李帥+劉榮梅+李海濤+高繼國

摘要：營養(yǎng)期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal protein，簡稱VIP）是蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在營養(yǎng)期表達(dá)的一類新型殺蟲毒蛋白，該蛋白的發(fā)現(xiàn)使得Bt殺蟲劑在殺蟲活性、殺蟲范圍方面得到很大突破。首次比較我國不同氣候類型（熱帶：海南省，亞熱帶：廣西壯族自治區(qū)，溫帶：黑龍江?。┑腂t菌株和vip基因的分布情況。結(jié)果表明，從海南省841份土樣中分離出156株Bt菌（18.55%），從廣西地區(qū)1 420份土樣中分離出356株Bt菌（25.07%），從黑龍江省1 010份土樣中分離出167株Bt菌（16.53%）；從海南省的156株Bt菌中鑒定出22個vip基因（占14.1%），從廣西地區(qū)的356株Bt菌中鑒定出2個vip基因（占5.62%），然而，從黑龍江省的156株Bt菌中沒有鑒定出vip基因（0%）。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，簡稱PCR）方法成功克隆出1個[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]的全長基因并獲得登錄號KT792883，將該基因插入到表達(dá)載體pET-21b中，轉(zhuǎn)化菌株Rosetta（DE3），在低溫條件下表達(dá)88 ku的蛋白，將該蛋白進(jìn)行生物活性測定，結(jié)果顯示，該蛋白對甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）具有較好的殺蟲活性，LC50為5.124 ng/mg，對棉鈴蟲（Heliothis armigera）活性較低，LC50為870.1 ng/mg。研究結(jié)果顯示，Bt菌株和vip基因的分布有地域性差異，在溫度較高的熱帶、亞熱帶地區(qū)有比較豐富的Bt菌株和vip基因資源。研究將有利于充分利用土壤中的Bt菌株，分離具有自主知識產(chǎn)權(quán)和重要應(yīng)用價值的新型vip抗蟲基因，這將會為研究新型殺蟲蛋白、延緩害蟲抗性問題提供有益幫助。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；vip基因；鑒定；氣候類型；生物活性測定

中圖分類號： Q938.1+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）04-0018-04

蟲害是影響糧食產(chǎn)量的一個重要因素，目前廣泛應(yīng)用的化學(xué)殺蟲劑對非靶目標(biāo)有很大的毒性且不易降解。生物殺蟲劑可作為化學(xué)殺蟲劑的替代品，蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）便是目前廣泛應(yīng)用的環(huán)境友好型生物殺蟲劑[1]。蘇云金芽孢桿菌在生長代謝過程中可以產(chǎn)生多種對昆蟲有致病性的殺蟲毒素，其中δ-內(nèi)毒素（deltaendotoxin）以蛋白質(zhì)結(jié)晶的結(jié)構(gòu)形式存在于細(xì)胞內(nèi)，并隨芽孢的釋放而釋放到胞外（如Cry、Cyt）。晶體蛋白對多種昆蟲具有特異的殺蟲活性，如對鱗翅目、鞘翅目、膜翅目有很高毒力，此外對線蟲也有毒性作用[2]。由于Bt蛋白對靶生物有很高的活性且對非靶生物無害[3-5]，已經(jīng)有實驗室發(fā)掘Bt菌株和新型殺蟲蛋白來擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因植物殺蟲譜和延緩害蟲抗性[6-9]。

VIP蛋白最早由Estruch等于1996年從蘇云金桿菌菌株AB88上清液中發(fā)現(xiàn)的[10]。營養(yǎng)期殺蟲蛋白主要被分為四大家族：Vip1、Vip2、Vip3、Vip4（http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html）。VIP蛋白與δ-內(nèi)毒素家族沒有同源性，且對鱗翅目[10]、鞘翅目[11]、同翅類[12]有活性；Vip3Aa蛋白氨基酸的同源性大于95%，且對鱗翅目昆蟲有很好的活性。個別氨基酸的差異可能會導(dǎo)致殺蟲活性、殺蟲范圍的改變[5]。Vip蛋白代表殺蟲轉(zhuǎn)基因的第2代，在蘇云金芽孢桿菌抗性方面，Vip3蛋白是最適合的替代者，在一定程度上克服了許多害蟲對Bt內(nèi)毒素低敏感或不敏感的弊端，它會提供一個范圍更大的殺蟲譜來緩解Cry蛋白產(chǎn)生的抗性問題[1，10，13-15]。

