白無交叉反應(yīng)。原核表達缺失突變的N蛋白分析結(jié)果顯示，多克隆抗體與單克隆抗體2E6識別的鼠冠狀病毒N蛋白抗原決定簇完全一致，位于N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，NTD)C端與SR之間的58個氨基酸殘基內(nèi)。此外，基于單克隆抗體2E6的ELISA及免疫熒光法能檢測到感染細(xì)胞中和培養(yǎng)上清液中的N蛋白組分，且其含量與病毒復(fù)制的滴度一致。這些結(jié)果表明，鼠冠狀病毒復(fù)制過程中粒子與細(xì)胞中的N蛋白可能維持相似的結(jié)構(gòu)，使NTD與SR之間的部分氨基酸殘基一直暴露在表面，從而形成了優(yōu)勢抗原決定簇。

鼠冠狀病毒；核衣殼蛋白；抗體；抗原決定簇

冠狀病毒(coronavirus，CoV)是一類有包膜的正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目(Nidovirales)，其基因組是目前已知最大的mRNA分子，約30 kb[1]。早期認(rèn)為冠狀病毒主要引起家養(yǎng)動物和禽類腸道、呼吸道疾病，僅少數(shù)引起人類普通感冒[2]。近年來，因新型冠狀病毒引起人類嚴(yán)重呼吸綜合征如嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)和中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome，MERS)暴發(fā)，導(dǎo)致許多來自人和野生動物(如蝙蝠)的冠狀病毒種類被發(fā)現(xiàn)和鑒定[1-3]。目前，冠狀病毒科(Coronaviridae)包括甲型、乙型、丙型和丁型4個屬，新的冠狀病毒主要集中在甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)和乙型冠狀病毒屬(Betacoronavirus)[4]。

鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)是乙型冠狀病毒屬的代表性成員，主要經(jīng)口或呼吸道感染小鼠和大鼠，是實驗動物的主要病原之一[5]。MHV是研究冠狀病毒分子生物學(xué)和致病性的經(jīng)典模型，有多個實驗室分離株，其中MHV-A59能引起小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟病變，是人類肝炎和肝脂肪變性及亞急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理的動物模型[6-8]。有學(xué)者將MHV-A59鼻內(nèi)感染C57BL/6小鼠作為SARS-CoV和MERS-CoV所致急性呼吸綜合征的替代模型[9]。冠狀病毒RNA基因組通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一系列具有共同前導(dǎo)序列(leader sequence)和3′-UTR的亞基因組mRNA(subgenomic mRNA，sgmRNA)表達蛋白，其中表達復(fù)制酶的sgmRNA1與基因組RNA完全相同。開放讀碼框1(open reading frame 1，ORF1)占sgmRNA1 5′端2/3長度，翻譯時發(fā)生核糖體移碼，產(chǎn)生兩個多聚蛋白pp1a和pp1ab，兩者在木瓜樣蛋白酶的作用下形成16個非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1～nsp16)[1-2,10]。結(jié)構(gòu)蛋白由各自的sgmRNA獨立表達，主要有棘突(spike，S)蛋白、核衣殼(nucleocapsid，N)蛋白、膜(membrane，M)蛋白和小包膜(envelope，E)蛋白，部分冠狀病毒還表達血凝素酯酶(hemagglutinin esterase，HE)蛋白[1-2,10]。其中N蛋白高度磷酸化，是構(gòu)成病毒核衣殼的唯一蛋白，與基因組RNA結(jié)合形成螺旋狀卷曲[1-2,10]。冠狀病毒N蛋白具有調(diào)控病毒復(fù)制與細(xì)胞狀態(tài)的功能，其磷酸化及其與RNA的結(jié)合，可調(diào)控病毒復(fù)制酶非連續(xù)-連續(xù)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，與基因組RNA的合成密切相關(guān)[11-15]。N蛋白自身可發(fā)生同源聚合，通過C端也能與病毒M蛋白相互作用，參與病毒粒子的選擇性裝配[16-18]。此外，冠狀病毒N蛋白還能通過抑制RNase L活性、激發(fā)信號通路等拮抗干擾素(interferon，IFN)的抗病毒作用[19-20]。

