張德保，邢春根 (蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，江蘇蘇州215000)

·論著·

長(zhǎng)鏈非編碼RNA SPRY4-IT1 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29 增殖凋亡的影響及機(jī)制

張德保，邢春根
(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，江蘇蘇州215000)

目的 探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA) SPRY4-IT1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29增殖、凋亡的影響及機(jī)制。方法 采用qRT-PCR方法檢測(cè)LncRNA SPRY4-IT1在結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)和正常腸上皮細(xì)胞(FHC)的表達(dá)。選擇其相對(duì)表達(dá)最高的HT-29細(xì)胞，以慢病毒載體介導(dǎo)構(gòu)建SPRY4-IT1過表達(dá)(上調(diào)組)和干擾的(下調(diào)組)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并設(shè)立無義轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組；qRT-PCR檢測(cè)各組HT-29細(xì)胞中SPRY4-IT1 mRNA的表達(dá)量；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力；克隆試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。Western blotting法檢測(cè)凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)量。結(jié)果 LncRNA SPRY4-IT1在結(jié)直腸細(xì)胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)相對(duì)FHC的表達(dá)增高，以HT-29細(xì)胞株中的表達(dá)最高(P均<0.05)。相對(duì)于空白對(duì)照組、無義轉(zhuǎn)染組，上調(diào)組SPRY4-IT1 mRNA表達(dá)量升高，HT-29細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)，克隆形成率升高，凋亡率降低(P<0.05或<0.01)；而下調(diào)組SPRY4-IT1 mRNA表達(dá)量下降，細(xì)胞增殖活力減弱，克隆形成率降低，凋亡率升高(P<0.05或<0.01)；在各組細(xì)胞間，細(xì)胞周期分布比較，P均>0.05。相對(duì)于空白對(duì)照組、無義轉(zhuǎn)染組，上調(diào)組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量增多，Bax蛋白表達(dá)量減少(P<0.05或<0.01)；下調(diào)組Bcl-2蛋白表達(dá)量減少，Bax蛋白表達(dá)量增多(P均<0.01)。結(jié)論 LncRNA SPRY4-IT1可能通過促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、抑制其凋亡。

結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29；長(zhǎng)鏈非編碼RNA；SPRY4-IT1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是指長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸，不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。早年研究認(rèn)為，LncRNA是轉(zhuǎn)錄后的“暗物質(zhì)”或“噪音”[1,2]。近年研究證實(shí)，LncRNA雖不編碼蛋白質(zhì)，可以和蛋白質(zhì)相互作用[3]，并參與細(xì)胞分化過程的調(diào)節(jié)，在干細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[4,5]。在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用的LncRNA有BRAF-actived LncRNA(BANCR)、LncRNA HOTAIR、LncRNA MALAT1、LncRNA-CCAT1等[6～9]。有研究表明，LncRNA SPRY4-IT1在黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤、食管癌、胃癌、腎透明細(xì)胞癌、膀胱癌中均有報(bào)道[10～15]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后具有一定的相關(guān)性。2016年5～12月，本研究主要探討了LncRNA SPRY4-IT1在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)，以及SPRY4-IT1對(duì)HT-29細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為將來結(jié)直腸癌臨床分子靶向診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)和正常人腸上皮細(xì)胞(FHC)均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。SPRY4-IT1引物序列、內(nèi)參GAPDH引物購(gòu)自上海生工。過表達(dá)和干擾序列由南京Abm公司合成。CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁；7-aad/PE試劑盒購(gòu)自BD公司；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡試劑盒及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天；Bax、Bcl-2抗體(兔抗人)購(gòu)自Abcam公司，β-actin內(nèi)參(鼠抗人)及抗兔、抗鼠二抗購(gòu)自碧云天。BioRad CFX96 Touch 熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司；TECAN Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士；恒壓恒流電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司；電泳儀和電泳槽購(gòu)自中國(guó)上海輝煌科學(xué)儀器公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自中國(guó)基因有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%已滅活的胎牛血清及1%青鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)及FHC。根據(jù)培養(yǎng)基的顏色每2～3 d換液一次，待細(xì)胞融合至90%左右，進(jìn)行細(xì)胞傳代，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 LncRNA SPRY4-IT1 mRNA的檢測(cè) 采用qRT-PCR法。TRIzol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR：所有cDNA樣品分別配制內(nèi)參和目的基因的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系。每個(gè)反應(yīng)管配置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)計(jì)陰性對(duì)照，即反應(yīng)體系中以去離子水代替模板cDNA。將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于qPCR儀上進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min預(yù)變性，然后按95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s(收集熒光信號(hào))，72 ℃ 30 s,共45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后設(shè)置熔解曲線分析程序。所用引物序列如下：SPRY4-IT1(上游引物：5′-AGCCACATAAATTCAGCAGA-3′，下游引物：5′-CGATGTAGTAGGATTCCTTTCA-3′);內(nèi)參GAPDH引物(上游引物：5′-GACTCATGACCACAAGTCCATGC-3′，下游引物：5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′)。采用2-ΔΔCT法分析LncRNA SPRY4-IT1的相對(duì)表達(dá)。