海南省位于中國南端，地處熱帶北緣，屬熱帶季風(fēng)氣候，素來有“天然大溫室”的美稱，這里長夏無冬，年平均氣溫 22～27 ℃；廣西壯族自治區(qū)位于中國華南地區(qū)西部，屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫在16.5～23.1 ℃之間；黑龍江省位于歐亞大陸東部、太平洋西岸、中國最東北部，氣候為溫帶大陸性季風(fēng)氣候，全省年平均氣溫多在-5～5 ℃之間。在本研究中，筆者比較了屬于不同氣候類型的海南、廣西、黑龍江的Bt菌株和vip基因的分布情況，以期為Bt菌株和vip基因的發(fā)掘提供一定的理論依據(jù)，這將有助于人們充分利用土壤中極其豐富的微生物資源，發(fā)掘具有較好殺蟲特異性、較高殺蟲活性的新型殺蟲蛋白，為害蟲抗性治理提供優(yōu)質(zhì)基因資源。

1材料與方法

1.1材料

菌株與載體：Bt菌株，由筆者所在實驗室分離并保存；pET-21b質(zhì)粒和大腸桿菌JM109、Rosetta菌株，由筆者所在實驗室保存。

主要試劑：Taq DNA聚合酶、KOD酶、氨芐青霉素（Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）、異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyrano-side，IPTG）、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，均購自TaKaRa公司。PCR產(chǎn)物回收DNA試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，購自美國Axygen公司。供試?yán)ハx，購自科云生物公司。

1.2方法

1.2.1Bt菌株的分離及鑒定分別從海南、廣西、黑龍江采集土樣，將采集的土樣通過高溫篩選的方法進(jìn)行Bt菌株分離。在50 mL離心管內(nèi)加入1 g土樣、20 mL滅菌水，80 ℃ 恒溫水浴30 min，靜置30 min后將上清液稀釋100倍，取 200 μL 涂到1/2LB培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，通過顯微鏡鏡檢。

1.2.2引物設(shè)計與合成根據(jù)[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]保守區(qū)的堿基序列，利用Primer 5軟件設(shè)計出用于vip基因鑒定的引物對 vip3a/vip3s。根據(jù)已知的[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]基因的序列設(shè)計全長引物vip3F/vip3R，并在上游引物中引入SalⅠ酶切位點，下游引物中引入Xho

1.2.4[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]類全長基因的克隆及表達(dá)用[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]基因的全長引物vip3F/vip3R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：25 μL KOD，各1 μL上、下游引物，1 μL模板，22 μL ddH2O。擴(kuò)增循環(huán)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶SalⅠ、XhoⅠ雙酶切PCR全長產(chǎn)物、載體pEB21b，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行驗證，委托哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上進(jìn)行在線Blast比對，測序結(jié)果確定正確后提取重組子的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta，在含有氨芐抗生素（50 mg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。挑取單克隆進(jìn)行驗證，將驗證正確的單克隆在LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃搖床培養(yǎng)，待D600 nm為0.6左右時，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，置于16 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。離心收集菌體，將菌體懸浮于20 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）緩沖液中，超聲波破碎細(xì)胞5 min，10 000 r/min 離心10 min，將沉淀重新懸浮于20 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）緩沖液中，用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5生物活性測定用National Institutes of Health開發(fā)的Image J軟件分析SDS-PAGE圖譜來對蛋白進(jìn)行定量。將粗蛋白進(jìn)行濃度梯度稀釋，以pET-21b空質(zhì)粒的Rosetta為陰性對照，測定粗蛋白對甜菜夜蛾的毒力。稱取 10 g 人工飼料置于滅菌培養(yǎng)皿中，加入1 mL待測樣品稀釋液，充分混勻，分裝于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。用毛筆接入甜菜夜蛾初孵幼蟲，每孔1頭，每個處理重復(fù)3次，置于27 ℃光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 7 d 后調(diào)查死、活蟲數(shù)[16-17]。

2結(jié)果與分析

2.1Bt菌株的分離及vip基因的鑒定

通過高溫篩選法從海南省的841份土樣中分離出156份Bt菌株，廣西地區(qū)的1 420份土樣中分離出356份Bt菌株，黑龍江省的1 010份土樣中分離出167份

的重組子轉(zhuǎn)化到Rosetta進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，在約88 ku處有1條電泳帶，與預(yù)期的目的蛋白相符，說明Vip3Aa蛋白成功表達(dá)（圖4）。

2.3生物活性測定的結(jié)果

將粗蛋白（Bt總蛋白）進(jìn)行濃度梯度稀釋，以pET-21b空質(zhì)粒的Rosetta為陰性對照，測定粗蛋白對甜菜夜蛾、棉鈴蟲的毒力，培養(yǎng)7 d后調(diào)查死、活蟲數(shù)。初篩結(jié)果顯示，粗蛋白對甜菜夜蛾有一定毒力。進(jìn)一步對該蛋白進(jìn)行復(fù)篩，表明 pET-[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]對甜菜夜蛾生測的LC50為3討論