本研究用去污劑處理的鼠冠狀病毒粒子作為N蛋白抗原免疫小鼠，比較以原核表達N蛋白作為抗原所獲得的抗體特性，發(fā)現(xiàn)多克隆與單克隆抗體均具有高度的特異性，且識別的N蛋白抗原表位明顯一致。單克隆抗體能很好地識別細(xì)胞培養(yǎng)上清液中和胞內(nèi)的N蛋白，提示鼠冠狀病毒N蛋白在生物合成與裝配過程中保持相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，暴露的殘基形成優(yōu)勢抗原決定簇。本研究所制備的高親和力單克隆抗體不但能用于N蛋白的檢測，還能為進一步解析N蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒、菌株和質(zhì)粒

小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞(Neuro-2a)、小鼠骨髓瘤細(xì)胞(P3/X63-Ag8.653)、小鼠巨噬細(xì)胞(Raw264.7)、犬腎細(xì)胞(A72)源自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，由本實驗室保存；MHV-A59和質(zhì)粒pMH54來自Dr. Paul Masters實驗室[21]，由本實驗室保存；豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV) Purdue源自ATCC，由本實驗室保存；Novagen pET28a(Merck Millipore)由本實驗室保存；DH5α、Top10、BL21感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司。BALB/c小鼠由復(fù)旦大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染

Neuro-2a、Raw264.7、A72細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(Gibco-Life Technologies)的DMEM(Gibco-Life Technologies)，P3/X63-Ag8.653細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640(Gibco-Life Technologies)，培養(yǎng)條件37 ℃，5% CO2。MHV-A59用Neuro-2a細(xì)胞擴增，TGEV用A72細(xì)胞擴增，感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為 0.1～1.0，感染時間為1～2 h。

1.3 冠狀病毒N蛋白的原核表達與純化

分子克隆按常規(guī)方法進行[22]，試劑購自NEB和TaKaRa公司。MHV N蛋白基因來自質(zhì)粒pMH54[21]，TGEV Purdue N蛋白基因來自病毒感染細(xì)胞[23]。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)擴增基因片段，經(jīng)NdeⅠ和HindⅢ或EcoRⅠ位點插入原核表達載體pET28a His 6-tag(21個殘基)的下游，獲得野生型N蛋白表達載體(pET28a-mN和pET28a-tN)。在pET28a-mN基礎(chǔ)上，利用酶切和融合PCR進一步構(gòu)建不同區(qū)域缺失的N蛋白表達載體mN-A (Δ114～222 aa )、mN-B(Δ163～454 aa)、mN-C(Δ221～381 aa)和mN-D(Δ318～454 aa)。

重組質(zhì)粒測序鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，用1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)6 h，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)及蛋白免疫印跡法鑒定重組蛋白表達量和分布。菌體用超聲破碎后，含重組N蛋白可溶性組分經(jīng)Ni柱(Pharmcia-GE Healthcare)親和層析，再用不同濃度咪唑(Sigma)洗脫，合并高純度組分，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)4 ℃透析3次，收集純化后的重組 N蛋白，分裝，-80 ℃保存。

1.4 病毒粒子N蛋白的制備

鼠冠狀病毒粒子純化按密度梯度離心法[24]中的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀濃縮步驟進行。用5 mL MHV感染Neuro-2a細(xì)胞(或TGEV感染A72細(xì)胞)2 h，無血清 DMEM補齊至25 mL(T75)。培養(yǎng)至約80%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)(MHV，24 h；TGEV，48 h)時，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞碎片；4 ℃向病毒上清液中緩慢滴加1/3體積的30% PEG 8000(Sigma)(用0.85% NaCl配制)，4 ℃繼續(xù)攪拌2 h，離心沉淀后，用適量PBS懸浮和溶解；再用1/3體積的30% PEG 8000沉淀1次，用適量PBS懸浮和溶解，離心去除不溶物；分裝后，置-80 ℃保存。在初步純化的病毒粒子中加入SDS至終濃度為5%，37 ℃孵育15 min，滅活并破壞病毒粒子表面結(jié)構(gòu)，暴露N蛋白。

