蒙秋伊+羅凱+劉鵬飛+張正學(xué)

摘要：用0.2%甲基磺酸乙酯（EMS）處理黔糖5號(hào)甘蔗愈傷組織4 h，在100 g/L PEG脅迫下進(jìn)行抗旱性突變體篩選，得到抗旱誘變植株。在盆栽條件下對(duì)抗旱突變體進(jìn)行干旱脅迫，測(cè)定甘蔗幼苗葉片的質(zhì)膜透性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等相關(guān)生理指標(biāo)。結(jié)果表明，突變株系的最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）增強(qiáng)，游離脯氨酸含量、葉綠素含量維持高水平，丙二醛（MDA）含量減少，細(xì)胞膜透性減小。對(duì)抗旱指標(biāo)葉綠素?zé)晒鈪?shù)、相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、脯氨酸含量、葉綠素含量等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，誘變植株B1、B2、B5各項(xiàng)抗旱指標(biāo)靠前。說(shuō)明經(jīng)EMS誘變和PEG篩選得到的抗性植株在耐旱性方面比對(duì)照強(qiáng)，篩選的甘蔗突變體比對(duì)照具有更強(qiáng)的抗旱性。

關(guān)鍵詞：甘蔗；誘變；抗旱突變體；生理特性；愈傷組織；葉綠素?zé)晒鈪?shù)

中圖分類號(hào)： S566.103.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0099-04

貴州蔗區(qū)多為旱坡地，缺乏灌溉條件，旱災(zāi)頻發(fā)，嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展和蔗農(nóng)增收。培育節(jié)水抗旱、豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的甘蔗新品種，是解決干旱問(wèn)題經(jīng)濟(jì)有效的手段之一。創(chuàng)造耐旱資源的方法很多，除自然變異外，還有太空誘變、射線誘變、化學(xué)誘變等[1]，其中化學(xué)誘變由于技術(shù)簡(jiǎn)單，引起的變異豐富，受到育種界廣泛關(guān)注。Nilan等用硫酸二乙酯（DES）處理大麥種子，育成了產(chǎn)量高、莖稈矮、抗倒伏的品種Luther[2]。此后，農(nóng)作物化學(xué)誘變育種在世界各國(guó)得以推廣，到1990年為止，利用化學(xué)誘變育成的新品種（系）有106個(gè)，約占誘變育成品種（系）的7%，以禾谷類居多，其中大麥l5個(gè)、水稻12個(gè)、小麥9個(gè)、玉米7個(gè)[3]。付鳳玲等用 60Co γ射線和疊氮化鈉（NaN3）處理玉米愈傷組織，經(jīng)過(guò)1.0% NaCl高滲培養(yǎng)基篩選，得到1個(gè)耐旱性與耐旱自交系81565接近的株系，并從M1代株系中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)細(xì)胞核隱性單基因控制的孢子體雄性不育的雄性不育株[4]。陳麗等通過(guò)甲基磺酸乙酯（EMS）處理?xiàng)顦渑咝杂鷤M織定向篩選耐鹽突變體，獲得耐鹽性明顯比對(duì)照高的突變體株系[5]。許莉萍等以磷酸鹽為選擇劑，從高產(chǎn)低糖的甘蔗品種中篩選出穩(wěn)定的磷酸鹽抗性細(xì)胞系，其再生植株群體含糖量較對(duì)照高[6]。甘蔗體細(xì)胞無(wú)性系耐旱突變體的研究結(jié)果如下，Yadav等在不同NaCl濃度和聚乙二醇（PEG） 8000作用下，離體選擇經(jīng)輻射誘變的CoC671體細(xì)胞無(wú)性系，得到耐鹽性和抗旱性增強(qiáng)的突變體[7]。這些研究表明經(jīng)過(guò)物理化學(xué)誘變后，在一定的選擇壓力下可以從產(chǎn)生的變異體中篩選出抗旱性強(qiáng)的細(xì)胞系。本試驗(yàn)利用甘蔗離體培養(yǎng)，結(jié)合EMS誘變和PEG定向篩選技術(shù)，以期獲得甘蔗育種的中間材料，為以后選育抗旱性強(qiáng)的甘蔗新品種提供育種材料。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為黔糖5號(hào)甘蔗?；瘜W(xué)誘變劑為美國(guó)SIGMA公司生產(chǎn)的甲基磺酸乙酯（EMS）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1材料處理

