綠潮藻滸苔微生物高效降解及生物乙醇制備

王淑賢, 韋章良, 賈 睿, 張建恒, 霍元子, 于克鋒, 何培民

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綠潮藻滸苔微生物高效降解及生物乙醇制備

王淑賢1, 2, 韋章良3, 賈 睿1, 2, 張建恒4, 霍元子1, 2, 于克鋒1, 2, 何培民1, 2

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)水域環(huán)境生態(tài)上海高校工程研究中心, 上海 201306; 3. 中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東廣州510301; 4. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院, 上海 201306)

從綠潮藻暴發(fā)海域的底泥和腐爛滸苔()中, 篩選出一株可高效降解滸苔纖維素的微生物菌株(F菌株), 通過剛果紅染色實(shí)驗(yàn)以及真菌的ITS分析, 鑒定為曲霉屬真菌。以滸苔為誘導(dǎo)培養(yǎng)基制備F菌株的粗酶液, 測(cè)得其濾紙纖維素酶活為34.79 U/mL。在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中, 當(dāng)酶解條件為6%的粗酶液添加量、反應(yīng)溫度為38℃、反應(yīng)時(shí)間為60 h、pH為6.8時(shí), 滸苔纖維素降解效果最好, 酶解液發(fā)酵乙醇產(chǎn)量最高達(dá)到28.98 g/L。

滸苔(); 纖維素降解菌; 發(fā)酵; 生物乙醇

隨著可利用化石燃料的逐漸減少以及化石燃料燃燒時(shí)所帶來的環(huán)境問題, 探索可再生、清潔無污染的綠色能源已越來越受到世界人們的廣泛關(guān)注[1]。目前研究的可再生清潔燃料主要有生物柴油、生物乙醇、生物丁醇以及生物沼氣等[2]。美國從2007年開始啟動(dòng)了多項(xiàng)生物燃料工程項(xiàng)目, 帶動(dòng)了藻類生物燃料開發(fā)熱潮[3]。然而以海洋藻類生物質(zhì)開發(fā)生物能源在國內(nèi)的研究還比較少。溫順華[4]、蔣媛媛[5]分別對(duì)馬尾藻和銅藻制備生物乙醇有過實(shí)驗(yàn)探究, 但乙醇產(chǎn)量均不高, 僅為9.2%和7.8%。

第一代燃料乙醇由于使用玉米、大豆等經(jīng)濟(jì)作物導(dǎo)致糧食價(jià)格上漲而被迫放棄[6]; 第二代燃料乙醇由于木質(zhì)素處理難題, 一直止步不前; 而以海洋藻類生物質(zhì)為原料的第三代燃料乙醇[7], 因其生長(zhǎng)周期短、生長(zhǎng)速率快、不含木質(zhì)素且生物量巨大[8]而受到廣大研究學(xué)者的關(guān)注。

自2007年起, 我國已連續(xù)8年暴發(fā)綠潮自然災(zāi)害。2008年, 僅青島海域打撈起的綠潮藻滸苔()就近120萬t[9]; 福建沿海每年的綠潮暴發(fā)量多于10萬t[10], 專家認(rèn)為黃海綠潮每年的總暴發(fā)量在千萬噸以上[11]。綠潮的暴發(fā), 除了引起魚蝦死亡和水質(zhì)惡化外, 更大的問題在于其巨大的生物量難以處理, 無處填埋[12], 并且打撈起的滸苔短時(shí)間內(nèi)就會(huì)腐爛發(fā)臭, 帶來嚴(yán)重的環(huán)境問題。滸苔中纖維素和半纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到33.7%[13], 使其成為很好的第三代燃料乙醇的生產(chǎn)原料。目前, 國內(nèi)對(duì)藻類纖維素的處理方法主要有物理法[14]和化學(xué)法[15]以及生物酶法[16]。物理法和化學(xué)法處理藻類纖維素對(duì)設(shè)備要求高, 反應(yīng)不易控制, 并且處理后的產(chǎn)物容易造成環(huán)境污染。因此, 如何正確處置每年暴發(fā)的大量綠潮藻滸苔和有效降低藻類生物質(zhì)發(fā)酵乙醇的生產(chǎn)成本已成為我國海洋科學(xué)領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容。本研究將化石燃料的短缺現(xiàn)狀與我國暴發(fā)綠潮藻巨大生物量處理問題相結(jié)合, 以綠潮藻滸苔為發(fā)酵原料, 利用實(shí)驗(yàn)室篩選到的產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行酶法降解滸苔, 為探究第三代燃料乙醇的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻粉

滸苔藻樣采自2014年5月江蘇省大豐市沿海漂浮滸苔。將采回的新鮮滸苔, 用干凈海水沖洗3遍, 去除泥沙、雜質(zhì)及其他雜藻, 烘干粉碎后, 過80目篩, 自封袋保存于陰涼處備用。

1.2 培養(yǎng)基

選擇培養(yǎng)基: 纖維素粉8.0 g, NaNO31.0 g, KCl 0.5 g, Na2HPO41.2 g, KH2PO41.0 g, MgSO40.5 g, 酵母粉0.5 g, 水解酪蛋白 0.5 g, 蒸餾水1 000 mL, 瓊脂粉18.0 g, 自然pH。

鑒別培養(yǎng)基: 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)5.0 g, 酵母膏1.0 g, KH2PO40.25 g, 土豆汁100 mL, 瓊脂粉18.0 g, 蒸餾水1 000 mL, 自然pH。

滸苔纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基(細(xì)菌): 滸苔粉8.0 g, 蛋白胨2.0 g, 酵母粉5.0 g, NaCl 5.0 g, 蒸餾水1 000 mL,自然pH。

滸苔纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基(真菌): 滸苔粉6.0 g, 葡萄糖4.0 g, 蛋白胨2.0 g, MgSO4·7H2O 5.0 g, KH2PO40.5 g, 1%孟加拉紅水3.3 mL, 3%氯霉素液3.0 mL, 蒸餾水1 000 mL, 自然pH。

酵母菌活化培養(yǎng)基: 酵母粉 10 g, 蛋白胨 20 g, 葡萄糖 20 g, 蒸餾水1 000 mL, 自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基: 滸苔粉200 g, 2%硫酸1 000 mL, 120℃處理60 min, 調(diào)pH中性。

除發(fā)酵培養(yǎng)基外, 上述培養(yǎng)基均1×105Pa滅菌30 min后使用, 為防止糊化, 酵母菌活化培養(yǎng)基115℃滅菌15 min。

1.3 纖維素分解菌株的篩選與鑒定

1.3.1 纖維素分解菌的初篩

在滸苔漂浮的海域和腐爛滸苔的底泥中, 分別采樣帶回實(shí)驗(yàn)室, 同時(shí)從采回的新鮮滸苔中, 稱取20 g濕滸苔于500 mL燒杯中, 加入200 mL自然海水, 用紗布封口, 28℃條件下自然腐爛10 d[17]。

1.3.2 纖維素分解菌的分離與鑒定

將腐爛的滸苔底泥和樣品液進(jìn)行梯度稀釋, 取稀釋至10–6樣品液150mL涂布于選擇培養(yǎng)基平板中, 置于恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)3 d, 挑取能夠在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的單菌落劃線分離, 轉(zhuǎn)接到鑒定培養(yǎng)基平板上。

剛果紅染色初步鑒定: 在長(zhǎng)出菌落的鑒定培養(yǎng)基中, 通過剛果紅染色實(shí)驗(yàn)[18]后水解圈的大小, 初步鑒定具有纖維素分解能力的菌株, 并挑出單菌落劃線分離, 純培養(yǎng)。

