張志勇+陽(yáng)靜+齊澤民

摘要：針對(duì)鐵皮石斛富含多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)的特點(diǎn)，以鐵皮石斛葉片為材料，比較改良AB-LiCl法、SDS法以及試劑盒法提取總RNA的質(zhì)量，利用電泳檢測(cè)、核酸蛋白儀濃度測(cè)定、RT-PCR等進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果表明，3種方法均能提取鐵皮石斛葉片中總RNA，但提取效果存在差異。改良AB-LiCl法提取總RNA的28S和18S條帶清晰、D600 nm/D280 nm與D260 nm/D230 nm分別為1.96和2.03，RNA完整性好、純度高，RNA濃度在3種方法中最高，達(dá)到560.6 mg/L，RT-PCR擴(kuò)增出目的基因片段條帶最明顯，適用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；總RNA；多糖；AB-LiCl法

中圖分類號(hào)： Q522；S567.23+9.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0033-02

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科石斛屬多年生草本植物，為2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載的名貴中藥材品種。其干燥鱗莖入藥，具有滋陰清熱、益胃生津、增強(qiáng)免疫力、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等多種藥理和保健作用，是石斛屬中最為珍稀名貴的種，位列“中華九大仙草”之首[1-3]。對(duì)鐵皮石斛的研究主要集中在化學(xué)成分[4]、藥理和臨床作用[1，5-6]、分類鑒定[7-8]、誘變育種[9-10]、組織培養(yǎng)及栽培技術(shù)[11-13]等方面。隨著研究的深入，對(duì)鐵皮石斛藥用有效成分關(guān)鍵基因克隆和相關(guān)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)理解析越來越受到研究者的重視。高質(zhì)量RNA提取是基因克隆及其功能分析等分子生物學(xué)研究的前提，常用的RNA小量提取方法有SDS酚法[14]、異硫氰酸胍法[15]、AB法[16-18]等。鐵皮石斛莖葉中富含多糖、酚類及生物堿等多種次生代謝產(chǎn)物[19]。尤其多糖多酚不易與RNA分離而共沉淀，影響RNA的質(zhì)量，不利于后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)的開展。因此，本研究針對(duì)鐵皮石斛多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)含量高的特點(diǎn)，通過比較改良AB-LiCl法、SDS法以及試劑盒法等3種方法提取的總RNA質(zhì)量，建立1種簡(jiǎn)便高效的鐵皮石斛總RNA提取方法，為鐵皮石斛分子生物學(xué)研究中RNA高效獲取提供一定的參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試鐵皮石斛采自四川省高校特色農(nóng)業(yè)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室大棚，為組培苗移栽后的2年生葉片，分別在相應(yīng)部位剪取約1 g幼嫩葉片，液氮速凍后置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：RNAiso Plus試劑盒（Takara公司），Reverse transcriptasM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）；RNase固相清除劑（華越洋公司）；異硫氰酸胍；DEPC；AB；DL2000 Marker（Takara公司）；SDS、飽和Tris酚、三氯甲烷、β-巰基乙醇、無水乙醇、異戊醇、PVP等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

試驗(yàn)中所使用的塑料制品均在RNase固相清除劑為 1/1 000 的溶液中浸泡4 h，高溫高壓滅菌30 min，烘干備用；非塑料制品180 ℃烘烤8 h后使用。所有配制的提取溶液經(jīng)0.1% DEPC水處理12 h以上，高壓滅菌后使用。