取甘蔗莖梢幼葉為外植體，用自來(lái)水洗凈，剝?nèi)讓樱粝麻L(zhǎng)7～8 cm、直徑1.5～2.0 cm的嫩葉梢；用75%乙醇消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3～5次；再用0.1% HgCl2消毒10 min，無(wú)菌水沖洗3～5次；在無(wú)菌濾紙上吸干表面的水，再切去兩端，剝?nèi)?～3層，留下長(zhǎng)4～5 cm、直徑0.5～1.0 cm 的嫩葉梢，橫切成0.5～1.0 mm厚的圓形薄片，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉；分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉；生根培養(yǎng)基為1/2MS+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L PP333+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉。誘導(dǎo)愈傷組織在25 ℃下暗培養(yǎng)，分化及生根培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照時(shí)間12 h/d，光照度為1 500 lx。

1.2.3甘蔗愈傷組織的EMS誘變處理

用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.0）配制濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的EMS溶液，過(guò)濾滅菌，以不含EMS的磷酸緩沖液處理為對(duì)照。取黔糖5號(hào)甘蔗愈傷組織用EMS溶液浸泡，每個(gè)濃度下分別浸泡2、4、6、8 h后，無(wú)菌水沖洗，再接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基恢復(fù)，一共24個(gè)處理，每個(gè)處理6皿。愈傷組織接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)3～5 d后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，25 d統(tǒng)計(jì)分化率，確定EMS 50%致死劑量。

[JZ]愈傷分化率=分化苗數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù)×100%；

[JZ]愈傷相對(duì)分化率=處理分化率/對(duì)照分化率×100%。

1.2.4選擇劑PEG濃度的確定

采用PEG 6000模擬干旱脅迫，配制PEG濃度為0、20、40、60、80、100 g/L的1/2 MS培養(yǎng)基，以未經(jīng)誘變處理的黔糖5號(hào)甘蔗分化苗為材料，每處理分別接種50株于上述培養(yǎng)基中，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d觀察生根情況，確定PEG處理臨界濃度。

[JZ]生根率=生根的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。

1.2.5抗旱突變體的篩選

將經(jīng)EMS處理后的突變體植株進(jìn)行PEG脅迫，接種到含100 g/L PEG的1/2MS生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行抗旱篩選，25 ℃條件下培養(yǎng)30 d，再觀察其生根情況。根據(jù)根系發(fā)育情況判斷其抗旱性強(qiáng)弱，其中根系生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的為抗旱植株，完全不生根的為不抗旱植株。

1.2.6干旱脅迫處理

將黔糖5號(hào)甘蔗突變體株系移栽至盆缽，以同期分化出的未處理的組培再生苗為對(duì)照，定量供水保持土壤水分一致性，生長(zhǎng)盛期時(shí)停止?jié)菜Ｖ節(jié)菜安蓸訙y(cè)定一次抗旱性生理指標(biāo)；10 d后土壤表面發(fā)白，甘蔗葉片部分卷曲，葉間部分枯萎，清晨無(wú)吐水現(xiàn)象，再次采樣進(jìn)行抗旱性生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2.7抗旱突變體株系的生理生化鑒定

用FMS-1脈沖調(diào)制式熒光儀測(cè)定+1位葉最大光化學(xué)效率（Fv/Fm），采用電導(dǎo)率法[8]測(cè)定質(zhì)膜透性，用硫代巴比妥酸法[9]測(cè)定丙二醛（MDA）含量，采用張憲政的方法[10]測(cè)定葉綠素含量，采用酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸含量。

1.2.8數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Office Excel 2007整理，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析?？购敌苑治霾捎媚：龜?shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法，對(duì)抗性植株進(jìn)行各種生理指標(biāo)的綜合評(píng)定，按照隸屬函數(shù)加權(quán)值的高低評(píng)判抗旱性強(qiáng)弱。