目前Bt已成為世界上應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲劑，VIP是在Bt菌株營養(yǎng)期生長的一類殺蟲蛋白家族。已報道的VIP蛋白具有殺蟲作用，它可提供范圍更大的殺蟲譜。目前Bt菌株主要是從土壤中分離，因此筆者從具有不同代表性氣候條件的地區(qū)，如海南省、廣西地區(qū)、黑龍江省采集了土壤樣品，利用高溫篩選法進(jìn)行Bt菌株的分離，利用PCR對vip基因進(jìn)行鑒定。已有報道對同一地區(qū)vip基因分布進(jìn)行調(diào)查，但到目前為止，尚無報道熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)的Bt菌株、vip基因的分布情況。本研究首次對上述3個地區(qū)的Bt菌株和vip基因的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計比較，結(jié)果表明，與溫帶地區(qū)相比較，熱帶、亞熱帶地區(qū)有更豐富的Bt菌株和vip基因資源。

蘇云金芽孢桿菌廣泛存在于土壤、水、污物等環(huán)境中，土壤中含有豐富的微生物，給Bt的生存提供良好的環(huán)境[18]。有報道指出，溫度較高的地方蘇云金芽孢桿菌的含量也較高。巴郎山、峨眉山的自然環(huán)境與其他地方不同，溫度、含氧量都很低，常年被積雪覆蓋，Bt的出菌率明顯低于四川省的其他地方[19]。還有一些研究表明，俄羅斯Caspianic地區(qū)的出菌率是7%，比寒冷地區(qū)（5.7%）、干燥地區(qū)（5%）的出菌率高[15]。本研究選擇了3個具（熱帶、亞熱帶和溫帶），對Bt菌株和vip基因資源進(jìn)行分析比較。海南省位于中國南端，海南島地處熱帶北緣，屬熱帶季風(fēng)氣候，土壤類型屬于磚紅壤、赤紅壤；廣西地區(qū)位于中國華南地區(qū)西部，屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)；黑龍江省位于歐亞大陸東部、太平洋西岸，地處中國最東北部，氣候為溫帶大陸性季風(fēng)氣候，土壤有機(jī)質(zhì)含量高于其他地方，是世界三大黑土地之一。這3個地區(qū)具有明顯的氣候差異，而土壤屬于半開放的生態(tài)系統(tǒng)，易受環(huán)境影響。南方高溫多雨，土壤微生物種類豐富，為細(xì)菌的生長、繁殖提供了有利條件；而北方寒冷干旱，芽孢存活力差，這可能是導(dǎo)致Bt菌株分布情況不同的原因。

而對于vip基因分布情況的不同，筆者認(rèn)為這與基因進(jìn)化有關(guān)?；蛟谶z傳過程中具有保守性，在某些條件下，例如溫度的變化、地理位置變遷等，一些基因的位置將會發(fā)生變化。開始這種變化是微小的，不同的環(huán)境和不同的積累，會導(dǎo)致基因向不同方向進(jìn)化，這可能是在不同氣候條件下vip基因分布情況不同的原因；另外，筆者所在實驗室一直在進(jìn)行cry基因的挖掘工作，發(fā)現(xiàn)cry基因數(shù)量并沒有像vip基因那樣存在較大地域性差異。因此，筆者也推測vip基因在進(jìn)化過程中更易受到各種自然環(huán)境因素的影響，如溫度、植被類型、昆蟲種類等；vip基因與cry基因的殺蟲譜及殺蟲作用機(jī)制的不同可能也與這種進(jìn)化差異有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步研究。由于VIP蛋白與CRY蛋白作用于昆蟲的受體不同[10]，因此VIP蛋白可為CRY蛋白抗性提供管理策略，然而，土壤中含有的豐富vip基因資源還沒有被發(fā)掘，那么尋找新的vip基因就尤為重要。目前，PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用到vip基因的鑒定[20-21]。本研究用鑒定引物vip3a/3s和PCR的方法，鑒定出1個新型[WTBX][STBX]vip3Aa[WTBZ][STBZ]基因。結(jié)果表明，此方法可以用于vip基因的鑒定和新基因的發(fā)掘。

本研究的生物活性測定結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物對甜菜夜蛾有明顯殺蟲作用。本研究首次對熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)的Bt菌株和vip基因的不同分布進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，熱帶、亞熱帶具有豐富的Bt菌株和vip基因資源，隨著溫度的降低，Bt菌株、vip基因的數(shù)量也隨之減少，因此筆者建議在熱帶、亞熱帶及溫度較高的地區(qū)進(jìn)行Bt菌株、vip基因的發(fā)掘，這將會為探索和發(fā)掘新型vip基因提供幫助。

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