1.5 小鼠免疫和N蛋白抗血清的制備

將純化的原核表達N蛋白(mN和tN)或處理的病毒粒子(MHV和TGEV)與等體積福氏完全佐劑(Sigma)用注射器反復(fù)抽吸至完全乳化，腹腔免疫BALB/c小鼠(250～400 μL/只)。初次免疫后，間隔2周進行加強免疫(除乳化使用福氏不完全佐劑外，劑量與方法相同)。2～3次加強免疫后，眼眶后眥靜脈取血或放血，分離血清。

1.6 單克隆抗體的制備與純化

單克隆抗體制備采用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)，參照文獻進行[25]。全部試劑購自Sigma，培養(yǎng)基購自Gibco-Life Technologies。基本流程如下：①0.5 mL石蠟油腹腔注射致敏小鼠1周，頸椎脫臼處死小鼠后，立即用HAT選擇培養(yǎng)液洗脫腹腔巨噬細(xì)胞，96孔板培養(yǎng)24～48 h。②眼球放血處死免疫小鼠后取脾臟，通過吸管反復(fù)碾壓及200目濾網(wǎng)過濾，再用無血清RPMI 1640洗3次。③P3/X63-Ag8.653在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，收集并用無血清RPMI 1640洗2次。④將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按約1∶10的比例混合，37 ℃水浴條件下50% PEG 4000誘導(dǎo)融合1～3 min，用37 ℃預(yù)熱的無血清RPMI 1640緩慢稀釋去除PEG，HAT選擇培養(yǎng)液重懸，稀釋，鋪至含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板。⑤培養(yǎng)10～15 d后，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測培養(yǎng)上清液中的抗體，陽性孔用有限稀釋法進行單克隆化2次。⑥待穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株復(fù)蘇后，用低血清RPMI 1640培養(yǎng)，將細(xì)胞接種至BALB/c小鼠腹腔，1～2周后收集腹腔積液。培養(yǎng)上清液用適量PBS稀釋，過親和層析HiTrap Protein G柱(GE Healthcare)純化。為減少樣本體積及去除白蛋白，也可先用等體積飽和硫酸銨沉淀，溶解后經(jīng)Sephadex G25M柱(Pharmacia Fine Chemical)脫鹽，再用G蛋白柱純化。

1.7 ELISA

ELISA所用試劑、材料與流程參照文獻進行[25]。細(xì)胞上清液經(jīng)等體積30% PEG 8000(Sigma)沉淀后，用堿性包被液稀釋至原體積。單層感染細(xì)胞用1×IPP Buffer制備裂解液，堿性包被液稀釋后進行包被；抗血清或單克隆抗體用PBS進行倍比稀釋，4 ℃孵育過夜；二抗辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(GE)37 ℃孵育 1h，用鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)/H2O2顯色及硫酸終止，檢測OD492值。

1.8 SDS-PAGE和蛋白免疫印跡法檢測

蛋白電泳及轉(zhuǎn)印采用Bio-Rad mini裝置完成，緩沖液主要試劑(Tris/Glysine/SDS)購自Calbiochem公司。細(xì)胞裂解液樣品加等體積2×樣品緩沖液，100 ℃ 5 min變性處理；配制5%濃縮膠和10%分離膠的丙烯酰胺(Amresco)凝膠，恒流(15 mA)電泳。電泳后，用考馬斯亮藍R250(Amresco)染色并觀察，或?qū)⒛z內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜(Bio-Rad)上，一抗4 ℃孵育過夜，二抗羊抗小鼠IgG-HRP 37 ℃孵育1 h，行增強化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)(Bio-Rad)檢測，X線片顯影。

1.9 共聚焦顯微鏡觀察

將細(xì)胞稀釋后，鋪至特制玻璃底一次性小型細(xì)胞培養(yǎng)皿(In Vitro Scientific)，培養(yǎng)24～48 h，至約60%細(xì)胞融合。用1.0 MOI的病毒感染不同時間后取出，收集培養(yǎng)液。單層細(xì)胞用冷PBS洗3次，4% 多聚甲醛(Sigma)室溫固定30 min，5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉1 h，4 ℃保存。與抗MHV N蛋白單克隆抗體(2E6)4 ℃孵育過夜，二抗羊抗小鼠四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate，TRITC)標(biāo)記IgG(JIR)37 ℃孵育2 h，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(JIR)孵育30 min，封片。用Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡觀察MHV N蛋白的表達與分布。