1.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建及分組 以慢病毒載體介導(dǎo)構(gòu)建SPRY4-IT1過表達(dá)、敲低及無義序列的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，慢病毒載體及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株由南京Abm公司合成并構(gòu)建。將細(xì)胞分為上調(diào)組(SPRY4-IT1過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株)、下調(diào)組(SPRY4-IT1敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株)及無義轉(zhuǎn)染組(無義轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株)，設(shè)置空白對(duì)照組。干擾序列為：CCCAGATGTTGACAGCTGCCTCT。用qRT-PCR法檢測(cè)各組HT-29細(xì)胞中SPRY4-IT1的相對(duì)表達(dá)，方法和反應(yīng)條件同1.3。

1.5 細(xì)胞增殖活力的檢測(cè) 采用CCK-8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胰酶消化懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為104/mL,取100 μL加入96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)陰性對(duì)照(只加培養(yǎng)基和CCK-8，沒有細(xì)胞)。分別于細(xì)胞接種到96孔板后的第1天至第5天加CCK-8液10 μL,于加液后繼續(xù)正常培養(yǎng)4 h，在酶標(biāo)儀上450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度(OD)值。

1.6 細(xì)胞克隆形成能力的檢測(cè) 采用克隆形成試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組HT-29細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用6孔板培養(yǎng)，每孔加300個(gè)細(xì)胞，加含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基至3 mL。細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下，培養(yǎng)2～3周，3～5 d換液一次，觀察克隆形成，以肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，每孔加甲醇1 mL固定15 min。棄固定液，用姬姆薩染液染色30 min。每組細(xì)胞接種3個(gè)復(fù)孔。計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=克隆數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組HT-29細(xì)胞，用胰酶消化，培養(yǎng)基懸浮,取1×105～5×105個(gè)細(xì)胞用PBS洗滌2次(1 000 r/min離心5 min),加Binding Buffer 100 μL懸浮細(xì)胞，每管中加7-aad 5 μL和PE染料5 μL，再加Binding Buffer 400 μL混勻。同時(shí)，設(shè)空白對(duì)照(不加染料)，單染管(分別用7-aad 5 μL和PE 5 μL染料)室溫避光反應(yīng)15 min。進(jìn)行流式細(xì)胞凋亡率檢測(cè)，結(jié)果用總凋亡的百分比表示。細(xì)胞周期的檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組HT-29細(xì)胞，用胰酶消化，培養(yǎng)基懸浮,取1×105～5×105個(gè)細(xì)胞用PBS洗滌2次(1 000 r/min離心5 min),棄上清，用PBS 0.5 mL重懸細(xì)胞， 70%乙醇5 mL固定，4 ℃過夜。1 000 r/min,離心15 min,棄上清，用PBS洗滌2次,棄上清，加緩沖液500 μL，加RNase 10 μL,37 ℃水浴30 min,加PI 25 μL,避光反應(yīng)30 min，進(jìn)行流式細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.8 各組HT-29細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)量的檢測(cè) 采用Western blotting法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組HT-29細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍，配制含抑制劑的蛋白抽提試劑(RIPA抽提試劑1 mL中加入蛋白酶抑制劑PMSF 10 μL),1×106～5×106個(gè)細(xì)胞,輕輕搖動(dòng)5 min，用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮下來，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮液至離心管中，12 000 r/min離心15 min，取上清，即為所提的蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA曲線計(jì)算目的蛋白濃度，5×蛋白上樣緩沖液SDS-PAGE 50 μL加目的蛋白200 μL，95 ℃煮沸5 min，-20 ℃保存或后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按比例配制12%分離膠和5%濃縮膠，根據(jù)目的蛋白濃度加上樣量，跑電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→孵一抗過夜→回收一抗→洗膜(10 min×4次)→孵二抗(1 h)→洗膜(10 min×4次)→ECL化學(xué)成像發(fā)光，觀察目的蛋白表達(dá)。用目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞株和FHC中SPRY4-IT1 mRNA的表達(dá)量比較 FHC、HT-29、HCT-116、SW480、SW620、Caco-2細(xì)胞株中SPRY4-IT1 mRNA的表達(dá)量分別為1.00、36.76±7.98、4.49±0.38、19.88±4.88、15.46±3.30、8.81±1.81。相對(duì)于FHC，其他細(xì)胞中的表達(dá)均升高，以HT-29細(xì)胞株為著(P均<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞中SPRY4-IT1 mRNA的表達(dá)量比較 上調(diào)組、下調(diào)組、空白對(duì)照組、無義轉(zhuǎn)染組SPRY4-IT1 mRNA的表達(dá)量分別為5.81±0.33、0.24±0.03、1.00、1.03±0.04，相對(duì)于無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組，上調(diào)組SPRY4-IT1 mRNA表達(dá)量升高(P均<0.01)，下調(diào)組SPRY4-IT1 mRNA表達(dá)量下降(P均<0.01)；無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組比較，P>0.05。