1.2方法

1.2.1SDS法提取總RNA取鐵皮石斛組培苗葉片在液氮中快速研磨至粉末狀，加入80 ℃預(yù)熱的SDS提取液，具體操作過程參考劉波等文獻(xiàn)[14]提取百蕊草根系總RNA方法，獲得的RNA沉淀自然干燥后加入30 μL 0.1% DEPC水溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2改良AB-LiCl法提取總RNA取鐵皮石斛組培苗葉片在液氮中快速研磨至粉末狀，在2 mL離心管中加入700 μL 65 ℃預(yù)熱的AB提取液和60 μL β-巰基乙醇，劇烈振蕩混勻后置65 ℃水浴10 min，其間搖動(dòng)4～5次；加入等體積的酚 ∶[KG-*3]氯仿 ∶[KG-*3]異戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1），振蕩混勻，冰浴 10 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液至另一新的2 mL離心管，用等體積的酚 ∶[KG-*3]氯仿 ∶[KG-*3]異戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1）重復(fù)抽提1次；取上清液，加入1/2體積無水乙醇和1/3體積 10 mol/L LiCl，混勻后-20 ℃靜置過夜；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清；用DEPC處理的75%乙醇漂洗沉淀2次；4 ℃、10 000 r/min 離心5 min，棄上清，RNA沉淀自然干燥后用30 μL 0.1% DEPC處理水溶解沉淀，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RNAiso Plus試劑盒法提取總RNA將鐵皮石斛葉片在液氮中快速研磨成粉末，使用寶生物（大連）有限公司的RNAiso Plus試劑盒，相關(guān)操作參照使用說明進(jìn)行，提取的RNA沉淀用30 μL 0.1% DEPC水溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4總RNA質(zhì)量檢測(cè)3種方法提取的總RNA樣品濃度和純度均使用核酸蛋白儀檢測(cè)，分別記錄D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值及其濃度，并分別取2 μL RNA溶液在1.0%瓊脂糖凝膠上以10 V/cm電泳15 min，檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)分別以上述3種方法提取的總RNA為模板，使用Takara公司的PrimeScriptTM RT regeant Kit試劑盒，oligo dT primer和Random 6 mers為反轉(zhuǎn)錄引物，按說明書配制10 μL反應(yīng)體系，37 ℃保溫15 min反轉(zhuǎn)錄成cDNA，85 ℃ 下5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活。再以獲得的cDNA為模板，根據(jù)已知的鐵皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因序列（GenBank：KF711982.1）設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物（上游引物：5′-TGATGGTCGTAGTCCGTAAT-3′，下游引物：5′-GGAACCCGTGCCAAACCAT-3′）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，目的片段大小179 bp。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min，（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）×30次，72 ℃ 5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1不同方法提取的總RNA質(zhì)量比較

2.1.1RNA的完整性

經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表明，3種方法提取的總RNA均有較整齊、清楚的28S、18S、5S條帶，點(diǎn)樣孔附近無明顯亮斑，說明無蛋白質(zhì)、糖類等雜質(zhì)殘留，但電泳結(jié)果存在較大差異（圖1）。其中SDS法提取的總RNA雖有3條完整條帶，但RNA濃度較低，改良AB-LiCl法提取的總RNA條帶清晰，亮度高、無明顯拖帶降解現(xiàn)象，其28S、18S條帶與RNAiso Plus試劑盒法提取RNA的28S、18S條帶亮度相當(dāng)，這表明該方法提取的RNA完整性很好。

2.1.2濃度與純度

D600 nm/D280 nm和D600 nm/D230 nm常用于分析提取的RNA純度，高純度的RNA溶液D600 nm/D280 nm應(yīng)介于1.8～2.0之間，D600 nm/D230 nm應(yīng)大于2.0[14]。由表1可見，SDS法提取的RNA D600 nm/D280 nm比值為1.83，但D600 nm/D230 nm 僅為1.62，說明可能有鹽離子等雜質(zhì)存在。改良 AB-LiCl法和RNAiso Plus試劑盒法提取的RNA D600 nm/D280 nm比值分別為1.96和2.02，D600 nm/D230 nm分別為2.03和1.92，表明所提RNA純度高，蛋白質(zhì)、酚類、糖類等雜質(zhì)去除效果較好。改良AB-LiCl法和RNAiso Plus試劑盒法提取的RNA濃度均超過500 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于SDS法的 97.4 mg/L。

2.2RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。其中，改良AB-LiCl法擴(kuò)增的條帶亮度最高，SDS法條帶亮度最弱，可見改良AB-LiCl法提取的總RNA產(chǎn)物能滿足基因克隆、表達(dá)等后續(xù)分子生物學(xué)研究。

3討論

獲取純度高、濃度大、完整性好的RNA是進(jìn)行基因克隆、基因表達(dá)分析、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分子生物學(xué)操作的前提[14，17，20]。近年來，有關(guān)植物RNA的提取方法有很多報(bào)道，但不同植物內(nèi)含物組分及含量有很大差別，導(dǎo)致相關(guān)方法不能通用。鐵皮石斛中富含多糖、多酚、生物堿等次生代謝產(chǎn)物，因多糖與RNA間的理化性質(zhì)很相似，不易分開，在去除多糖的同時(shí)容易將大量RNA同時(shí)去除，影響后續(xù)試驗(yàn)。而多酚物質(zhì)易氧化為醌，與RNA發(fā)生不可逆的結(jié)合，進(jìn)行抽提時(shí)同樣會(huì)帶走部分RNA，因此，從富含多糖、多酚的鐵皮石斛中提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵在于有效去除多糖和多酚等次生代謝物質(zhì)[21]。