細(xì)菌的16s rDNA鑒定: 篩選到的菌株純化后, 用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒SK8255提取菌株的總DNA。使用通用引物7F: 5′-CAGAG TTTGATCCTGGCT-3′和1540R: 5′-AGGAGGTGATC CAGCCGCA-3′進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為: Template (基因組DNA20~50 ng/mL) 0.5mL, 5×Bufffer 2.5mL, dNTP 1mL, 酶0.2mL, 引物各0.5mL, 加雙蒸水至25mL。PCR循環(huán)條件: 98℃預(yù)變性30 min, 98℃ 25 s, 55℃ 25 s, 72℃ 1 min, 30個(gè)循環(huán), 后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物, 回收后與pMD18-T載體鏈接, 挑選陽性克隆質(zhì)粒, 酶切后送上海生工公司測(cè)序, 將測(cè)序結(jié)果用NCBI的Blast程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)。

真菌的ITS鑒定: 篩選到的菌株純化后, 按上海生工公司提供的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒SK8259提取菌株的總DNA。使用菌種鑒定通用引物, NS1: 5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和NS6: 5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′, 由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系為: Template(基因組DNA20~50 ng/mL) 0.5mL, 10×Bufffer 2.5mL, dNTP 1mL, 酶0.2mL, 引物各0.5mL, 加雙蒸水至25mL。PCR循環(huán)條件: 94℃預(yù)變性4 min, 94℃ 45s, 55℃ 45 s, 72℃ 1 min, 30個(gè)循環(huán), 后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物, 回收后與pMD18-T載體鏈接, 挑選陽性克隆質(zhì)粒, 酶切后送上海生工公司測(cè)序, 將測(cè)序結(jié)果用NCBI的Blast程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)。

1.4 粗酶液的提取

選取1.3.2中篩選到的菌株, 制取粗酶液。

粗酶液1: 常用基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基和馬丁培養(yǎng)基, 培養(yǎng)5 d, 轉(zhuǎn)速為170 r/min, 溫度為28 ℃。5 d后, 取出菌液, 6 000 r/min離心8 min, 上清液為粗酶液。

粗酶液2: 用滸苔纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基, 培養(yǎng)5 d,轉(zhuǎn)速為170 r/min, 溫度為28℃。5 d后, 取出菌液, 6 000 r/min離心8 min, 上清液為粗酶液。

1.5 菌株纖維素酶活性檢測(cè)

取1.4中得到的粗酶液, 稀釋10倍后, 按照文獻(xiàn)[19]對(duì)篩選到的產(chǎn)酶菌株進(jìn)行濾紙纖維素酶活檢測(cè)。酶活定義在37℃, pH5.5, 反應(yīng)時(shí)間為60 min的條件下, 每分鐘降解濾紙釋放1mmol葡萄糖所需的酶量, 定義為一個(gè)濾紙纖維素酶活單位, 以U表示。實(shí)驗(yàn)中濾紙纖維素酶活以表示, 單位為酶活性單位(U/mL),按下式計(jì)算:

=(/×)×1000×(1)

式(1)中

——實(shí)驗(yàn)中纖維素酶的活性, 單位為酶活性單位(U/mL);

——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的葡萄糖的質(zhì)量, 單位為毫克(mg);

——葡萄糖的摩爾質(zhì)量, 180.2 g/mol;

——酶解反應(yīng)時(shí)間, 單位為min;

1 000——轉(zhuǎn)化因子, 1 mmol=1 000mmol;

——實(shí)驗(yàn)的總稀釋倍數(shù)。

1.6 菌株纖維素酶降解滸苔發(fā)酵效果探究

選取實(shí)驗(yàn)中篩選到的產(chǎn)酶活性高的菌株, 制備粗酶液, 通過粗酶液添加量, 反應(yīng)溫度, 反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)pH4方面分別探究滸苔制備乙醇的最佳效果(表1)。其中, 發(fā)酵五碳糖的酵母菌32868和發(fā)酵六碳糖的酵母菌1043, 由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心提供, 活化后, 各加入5%的酵母菌種子液進(jìn)行發(fā)酵, 無菌取樣, 測(cè)定乙醇濃度, 同時(shí)按DNS法對(duì)發(fā)酵液中的還原糖進(jìn)行檢測(cè), 每組3個(gè)平行。