2.3 各組細(xì)胞增殖活力的比較 上調(diào)組、下調(diào)組、無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組第1、2、3、4、5天OD值分別為0.45±0.01、0.85±0.01、1.19±0.01、2.15±0.02、2.52±0.02，0.44±0.01、0.60±0.01、0.62±0.01、0.65±0.01、0.82±0.01，0.46±0.01、0.66±0.01、0.77±0.03、1.12±0.02、1.23±0.03，0.45±0.03、0.66±0.01、0.77±0.03、1.18±0.01、1.28±0.01。相對(duì)于無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組，除第1天外，其余各時(shí)間上調(diào)組細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)(P均<0.01)，下調(diào)組細(xì)胞增殖活力下降(P均<0.05)；無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組比較，P均>0.05。

2.4 各組細(xì)胞克隆形成率比較 上調(diào)組、下調(diào)組、無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組克隆形成率分別為61.67%±2.91%、13.00%±1.16%、28.33%±1.76%、30.33%±1.67%。相對(duì)于無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組，上調(diào)組細(xì)胞克隆形成率升高(P均<0.01)，下調(diào)組細(xì)胞克隆形成率下降(P均<0.01)；無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組比較，P>0.05。

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較 上調(diào)組、下調(diào)組、無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組總凋亡率分別為0.69%±0.08%、3.34%±0.21%、1.60%±0.22%、1.29%±0.16%。相對(duì)于無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組，上調(diào)組細(xì)胞凋亡率降低(P均<0.05)，下調(diào)組細(xì)胞凋亡率升高(P均<0.01)；無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組比較，P﹥0.05。

2.6 各組細(xì)胞周期比較 上調(diào)組細(xì)胞在G0/G1期、S期、G2/M期所占百分比分別為77.20%±0.81%、6.93%±0.51%、13.76%±0.36%，下調(diào)組分別為71.41%±0.99%、12.86%±1.24%、13.53%±1.76%，無義轉(zhuǎn)染組分別為73.93%±1.20%、10.62%±1.01%、15.01%±0.60%，空白對(duì)照組分別為72.98%±0.44%、10.77%±0.46%、13.25%±0.44%。各組之間各期細(xì)胞所占百分比比較，P均﹥0.05。