若生理指標(biāo)與抗旱性成正相關(guān)，隸屬函數(shù)X=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）；若生理指標(biāo)與抗旱性成負(fù)相關(guān)，隸屬函數(shù)X=1-（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）。

式中：Xi代表生理指標(biāo)測(cè)定值；Xmin代表不同品種甘蔗各株系所對(duì)應(yīng)生理指標(biāo)的最小值；Xmax代表不同品種甘蔗各株系所對(duì)應(yīng)生理指標(biāo)的最大值。

2結(jié)果與分析

2.1EMS處理對(duì)幼胚愈傷組織分化率的影響

表1表明，隨著EMS濃度的增加、誘變處理時(shí)間的加長(zhǎng)，甘蔗愈傷組織分化率逐漸降低。誘變處理時(shí)間為8 h，EMS濃度為0.2%時(shí)，甘蔗愈傷組織相對(duì)分化率降為0，說(shuō)明EMS處理時(shí)間對(duì)愈傷組織分化率影響很大。在EMS濃度為 0.2%～0.4%、處理時(shí)間為4 h，以及EMS濃度為0.4%、處理時(shí)間為2 h時(shí)，相對(duì)分化率為50%左右。

2.2選擇劑PEG濃度的確定

由圖1可見，未經(jīng)EMS處理的黔糖5號(hào)分化苗在生根培養(yǎng)基中的生根率隨著PEG濃度升高而降低，當(dāng)PEG濃度為20 g/L時(shí)，生根率在85%左右；PEG濃度為60 g/L時(shí)，生根率降到50%；PEG濃度達(dá)到80 g/L時(shí)，生根率僅為14.6%，[JP3]甘蔗分化苗的根生長(zhǎng)受到明顯的抑制；當(dāng)PEG濃度達(dá)到100 g/L時(shí)，[JP]

生根率降到10%以下，表明外植體幾乎不耐受100 g/L PEG的干旱脅迫。因此，可采用100 g/L作為篩選抗旱突變體的PEG濃度。

2.3抗旱突變體的篩選

將經(jīng)過(guò)EMS處理后的愈傷組織分化的504株分化苗接種到含100 g/L PEG的1/2MS生根培養(yǎng)基中篩選抗旱突變體，共得到生根的抗旱植株5株。在未經(jīng)EMS處理的、僅為磷酸緩沖液處理的再生植株中，未獲得抗旱植株。

2.4抗旱突變體株系的生理指標(biāo)鑒定

將黔糖5號(hào)甘蔗5株抗性突變體植株移栽，命名為B1～B5，對(duì)其進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，以無(wú)處理的同期移栽再生苗為對(duì)照。

2.4.1干旱脅迫對(duì)抗性植株葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

從圖2可以看出，在未經(jīng)干旱處理時(shí)，各植株最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）均在0.83左右，且無(wú)顯著差異。在干旱處理后，各植株的Fv/Fm均有下降，抗性植株下降幅度較小，下降幅度最大，其他株系仍維持高水平，顯著高于，這表明誘變甘蔗具有一定的抗旱適應(yīng)性。

2.4.2干旱脅迫對(duì)抗性植株相對(duì)電導(dǎo)率的影響

由于在水分脅迫條件下植物細(xì)胞膜會(huì)受到損傷，電導(dǎo)率大小可衡量傷害程度[11]。如圖3所示，在沒(méi)有停水干旱處理時(shí)，各植株相對(duì)電導(dǎo)率維持在正常水平，相互間無(wú)顯著差異。干旱處理后，的相對(duì)電導(dǎo)率升至62.7%，抗性植株則顯著較低，其中B5最低，僅為32.1%。這表明干旱脅迫下抗性植株的質(zhì)膜受傷害程度比輕，說(shuō)明誘變甘蔗具有一定的抗旱性。

2.4.3干旱脅迫對(duì)抗性植株MDA含量的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生會(huì)加劇膜的損傷，因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，可通過(guò)MDA了解膜脂過(guò)氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性[11]。如圖4所示，各參試株系的MDA含量在未停水干旱處理時(shí)均處于同一水平；干旱處理后MDA含量均大幅升高，尤其是、B3和B5，這3株漲幅最大，而B1、B2和B4則漲幅最小，顯著小于其他株。表明干旱脅迫引起甘蔗葉片的膜脂過(guò)氧化作用，多數(shù)抗性植株能有效降低膜脂過(guò)氧化和膜系統(tǒng)的傷害程度，比對(duì)照更能適應(yīng)干旱環(huán)境，具有一定耐旱性。