表1 不同條件下滸苔發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1.7 乙醇濃度的測(cè)定

乙醇濃度檢測(cè)使用SBA-40E生物傳感分析儀測(cè)定。乙醇標(biāo)準(zhǔn)液配制: 50mL無水乙醇溶于100 mL蒸餾水中, 現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 結(jié)果

2.1 纖維素分解菌的篩選結(jié)果

通過選擇培養(yǎng)基初篩和剛果紅染色實(shí)驗(yàn)初步鑒定,共篩選到2株產(chǎn)纖維素酶菌株, 分別是滸苔漂浮海域中篩選到的菌株(H菌)和實(shí)驗(yàn)室條件下腐爛滸苔中篩選到的菌株(F菌), H菌透明水解圈平均直徑為1.0 cm±0.2 cm, F菌透明水解圈平均直徑1.3 cm± 0.2 cm。從微生物形態(tài)學(xué)上觀察, H菌株為細(xì)菌, F菌株為真菌。如圖1所示。

2.2 分子鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物得到的蛋白質(zhì)電泳圖如下(圖2), H菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物得到的目的片段長(zhǎng)度約為1.5kb左右, 與16SrDNA序列長(zhǎng)度一致。將得到的產(chǎn)物克隆后測(cè)序, 得到1431 bp長(zhǎng)度的序列, 與GenBank 庫中已有的細(xì)菌16S rDNA 序列Blast比對(duì)后, 發(fā)現(xiàn)其與芽孢桿菌屬同源度高達(dá)99%。F菌株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序得到1308 bp, 其在GenBank中的比對(duì)結(jié)果與曲霉屬真菌()高度相似, 選取最相近的10個(gè)序列, 用mega4.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 如圖3所示系統(tǒng)進(jìn)化樹, 其與(AB00841.1)最為接近。該序列在GenBank的登錄號(hào)為: KX272754。根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)鑒定, 初步得到F菌株為曲霉屬真菌。

M: DNA Marker; 1: H菌株P(guān)CR產(chǎn)物; 2: F菌株P(guān)CR產(chǎn)物

M: DNA marker; 1: strain H PCR product; 2: strain F PCR product

2.3 菌株纖維素酶活檢測(cè)結(jié)果

濾紙法纖維素酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中, 得到的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為= 0.846–0.028,2= 0.999。H菌株和F菌株的兩種粗酶液酶活如(圖4)所示。滸苔纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基制取的粗酶液, 即H2和F2酶活分別高于H1和F1酶活; 同一培養(yǎng)基所得到的粗酶液中, F菌株又高于H菌株, F菌株最高酶活達(dá)到34.79 U/mL。這與剛果紅染色實(shí)驗(yàn)中水解圈大小的結(jié)果是一致的。F菌株現(xiàn)保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心, 保藏號(hào): CGMCC NO.11767。

2.4 不同條件下滸苔發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

纖維素酶活實(shí)驗(yàn)證明F菌株的產(chǎn)酶能力較強(qiáng), 因此在滸苔發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中選用F菌株粗酶液對(duì)滸苔降解發(fā)酵, 從圖5A中可以看到, 對(duì)照組中沒有添加粗酶液, 仍檢測(cè)到乙醇, 但乙醇含量非常低。隨著粗酶的增加, 還原糖含量增加, 同時(shí)乙醇產(chǎn)量也上升。當(dāng)粗酶液的添加量達(dá)到6%時(shí), 還原糖含量不再增加, 但是乙醇產(chǎn)量繼續(xù)升高。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5 B)可知, 在溫度低于38℃時(shí), 隨著溫度的升高, 乙醇產(chǎn)量逐步上升。當(dāng)溫度達(dá)到38℃時(shí), 乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高, 為28.98 g/L, 后溫度繼續(xù)升高, 乙醇產(chǎn)量反而下降。在發(fā)酵時(shí)間達(dá)到60 h時(shí)(圖5 C), 乙醇產(chǎn)量不再隨著酶解時(shí)間的增加而提高, 發(fā)酵后期, 乙醇濃度不再變化, 還原糖含量仍在繼續(xù)下降, 但下降并不劇烈。pH為6.8時(shí), 乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高, 但還原糖濃度并不升高(圖5 D)。