2 結(jié)果

2.1 鼠冠狀病毒 N蛋白的序列分析

鼠冠狀病毒N蛋白由454～455個氨基酸殘基組成，富含堿性氨基酸(R和K)和絲氨酸(S)。通過比較不同毒株序列，發(fā)現(xiàn)兩個20多個殘基的間隔區(qū)(spacer A和spacer B)將3個結(jié)構(gòu)域(domain)隔開(圖1A)。domainⅠ(1～139位氨基酸)和domainⅡ(163～380位氨基酸)主要與病毒基因組RNA結(jié)合，domain Ⅲ(406～454位氨基酸)參與其他結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用[26]。根據(jù)RNA結(jié)合功能將domainⅠ和domainⅡ重新分為N1a(43～194位氨基酸)和N2b(257～379位氨基酸)結(jié)構(gòu)域，現(xiàn)稱為N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，NTD)和C端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain，CTD)(圖1A)。NTD中堿性氨基酸在RNA結(jié)合作用中起關(guān)鍵作用[27]。此外，N蛋白的NTD區(qū)富含SGR，NTD與CTD之間區(qū)域富含SR，與N蛋白磷酸化有關(guān)[13,15]。

冠狀病毒N蛋白的氨基酸序列在屬內(nèi)高度保守，在不同屬之間差異明顯。通過Vector NTI軟件將乙型冠狀病毒MHV-A59與甲型冠狀病毒TGEV Purdue和丙型冠狀病毒雞傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，IBV)Beaudette的N蛋白氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)三者序列僅12.1%一致(圖1B)，且54.3%保守序列集中在NTD和SR區(qū)，在CTD區(qū)相對較少。NTD和SR的一些關(guān)鍵堿性氨基酸參與RNA結(jié)合(圖1B)。鼠冠狀病毒5個分離株(MHV-A59、 MHV-JHM、MHV1、MHV2和MHV3)之間核苷酸序列同源性超過92%，氨基酸序列同源性超過94%[26]。

2.2 冠狀病毒N蛋白抗體制備及特異性

為制備能識別天然冠狀病毒N蛋白的抗體，用去污劑快速處理濃集的病毒(MHV和TGEV)，暴露N蛋白作為抗原。同時，用純化的原核表達N蛋白(mN和tN)作為對照抗原(圖2A)，免疫小鼠獲得相應(yīng)多克隆抗體(pAb-MHV、pAb-mN、pAb-TGEV、pAb-tN)及針對MHV的單克隆抗體(mAb-MHV)。ELISA結(jié)果顯示，原核表達蛋白制備的多克隆抗體無明顯背景反應(yīng)，兩者之間交叉反應(yīng)也不明顯(圖2B)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，鼠冠狀病毒N蛋白多克隆抗體(圖2C)及單克隆抗體(圖2E)均能與病毒感染的細(xì)胞(Neuro-2a)裂解液中N蛋白和原核(大腸埃希菌)表達的重組蛋白mN產(chǎn)生特異性反應(yīng)，但不與豬冠狀病毒(TGEV)感染細(xì)胞(A72)裂解液中N蛋白和原核(大腸埃希菌)表達的重組蛋白tN產(chǎn)生反應(yīng)。同樣，豬冠狀病毒多克隆抗體也只與同源病毒的N蛋白產(chǎn)生反應(yīng)(圖2D)，兩者之間無交叉反應(yīng)。

MHV在感染Neuro-2a細(xì)胞過程中，產(chǎn)生的N蛋白形成遷移率不同(相對分子質(zhì)量40 000～55 000)的多條反應(yīng)帶，而原核表達的重組蛋白mN只有單一條帶，相對分子質(zhì)量略大(N端多His-tag序列的21個殘基)(圖2C、2E)。豬冠狀病毒(TGEV)感染A72細(xì)胞產(chǎn)生的N蛋白與重組蛋白tN形成反應(yīng)條帶與抗體有關(guān)，pAb-tN多條帶，而pAb-TGEV單一條帶，相對分子質(zhì)量比鼠冠狀病毒N蛋白?。辉吮磉_的tN也略大于TGEV感染產(chǎn)生的N蛋白(N端同樣多His-tag序列的21個殘基)(圖2B)。