2.7 各組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量比較 上調(diào)組、下調(diào)組、無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組Bcl-2蛋白表達(dá)量分別為1.31±0.07、0.37±0.03、0.70土0.01、0.71±0.09，Bax蛋白表達(dá)量分別為0.51±0.01、1.42±0.05、0.82±0.01、0.71±0.02。相對(duì)于空白對(duì)照組、無義轉(zhuǎn)染組，上調(diào)組Bcl-2蛋白表達(dá)量增多(P均<0.01)，Bax蛋白表達(dá)量減少(P均<0.01)；下調(diào)組Bcl-2蛋白表達(dá)量減少(P均<0.05)，Bax蛋白表達(dá)量增多(P均<0.01)；無義轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組比較，P均﹥0.05。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),LncRNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，影響腫瘤患者的治療及預(yù)后，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡等過程,但眾多LncRNA的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制仍不是很清晰，需要進(jìn)一步研究。LncRNA SPRY4-IT1是Sprouty4內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1，長(zhǎng)度為687個(gè)核苷酸，其基因庫(kù)編碼：GC05M142318，位于5q31.3,源自于Sprouty4基因。Khaitan等[10]在2011年首次報(bào)道SPRY4-IT1在黑色素瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，并調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，SPRY4-IT1在結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29中相對(duì)表達(dá)最高。上調(diào)HT-29細(xì)胞SPRY4-IT1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和克隆形成，抑制其凋亡；而下調(diào)SPRY4-IT1的表達(dá)抑制HT-29的增殖和克隆形成，促進(jìn)其凋亡。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因簡(jiǎn)稱Bcl-2,是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的基因，它具有抑制凋亡的作用，此外Bcl-2可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗作用；Bax是另一類與凋亡相關(guān)的蛋白因子，主要表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。上調(diào)HT-29細(xì)胞SPRY4-IT1的表達(dá)，可促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞凋亡；下調(diào)HT-29細(xì)胞SPRY4-IT1的表達(dá)，可抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax表達(dá)，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。因此，我們認(rèn)為SPRY4-IT1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表現(xiàn)為癌基因特性，敲低HT-29細(xì)胞中SPRY4-IT1的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，促進(jìn)其凋亡，為將來結(jié)直腸癌臨床診斷和分子靶向治療提供理論依據(jù)，SPRY4-IT1有可能成為結(jié)直腸癌分子靶向治療重要靶點(diǎn)。

[1] Blake WJ, Kaem M, Cantor CR, et al. Noise in eukaryotic gene expression[J]. Nature， 2003，422(6932)：633-637.

[2] Ravasi T, Suzuki H, Pang KC, et al. Experimental validation of the regulated expression of large number of non-coding RNAs from the mouse genome[J]. Genome Res， 2006，16(1)：11-19.

[3] Ponting CP, Oliver PL, Reik W. Evolution and functions of long non-coding RNAs[J]. Cell， 2009，136(4)：629-641.

[4] Loewer S, Cabili MN, Guttman M, et al. Large intergenic non-coding RNA-RoR modulates reprogramming of human inducing pluripotent stem cells[J]. Nat Genet， 2010,42(12):1113-1117.

[5] Tsai MC, Spitale RC, Chang HY. Long intergenic noncoding RNAs: new links in cancer progression[J]. Cancer Res， 2011，71(1):3-7.

[6] Guo Q, Zhao Y, Chen J, et al. BRAF-activated long non-coding RNA contributes to colorectal cancer migration by inducing epithelial-mesenchymal transition[J]. Oncol Lett， 2014，8(2):869-875.

[7] Kogo R, Shimamura T, Mimori K, et al. Long noncoding RNA HOTAIR regulates polycomb-dependent chromatin modification and is associated with poor prognosis in colorectal cancers[J]. Cancer Res， 2011，71(20):6320-6326.

[8] Zheng HT, Shi DB, Wang YW, et al. High expression of lncRNA MALAT1 suggests a biomarker of poor prognosis in colorectal cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2014，7(6)：3174-3181.

[9] Ye Z, Zhou M, Tian B, et al. Expression of LncRNA-CCAT1,E-cadherin and N-cadherin in colorectal cancer and its clinical significance[J]. Int J Clin Exp Med， 2015，8(3)：3707-3715.

[10] Khaitan D, Dinger ME, Mazar J, et al. The melanoma-upregulated long noncoding RNA SPRY4-IT1 modulates apoptosis and invasion[J]. Cancer Res， 2011，71(11)：3852-3862.

