趙靜+吳茹+李楠+楊占威+胡文兵+王文君

摘要：為研究青錢柳多糖對(duì)高脂血癥小鼠抗脂質(zhì)過氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響，將建模成功的高脂血癥小鼠隨機(jī)分為青錢柳多糖高、中、低劑量組，辛伐他汀組，高脂模型組和空白對(duì)照組，其中前4組分別灌胃400、200、100 mg/kg青錢柳多糖水溶液，4 mg/kg辛伐他汀水溶液，另2組灌胃等量無菌水，每組16只，連續(xù)喂養(yǎng)4周。試驗(yàn)結(jié)束后采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）測定肝臟、脂肪組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）基因的mRNA表達(dá)水平，探討青錢柳多糖抗脂質(zhì)過氧化機(jī)制。結(jié)果表明，不同劑量青錢柳多糖可使SOD、GSH-Px、CAT mRNA表達(dá)量顯著或極顯著上升（P<0.05或P<0.01），其中肝臟組織中SOD、CAT表達(dá)量最大增幅分別達(dá)1309%、108.6%，GSH-Px表達(dá)量未出現(xiàn)顯著變化；脂肪組織中SOD、GSH-Px的最大上調(diào)幅度分別為507%、1000%，而CAT表達(dá)量無顯著差異。結(jié)果顯示，青錢柳多糖可調(diào)節(jié)高脂血癥小鼠抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)其機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化能力。

關(guān)鍵詞：青錢柳；多糖；脂質(zhì)過氧化；高脂血癥；mRNA表達(dá)

中圖分類號(hào)： S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0124-04

隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展及人民生活水平的提高，肥胖已成為人們面臨的一個(gè)重要健康問題，高脂、高蛋白食物的過多攝入，導(dǎo)致人體脂質(zhì)代謝異常，脂質(zhì)過氧化程度加重。高脂、高蛋白食物消化產(chǎn)物可引起細(xì)胞的功能損傷并伴隨多種疾病的發(fā)生，如心血管疾病、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化等[1]。目前，降血脂仍主要依賴于他汀類藥物，其副作用日益被人們關(guān)注，因此，研究開發(fā)天然無毒、無副作用的植物提取物作為抗脂質(zhì)過氧化的功能性食品藥品顯得格外重要。已有研究發(fā)現(xiàn)，植物中分離得到的多糖類化合物能夠清除體內(nèi)自由基，抑制亞油酸氧化，具有防止細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的作用[2]。青錢柳[Cyclocarya paliurus （Batal） Iljinskkaja]別稱青錢李或金錢柳，系胡桃科青錢柳屬落葉喬木，該屬現(xiàn)僅存1種，且僅存于我國，是我國瀕臨絕種的珍稀樹種之一，已于2013年被納入我國新食品原料。青錢柳中含有人體所需的胡蘿卜素、維生素E、維生素C、蛋白質(zhì)和人體必需氨基酸等多種成分，在民間已被制作為一種保健茶飲用。此外，青錢柳還含有對(duì)人體健康有積極意義的大量、微量元素[3]，已有研究表明，青錢柳多糖具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、提高免疫力等作用[4]，然而關(guān)于青錢柳多糖抗脂質(zhì)過氧化的分子機(jī)制鮮有報(bào)道。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，青錢柳多糖可通過調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，降低血脂水平[5]；同時(shí)，青錢柳多糖在體內(nèi)、體外也有明顯的抗氧化作用，可清除羥基自由基、對(duì)二苯代苦味?；杂苫―PPH·），并能夠顯著提高高脂血癥小鼠肝臟超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，簡稱SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，簡稱GSH-Px）活性，降低丙二醛（malondialdehyde，簡稱MDA）、游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid，簡稱NEFA）含量[6]。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）測定抗氧化相關(guān)基因SOD、GSH-Px、過氧化氫酶（catalase，簡稱CAT）在肝臟、脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平，在分子水平上進(jìn)一步探討青錢柳多糖的抗氧化機(jī)制，以期為青錢柳多糖的開發(fā)、利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物本研究所用試驗(yàn)動(dòng)物為120只出生21d的雌性昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g[合格證號(hào)：SY（贛）2010-0002]，購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±2） ℃，相對(duì)濕度（55±5）%，光照時(shí)間12h/d（光照時(shí)間范圍：07：00—19：00）。

1.1.2藥物、試劑和儀器青錢柳葉采用水提醇沉法提取多糖[6]，經(jīng)D301R樹脂純化后，測得多糖含量為60.71%；全價(jià)飼料，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。辛伐他汀膠囊，上海云峰藥業(yè)有限公司；總膽固醇（TC）測定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；焦炭酸二乙酯（DEPC），美國Amresco公司；瓊脂糖，美國Promega公司；2×Taq PCR Master Mix，美國BEST ALL公司；RNase噴霧清除劑、TRIzol試劑盒、RT-PCR試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。其他試劑均為分析純。