A: The functional domains of murine coronaviruse (MHV-A59). Three structural domain (DI, DII, and DIII) and two spacer sequences (A and B) are shown with rectangles (top); a N-terminal domain (NTD) and a C-terminal domain (CTD) of N proteins are shown with a cartoon (bottom). Numbers represent the position of amino acid residues. B: Alignment of anino acid sequences of N proteins from three genera of coronaviruses.Betacoronavirusmurine hepatitis virus (MHV-A59; sequence accession No. AY700211),Alphacoronavirus1 member porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV Purdue; sequence accession No. AJ271965) andGammacoronavirusavian infectious bronchitis virus (IBV Beaudette; sequence accession No. AJ311317) were used. NTD of MHV-A59 is marked. Asterisked residues play a key role in RNA binding of N protein and underlined residues are the potential antigenic determinants.

圖1 鼠冠狀病毒N蛋白的結(jié)構(gòu)域及與其他冠狀病毒N蛋白序列的比較

Fig.1 Domains of murine coronavirus N protein and comparison of the anino acid sequence from three genera of coronaviruses

2.3 鼠冠狀病毒N蛋白優(yōu)勢抗原決定簇分析

在抗體制備過程中獲得一株MHV N蛋白高親和力單克隆抗體2E6(圖2C)，為確定其識別區(qū)域，在pET28a-mN的基礎(chǔ)上通過缺失突變構(gòu)建了4個含MHV N蛋白不同結(jié)構(gòu)域的重組表達質(zhì)粒(圖3A)，IPTG誘導(dǎo)后均能很好地表達，相對分子質(zhì)量也與ExPASy軟件預(yù)測值一致(圖3B左)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，MHV N多克隆抗體(圖3B中)與單克隆抗體(圖3B右)對4個片段的反應(yīng)幾乎一致，均不能識別A和B片段，但能識別C和D片段及全長N蛋白(mN)。多克隆抗體還能與全長N蛋白(mN)的相對分子質(zhì)量為35 000的降解片段反應(yīng)(圖3B中)。上述結(jié)果表明，多克隆抗體主要識別序列與單克隆抗體2E6一致，為domainⅡ的N端58個殘基(163～220位氨基酸)，覆蓋NTD C端與SR富含區(qū)，是優(yōu)勢抗原決定簇。

A: SDS-PAGE of MHV N (mN) and TGEV N (tN) fusion protein. Minus (-) represents pET28a vector control. B: ELISA of murine anti-mN and anti-tN antibodies. ELISA plates were coated with purified mN or tN and incubated with diluted antibodies.OD492values were from triple tests. C: Reactivity of MHV polyclonal antibodies. Lysates of murine Neuro-2a cells infected with MHV-A59, canine A72 cells infected with TGEV Purdue, andE.colicells expressing wild-type MHV-A59 N protein (mN) or TGEV Purdue N protein (tN) were analyzed by Western blotting with the polyclonal antibodies to treated MHV-A59 particles (pAb-MHV) or to mN (pAb-mN). D: Reactivity of TGEV polyclonal antibodies. Lysates as (C) were analyzed by Western blotting with the polyclonal antibodies to treated TGEV Purdue particles (pAb-TGEV) or to tN (pAb-tN). E: Reactivity of MHV monoclonal antibody. Lysates as (C) were analyzed by Western blotting with the monoclonal antibody (2E6) to treated MHV-A59 particles (mAb-MHV).

圖2 抗體制備及與原核或真核細(xì)胞表達的兩種冠狀病毒N蛋白的反應(yīng)性

Fig.2 Preparation and reactivity of antibodies to two N proteins expressed in prokaryotic and eukaryotic cells

A: Construction and expression strategy of murine coronavirus N protein in prokaryotic plasmid (pET28a). A diagram showed the residue number and position of three domains of MHV-A59 N protein (referring to Fig.1). A extensive His6-tag (21 aa) was added to the N-terminus of wild-type (mN) and four truncated or deleted mutants (A, B, C, and D) of N protein. The putative molecular weight was shown on the right side of these constructs. B: Expression and Western blotting of mN mutants inE.coli.E.colilysates expressing recombiant N protein were analyzed by SDS-PAGE and Coomassie staining (left panel) or blotted onto PVDF membranes and detected with mouse polyclonal antibody (central panel, pAb-MHV) and monoclonal antibody 2E6 (right panel, mAb-MHV) to murine coronavirus N protein.