3 討論

海洋藻類作為第三代燃料乙醇的生產(chǎn)原料, 具有非常強(qiáng)大的市場(chǎng)潛力[20], 但是藻體中存在的纖維素、半纖維素是阻礙藻類生物質(zhì)進(jìn)行規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)乙醇的瓶頸。纖維素是D-葡萄糖以β-1, 4糖苷鍵為基環(huán)組成的大分子多糖[21], 通常與半纖維、木質(zhì)素形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜穩(wěn)定的大分子物質(zhì)[22]。自然界中產(chǎn)纖維素酶微生物包括真菌, 細(xì)菌和放線菌。不同微生物所產(chǎn)纖維素酶的結(jié)構(gòu)和功能也相差很大, 纖維素酶根據(jù)其催化反應(yīng)功能的不同可分為內(nèi)切葡聚糖酶(1, 4-β-D-glucan glucanohydrolase)、外切葡聚糖酶(1, 4-β-D-glucan cellobilhydrolase)和β-葡聚糖苷酶(β-1, 4- glucosidase)。大多數(shù)的細(xì)菌和放線菌產(chǎn)酶能力較低, 所產(chǎn)酶多數(shù)都是胞內(nèi)酶, 很難分泌到細(xì)胞外對(duì)纖維素的降解起作用。20世紀(jì)90年代末, 學(xué)者們發(fā)現(xiàn)曲霉屬真菌產(chǎn)生的多為胞外酶, 并且產(chǎn)酶能力也高于細(xì)菌和放線菌[23]。本研究從自然界中篩選到的F菌株是曲霉屬的一種, 根據(jù)水解圈的大小, 可以初步判斷出F菌分解纖維素的能力比H菌稍強(qiáng), 在酶活檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)中, F菌株最高酶活達(dá)到34.79 U/mL, 也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。用F菌株所產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行滸苔的降解發(fā)酵, 一方面避免了因產(chǎn)胞內(nèi)酶而降低降解效果; 另一方面, 由于F菌株所產(chǎn)纖維素酶為胞外酶, 所以粗酶液的制備用過濾、離心等簡(jiǎn)單方法就可以獲得, 操作簡(jiǎn)便。與此同時(shí), 傳統(tǒng)的物理法和化學(xué)法在降解纖維素過程中會(huì)形成大量的副產(chǎn)物, 對(duì)后續(xù)的發(fā)酵也有很強(qiáng)的抑制作用, 使乙醇發(fā)酵產(chǎn)率偏低, 并伴有環(huán)境污染, 而使用菌株所產(chǎn)纖維素酶降解滸苔, 不僅降低了對(duì)反應(yīng)設(shè)備的要求, 而且反應(yīng)溫和, 對(duì)環(huán)境無污染, 同時(shí)不形成副產(chǎn)物, 可避免乙醇產(chǎn)率偏低等問題。

本研究中用篩選到的F菌自產(chǎn)纖維素酶對(duì)滸苔進(jìn)行降解, 并優(yōu)化了其酶解液發(fā)酵乙醇的最佳條件, 使乙醇最高產(chǎn)量達(dá)到28.98 g/L, 比劉正坤[24]實(shí)驗(yàn)中的乙醇產(chǎn)量(13.2 g/L)高15.78 g/L。Song-Mok Lee[25]等在用微生物同步糖化發(fā)酵海帶的研究中指出, 乙醇最高產(chǎn)量為2.59 g/L, 其研究中乙醇產(chǎn)量偏低的原因在于微生物所產(chǎn)酶為胞內(nèi)酶, 因此降解效果不明顯, 導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量較低。而本實(shí)驗(yàn)中的F菌株屬曲霉屬真菌, 其所產(chǎn)纖維素酶可經(jīng)低溫離心快速獲得, 保證了酶的活性, 能夠高效率降解纖維素, 獲得較高含量的還原糖類, 因此在后續(xù)的發(fā)酵試驗(yàn)中, 酵母菌可利用的還原性糖含量較高, 發(fā)酵產(chǎn)物乙醇產(chǎn)量也繼而提高。本實(shí)驗(yàn)中乙醇產(chǎn)量高于其他研究結(jié)果的另一個(gè)原因在于, 實(shí)驗(yàn)中用稀酸前處理滸苔, 即用2%的硫酸120℃、1h處理后再進(jìn)行粗酶液降解, 稀酸和高溫對(duì)纖維素本身結(jié)構(gòu)就有一定的破壞, 之后再使用粗酶液進(jìn)行降解, 使得降解效果比單一直接使用粗酶液效果更好, 因此, 乙醇的最高產(chǎn)量可達(dá)28.98 g/L。