對(duì)于多糖物質(zhì)的去除方法主要有高鹽沉淀法、低濃度乙醇沉淀法、LiCl沉淀法、KAc沉淀法等[16]。本研究中，改良AB-LiCl法使用AB作為裂解提取液的效果優(yōu)于SDS法。AB作為強(qiáng)變性劑，能夠有效除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，使用較高濃度的LiCl進(jìn)行沉淀過夜，能有效去除多糖，同時(shí)提取液中加入的PVP也能和多糖結(jié)合，去除部分多糖。

RNA提取時(shí)去除酚類化合物主要包括加入強(qiáng)還原劑與加入絡(luò)合物2種途徑[16]。在提取緩沖液中加入的強(qiáng)還原劑有巰基乙醇、二硫蘇糖醇或半胱氨酸等，其中巰基乙醇使用最廣泛。本試驗(yàn)中改良AB-LiCl法使用的β-巰基乙醇的濃度提高至4%，同時(shí)，加入的絡(luò)合物PVP有很強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力，可以減少酚類物質(zhì)的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]呂圭源，顏美秋，陳素紅. 鐵皮石斛功效相關(guān)藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志，2013，38（4）：489-493.

[2]俞巧仙，郭英英，斯金平，等. 鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物動(dòng)態(tài)累計(jì)規(guī)律研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2014，39（24）：4769-4772.

[3]張崗，李依民，李標(biāo)，等. 鐵皮石斛鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 中國(guó)中藥雜志，2015，40（1）：42-47.

[4]王換，張建霞，吳坤林，等. 不同石斛的生物學(xué)特性及主要成分比較研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（12）：44-46.

[5]何鐵光，楊麗濤，李楊瑞，等. 鐵皮石斛原球莖多糖DCPPla-1的理化性質(zhì)及抗腫瘤活性[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，19（4）：578-583.

[6]鮑素華，查學(xué)強(qiáng)，郝杰，等. 不同分子量鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué)，2009，30（21）：123-127.

[7]謝明璐，侯北偉，韓麗，等. 珍稀鐵皮石斛SSR標(biāo)記的開發(fā)及種質(zhì)純度鑒定[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（5）：667-672.

[8]盧家仕，卜朝陽(yáng)，呂維莉，等. 不同產(chǎn)地石斛屬種質(zhì)資源的ISSR遺傳多樣性分析[J]. 中草藥，2013，44（1）：96-100.

[9]詹忠根，徐程. 秋水仙素誘導(dǎo)鐵皮石斛多倍體研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2011，38（3）：321-325.

[10]張青華，李枝林，唐敏，等. 秋水仙堿誘導(dǎo)鐵皮石斛多倍體研究初報(bào)[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26（5）：678-682.

[11]孫志蓉，王美云，金家興，等. 鐵皮石斛試管苗生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（2）：83-87.

[12]艾娟，嚴(yán)寧，胡虹，等. 溫度對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)及生理特性的影響[J]. 云南植物研究，2010，32（5）：420-426.

[13]常美花，金亞征，王莉. 鐵皮石斛快繁技術(shù)體系研究[J]. 中草藥，2012，43（7）：1412-1417.

[14]劉波，張曉明，郭巧生，等. 百蕊草根系總RNA提取方法比較及優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：44-46.

[15]盧河?xùn)|，薛濤，李岳忠，等. 皖貝母總RNA提取方法的比較研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2012，37（6）：781-784.

[16]王暑輝，徐倩，徐筱，等. 富含多糖多酚的側(cè)柏葉片總RNA提取方法[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（1）：76-80，89.

[17]李小婷，戴國(guó)禮，李彥龍，等. 沙棘葉片總RNA提取方法的比較研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（3）：33-34.

[18]Nadiya F，Anjali N，Gangaprasad A，et al. High-quality RNA extraction from small cardamom tissues rich in polysaccharides and polyphenols[J]. Analytical Biochemistry，2015，485：25-27.

[19]He C M，Zhang J X，Liu X C，et al. Identification of genes involved in biosynthesis of mannan polysaccharides in Dendrobium officinale by RNA-seq analysis[J]. Plant Molecular Biology，2015，88（3）：219-231.

[20]張濤，韓梅，劉翠晶，等. 人參總RNA提取方法及反轉(zhuǎn)錄酶的比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（8）：34-37.

[21]容天聚，文國(guó)松，錢雄，等. 兩種鐵皮石斛總RNA提取方法的比較研究[J].