圖3 鼠冠狀病毒N蛋白抗原決定簇分析

Fig.3 Analysis of the antigenic determinants of murine coronavirus N protein

2.4 單克隆抗體2E6識別不同類型的鼠冠狀病毒 N蛋白

以上所獲MHV N蛋白單克隆抗體2E6識別NTD C端與SR富含區(qū)，該區(qū)域的正電荷殘基具有親水性，也包括N蛋白主要磷酸化位點[13,15]。在MHV感染過程中，N蛋白具有自我裝配及與其他結(jié)構(gòu)蛋白相互作用的功能[2]。為驗證該決定簇在細(xì)胞內(nèi)生物合成過程中的空間穩(wěn)定性，于感染鼠源Neuro-2a和Raw264.7細(xì)胞后的不同時間收集培養(yǎng)上清液與細(xì)胞裂解液中的N蛋白，在堿性條件下(pH 9.6)包被至ELISA微孔板，用單克隆抗體2E6進行檢測。結(jié)果顯示，MHV感染后培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中N蛋白水平均在感染后16～24 h達到峰值，與病毒滴度比較一致(圖4A)。單克隆抗體2E6與培養(yǎng)上清液中N蛋白反應(yīng)良好，OD492值較高，而與細(xì)胞裂解液中N蛋白反應(yīng)的OD492值較低(圖4A)，可能與N蛋白收集方法和稀釋度有關(guān)。前者主要來自病毒，也包括未裝配的N蛋白。通過免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)MHV N蛋白表達與分布，發(fā)現(xiàn)感染后4 h即可見N蛋白表達，8～12 h后熒光信號明顯(圖4B)。此外，不同種類的鼠源細(xì)胞N蛋白合成時間與表達水平不同，分布也有差異。在Neuro-2a細(xì)胞呈細(xì)胞質(zhì)分布，很少見核定位現(xiàn)象。在Raw264.7細(xì)胞不但呈細(xì)胞質(zhì)分布，還可見少量核定位現(xiàn)象(圖4B)。這些結(jié)果表明，本研究制備的MHV N蛋白抗體既能與完全變性的N蛋白反應(yīng)，也能識別聚合的或在細(xì)胞內(nèi)合成的構(gòu)象相對穩(wěn)定的N蛋白。

A: Time-course changes of viral titres in culture media (●), N protein in culture media (■), and N protein in cellular lysates (▲) after infection with murine coronavirus. Viral titre is shown as log10plaque forming unit (PFU) per mL of medium supernatant. Amount of N protein in media or lysates is shown asOD492of ELISA substrate. Tests were repeated triplicately. B: Expression of N protein in cells at the early stage of virus replication. N protein in infected Neuro-2a (top panel) and Raw264.7 (bottom panel) cells was detected by immunofluorescence with the mouse monoclonal antibody (2E6) to N protein of murine coronavirus. Scale bar, 25 μm.

圖4 培養(yǎng)細(xì)胞中N蛋白的表達與病毒復(fù)制的相關(guān)性

Fig.4 Relationship between the expression of N protein and the replication of murine coronavirus in cultured Neuro-2a and Raw264.7 cells

3 討論

冠狀病毒N蛋白作為結(jié)構(gòu)蛋白，主要與病毒基因組RNA結(jié)合后構(gòu)成病毒核心。冠狀病毒N蛋白不僅參與調(diào)節(jié)病毒RNA的復(fù)制，同時能作為RNA分子伴侶促進sgmRNA的轉(zhuǎn)錄[11-15]。鼠冠狀病毒N蛋白的NTD和CTD均能與病毒RNA結(jié)合，前者作用較強[16]。兩個結(jié)構(gòu)域之間有一個在不同冠狀病毒屬之間相對保守的富含絲氨酸和精氨酸殘基的SRXX重復(fù)區(qū)(也稱N2a)，通過與復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(replication-transcription complex，RTC)中病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp3結(jié)合，在病毒感染早期發(fā)揮關(guān)鍵作用[17-18]。此外，帶有下游SR區(qū)的MHV N蛋白的NTD不但能特異性地結(jié)合自身轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(transcriptional regulatory sequence，TRS)RNA，還能結(jié)合SARS-CoV TRS RNA[28]。