[11] Liu H, Lv Z, Guo E. Knockdown of long noncoding RNA SPRY4-IT1 suppresses glioma cell proliferation, metastasis and epithelial-mesenchymal transition[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2015，8(8)：9140-9146.

[12] Xie HW, Wu QQ, Zhu B, et al. Long noncoding RNA SPRY4-IT1 is upregulated in esophageal squamous cell carcinoma and associated with poor prognosis[J]. Tumour Biol， 2014，35(8)：7743-7754.

[13] Peng W, Wu G, Fan H, et al. Long noncoding RNA SPRY4-IT1 predicts poor patient prognosis and promotes tumorigenesis in gastric cancer[J]. Tumour Biol， 2015，36(9)：6751-6758.

[14] Zhang HM , Yang FQ , Yan Y, et al. High expression of long non-coding RNA SPRY4-IT1 predicts poor prognosis of clear cell renal cell carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2014，7(9)：5801-5809.

[15] Zhao XL, Zhao ZH, Xu WC, et al. Increased expression of SPRY4-IT1 predicts poor prognosis and promotes growth and metastasis in bladder cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2015,8(2):1954-1960.

Influence of long non-coding RNA SPRY4-IT1 on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells HT-29

ZHANGDebao,XINGChungen

(TheSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,China)

Objective To explore the influence and mechanism of long non-coding RNA (Lnc RNA) SPRY4-IT1 on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells HT-29. Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was performed to detect the expression of LncRNA SPRY4-IT1 in the colorectal cancer cell lines (HT-29, HCT-116, SW-480, SW-620, Caco-2) and the normal intestinal epithelial cell line FHC. We selected HT-29 cells with the relative highest expression of SPRY4-IT1 for this study. Lentivirus-mediated recombinant plasmid target SPRY4-IT1 was constructed and transfected into colorectal cancer HT-29 cells to establish the stably transfection cells of over-expression (up-regulation group) and interference (knock-down group). Meanwhile, the negative control group and blank control group were established. qRT-PCR was used to detect the expression of SPRY4-IT1 mRNA in HT-29 cells of each group. CCK-8 was applied to detect the proliferation of HT-29. cells Clone formation assay was used to test the colony forming efficincy of HT-29 cells. Flow cytometry was applied to detect the apoptosis and cell cycle of HT-29 cells. Western blotting was used to testify the expression of Bax and Bcl-2.Results The relative expression of LncRNA SPRY4-IT1 in colorectal cancer cell lines (HT-29, HCT-116, SW-480, SW-620, Caco-2) was significantly higher than that in the normal intestinal epithelial cell line FHC, and the expression of SPRY4-IT1 was the highest in HT-29 cells (allP<0.05). Compared with the negative control group and blank control group, the expression of SPRY4-IT1 mRNA, the proliferation and the colony forming efficincy of HT-29 cells in the up-regulation group were enhanced, and apoptosis rate was decreased (P<0.05 orP<0.01), and the opposite trend was observed in the knock-down group (P<0.05 orP<0.01). There was no significant difference in cell cycle of HT-29 cells among these groups (allP>0.05). Compared with the negative control group and blank control group, the expression of Bcl-2 was increased and Bax was decreased in HT-29 cells of the up-regulation group (P<0.05 orP<0.01), the expression of Bcl-2 was decreased and Bax was increased in HT-29 cells of the knock-down group (allP<0.01). Conclusion LncRNA SPRY4-IT1 may significantly accelerate proliferation and restrain apoptosis of colorectal cancer cell via promoting the expression of Bax and depressing the expression of Bcl-2.

colorectal cancer cells HT-29; long non-coding RNA; SPRY4-IT1; cell proliferation; apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81672970)。

張德保(1979-)，男，碩士研究生在讀，主要研究方向?yàn)槠胀饪莆改c道疾病。E-mail：18706202833@163.com

邢春根(1965-)，男，主任醫(yī)師(教授)，主要研究方向?yàn)槠胀饪莆改c道腫瘤。E-mail:xingcg@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.001

R735.3

A

1002-266X(2017)13-0001-04

2017-01-12)