海洋藻類生物質(zhì)產(chǎn)量巨大, 以海洋藻類生物質(zhì)為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是未來能源探索的有效途徑[26]。但是從藻類轉(zhuǎn)變生物乙醇的過程, 還存在一系列尚待完善的地方, 僅僅依賴篩選自然界中的野生型菌株產(chǎn)酶進(jìn)行海洋藻類生物質(zhì)的降解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。美國藻醇(Algenol)公司利用藍(lán)藻光合產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)出乙醇已進(jìn)入室外產(chǎn)業(yè)化論證階段[27]。根據(jù)這項(xiàng)研究結(jié)果, 未來在大型綠藻滸苔的發(fā)酵研究中, 同樣可以通過開發(fā)產(chǎn)酶活性高的基因工程菌進(jìn)行滸苔纖維素的高效降解, 同時(shí)選擇高效發(fā)酵菌種以及優(yōu)化發(fā)酵工藝流程, 可更大程度地提高發(fā)酵產(chǎn)量, 使藻類資源得到更充分的利用。

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Screening and characterization of a newly isolated strain for microbiological degradation ofand bioethanol production

WANG Shu-xian1, 2, WEI Zhang-liang3, JIA Rui1, 2, ZHANG Jian-heng4, HUO Yuan-zi1, 2, YU Ke-feng1, 2, HE Pei-min1, 2

(1. College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Water Environment and Ecology Engineering Center of Shanghai Institute of Higher Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China; 4. College of Marine Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

has been the dominant species in the huge annual biomass accumulation during green algae bloom in Yellow Sea since 2007. This species can be used for energy utilization by fermentation under certain conditions. In this study, we identified ahighlyefficient cellulose-decomposing microorganismbyscreeningthe rotten algae and employedit as a raw material to manufacture bioethanol. We studied its cellulose activity and the ability to decomposeatdifferentreaction temperatures, times.pH, and dosages of crude enzyme. We identified the strain with highest efficiency in cellulose-decomposition using Congo red staining method and ITSand termed it as theF strain (34.79U/mL). We also foundthatthe optimum conditionsfor the fermentation ofwere as follows: crude enzyme, 6%; treating temperature, 38°C; treating time, 60 h; and pH, 6.8. Under these optimum conditionsbioethanol yield of up to 28.98g/Lwas achieved.

; cellulose-decomposing microorganisms; fermentation; bioethanol

P745

A

1000-3096(2017)01-0076-07

10.11759/hykx20160423003

2016-04-23;

2016-06-29

國家自然科學(xué)基金(41576163); 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC1402105); 國家海洋局公益性科研專項(xiàng)(201205010, 201105023); 科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAC07B023)

王淑賢(1990-), 女, 碩士研究生, 主要研究方向?yàn)楹Ｔ遒Y源化利用, 電話: 15800728178, Email: Wangshuxian1234567@163.com;何培民, 通信作者, Email: pmhe@shou.edu.cn; 于克鋒, 通信作者, Email: kfyu@shou.edu.cn

Apr. 23, 2016

[Nation Natural Science Foundation of China, No.41576163; The National Key Research and Development Plan, No.2016YFC1402105; Public Science and Technology Research Funds Projects of the Ocean, No.201205010, No.201105023; National Science & Technology Pillar Program, No.2012BAC07B03]

(本文編輯: 康亦兼)