以去污劑處理純化后的鼠冠狀病毒粒子為抗原制備的抗-MHV N蛋白多克隆抗體和單克隆抗體2E6，能特異性識別變性的N蛋白，不與豬冠狀病毒(TGEV)的N蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)。多克隆抗體與單克隆抗體2E6識別MHV N蛋白的序列一致，抗原表位存在于domainⅡ的58個氨基酸內(nèi)(163～220位氨基酸)。本研究所獲的其他雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗體識別序列也與2E6相同，表明去除鼠冠狀病毒包膜后，N蛋白暴露區(qū)域是主要抗原決定簇。本研究制備的抗體能識別變性和非變性的N蛋白抗原決定簇，可能具有通過干擾N蛋白與RNA結(jié)合而降低病毒RNA合成與轉(zhuǎn)錄的作用，有待進一步證實。

冠狀病毒N蛋白參與病毒核心形成，其表達水平在一定程度上決定了病毒增殖水平。為分析兩者之間的關(guān)系，本研究采用ELISA和免疫熒光技術(shù)對細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清液中N蛋白進行檢測，并與培養(yǎng)上清液中成熟病毒的滴度進行比較。ELISA結(jié)果顯示，培養(yǎng)上清液與細(xì)胞裂解液中N蛋白含量與病毒滴度基本一致，均在病毒感染后12 h開始升高，16～24 h達到高峰，然后開始降低。雖然病毒感染后8 h培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中N蛋白升高不明顯，但免疫熒光可見細(xì)胞中有明顯的N蛋白，Raw264.7細(xì)胞于感染后4 h即可見N蛋白表達。結(jié)果表明，單克隆抗體2E6對變性的N蛋白具有很好的識別能力，ELISA可用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中病毒的檢測，而病毒在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制水平用免疫熒光檢測N蛋白更為靈敏。

一些研究發(fā)現(xiàn)，冠狀病毒N蛋白能定位于細(xì)胞核的核仁，并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[29-30]。理論預(yù)測MHV N蛋白的核定位信號(nuclear localization signal，NLS)為domain Ⅲ中的一個富含堿性氨基酸的Pat 7序列[29]。冠狀病毒基因組RNA指導(dǎo)的蛋白合成主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進行。本研究也注意到，MHV感染鼠源Neuro-2a和Raw264.7細(xì)胞后可見N蛋白的細(xì)胞核分布(數(shù)據(jù)未列)，提示N蛋白可能參與干擾宿主細(xì)胞功能從而促進病毒自身復(fù)制。N蛋白對宿主細(xì)胞生理功能的影響有待深入研究。

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. YE Rong, E-mail: yerong24@fudan.edu.cn

Preparation and characterization of antibodies against murine coronavirus nucleocapsid protein

GUO Jiahui, WEN Rong, WANG Yuyan, ZHANG Haoyang, LIU Hong, XU Yajia, YE Rong

DepartmentofMicrobiologyandParasitology,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China

Nucleocapsid (N) protein of virus plays special roles in stabilization of viral genome, regulation of viral replication and adapting cellular circumstance. Murine hepatitis virus (MHV), the prototype ofBetacoronavirus, is a classic model for the exploration of coronavirus N protein functions. Viral N proteins from detergent-treated virions and recombinant N proteins expressed in prokaryotic cells were prepared and used to immunize BALB/c mice for the preparation of polyclonal and monoclonal antibodies respectively. Antibodies with high sensitivity and specificity against the antigens were selected and subjected an assay for antigenic determinants. The results indicated that both polyclonal antiserum and mAb 2E6 recognized a region covering 58 residues motif. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with mAb 2E6 was established for N proteins in medium supernatants and cellular lysates. The signal could be detected at 4 h after infection and the readings were consistent to viral titers.

Murine coronavirus; Nucleocapsid protein; Antibody; Antigenic determinant

國家自然科學(xué)基金(31170786、31100116)

葉榮

2016-12-26)