2.4.4干旱脅迫對(duì)抗性植株游離脯氨酸含量的影響

在干旱脅迫條件下，許多植物體內(nèi)脯氨酸大量積累。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸[12]。如圖5所示，各參試植株經(jīng)過(guò)干旱脅迫處理后，游離脯氨酸的含量升高，B1、B2、B3、B5顯著高于，B4與差異不顯著。所有參試株系在未干旱處理前脯氨酸含量幾乎在同一水平，無(wú)顯著差異，說(shuō)表明誘變甘蔗抗旱性有所提高。

2.4.5干旱脅迫對(duì)抗性植株葉綠素含量的影響

葉綠素含量的變化對(duì)光合作用產(chǎn)生直接影響，水分脅迫下葉綠素含量的變化可以指示植物對(duì)水分脅迫的敏感性，并直接影響光合產(chǎn)量。在控水未開始時(shí)，參試株的葉綠素含量無(wú)顯著差異。干旱處理后，葉綠素含量下降，其中B1、B5的葉綠素含量顯著高于（圖6）。

2.4.6抗性植株抗旱性綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

為了全面反映甘蔗EMS誘變株經(jīng)PEG脅迫后的抗旱性，采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法，對(duì)抗旱指標(biāo)葉綠素?zé)晒鈪?shù)、相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、脯氨酸含量、葉綠素含量等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。隸屬函數(shù)值即其加權(quán)值，加權(quán)值越大，表示耐旱性越好。如表2所示，B1、B2、B5抗旱性排在前3位，可見經(jīng)EMS誘變和PEG篩選得到的植株有較強(qiáng)的耐旱性。

3結(jié)論與討論

EMS因其誘變效率高、誘變范圍廣而在誘變育種中得到廣泛使用，EMS不同濃度及不同處理時(shí)間對(duì)胚性愈傷組織的后效作用很明顯。黔糖5號(hào)在0.2%～0.4% EMS下處理 2～4 h，胚性愈傷組織褐死率為50%左右，達(dá)半致死劑量。小麥花藥愈傷組織用EMS溶液處理的較佳組合為0.2% EMS處理2～6 h，幼胚愈傷組織為（0.2%～0.4%）EMS處理24 h[13]。EMS處理獼猴桃胚性愈傷組織較佳組合為0.6% EMS處理2 h[14]。隨著EMS濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，胚性愈傷組織褐死率呈上升趨勢(shì)，增殖倍數(shù)和分化率呈下降趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果[15]相似。

試驗(yàn)利用半致死劑量EMS處理甘蔗愈傷組織，并在PEG脅迫壓力下篩選出甘蔗抗旱突變體5株，并進(jìn)行生理指標(biāo)鑒定，以無(wú)處理的同期移栽再生苗為對(duì)照。抗性植株干旱處理下仍具有較高的光系統(tǒng)Ⅱ活性，脯氨酸、葉綠素含量維持高水平，相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量低于，表明誘變甘蔗在干旱環(huán)境下，受傷害程度比較小，耐旱性得到提高。

常規(guī)育種是最主要的育種手段，雖然選育到的變異多能穩(wěn)定遺傳，但育種周期長(zhǎng)、進(jìn)程慢，難以獲得突變性變異?；瘜W(xué)誘變突變率相對(duì)較高，能誘發(fā)出各種有用的突變基因，能夠在原有遺傳背景基本不變的情況下在分子水平上使植物出現(xiàn)有用性狀的變異。但誘發(fā)突變的方向和性質(zhì)尚難掌握，突變后有利個(gè)體往往不多。本試驗(yàn)得到了一些抗旱性增強(qiáng)的甘蔗株系，僅在實(shí)驗(yàn)室條件下得到驗(yàn)證，是否屬于基因水平上的變異、能否在大田栽培中有穩(wěn)定的表現(xiàn)，仍需進(jìn)一步研究。

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