主要儀器：PE9600 PCR儀，PERKIN ELMER公司；GeneGenius全自動(dòng)數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)，SYNGENE公司；移液器、5415D型小型高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；超微量分光光度計(jì)，美國Thermo Scientific公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1高脂血癥小鼠建模與給藥本試驗(yàn)高脂乳劑配制方法見文獻(xiàn)[6]，120只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成空白對(duì)照組（20只）、模型組（100只）。每天09：00模型組灌胃高脂乳劑（1 mL/kg），空白對(duì)照組灌胃等體積的無菌水，其間自由飲水?dāng)z食。灌胃2周后，禁食、不禁水12 h，眼眶靜脈采血，測定小鼠血清總膽固醇含量。模型組小鼠血清TC值與空白對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）視為建模成功，選取80只造模成功的小鼠，隨機(jī)分高脂模型組、對(duì)照組與青錢柳多糖低、中、高劑量組和辛伐他汀組，每組16只。除空白對(duì)照組外，其余5組小鼠每天9：00灌胃高脂乳劑（1 mL/kg），16：00青錢柳多糖低、中、高3組分別以100、200、400 mg/kg青錢柳多糖水溶液灌胃，高脂模型組、對(duì)照組灌胃等體積的無菌水，陽性對(duì)照組（辛伐他汀組）灌胃辛伐他汀水溶液4 mg/kg。連續(xù)灌胃4周，每周稱量1次體質(zhì)量，以調(diào)整給藥劑量，試驗(yàn)期間各組小鼠均自由飲水?dāng)z食。

1.2.2RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR試驗(yàn)結(jié)束后，禁食、不禁水12 h，乙醚麻醉后迅速解剖小鼠，取肝臟、腹腔脂肪放入液氮速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

總RNA的提?。簠⒄誘RIzol試劑盒說明書提取各組小鼠肝臟和腹腔脂肪總RNA，經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)測定，D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之間，電泳檢驗(yàn)完整性符合下游試驗(yàn)要求。

逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照試劑盒要求配制逆轉(zhuǎn)錄體系：5～500 ng總RNA、10 μL 2×ES Reaction Mix、1 μL Anchored Oligo（dT）18 （0.5 μg/μL）、1 μL EasyScriptTM RT/RI Enzyme Mix，補(bǔ)充脫RNase水至20μL。輕輕混勻此反應(yīng)體系，42 ℃ 孵育30 min，85 ℃加熱5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。取出 1 μL cDNA 測定其濃度，剩余cDNA保存于-20 ℃或立即用于PCR。

RT-PCR：登錄GenBank查找SOD、GSH-Px、CAT、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）基因序列，用DNAMAN（Version 3.0）設(shè)計(jì)所需引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，相關(guān)引物序列信息見表1。PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA，各05 μL上、下游引物，12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，補(bǔ)充雙蒸水至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，61 ℃（SOD、GSH-Px、CAT基因）30 s，59.3 ℃（β-actin基因）30 s，72 ℃ 30 s，34次循環(huán)。

1.2.3凝膠成像分析及數(shù)據(jù)分析RT-PCR擴(kuò)增結(jié)束后，分別取各組SOD、GSH-Px、CAT PCR產(chǎn)物電泳[條件為15%瓊脂糖凝膠（含0.05%溴化乙錠），1×TAE（成分為三羥甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸）電泳緩沖液，80 V電泳 1 h]，用凝膠圖像分析軟件（Gene Tools Analysis）進(jìn)行光密度掃描半定量分析，目的基因的相對(duì)表達(dá)量以該基因和[JP2]β-actin 電泳帶于260 nm的吸光度比值表示。設(shè)空白對(duì)照組mRNA吸光度為1，計(jì)算其他各試驗(yàn)組mRNA相對(duì)吸光度比值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS統(tǒng)計(jì)軟件（V3.01專業(yè)版）統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（x[TX-*5]±s）表示，P<0.05視為差異顯著。[JP]

2結(jié)果與分析

2.1青錢柳多糖對(duì)高脂血癥小鼠肝臟和脂肪組織中SOD mRNA表達(dá)的影響[HT]

在通常情況下，生物體內(nèi)的自由基處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)此平衡被打破后，將引發(fā)許多相關(guān)疾病。SOD、GSH-Px、CAT常被用作重要的抗氧化指標(biāo)，它們的協(xié)同作用維持了機(jī)體自由基的動(dòng)態(tài)平衡，可以阻止脂質(zhì)過氧化和此過程中的中間產(chǎn)物對(duì)機(jī)體造成的損害。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，通過催化超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫、氧氣而達(dá)到抗氧化作用，在維持生物體自由基產(chǎn)生、平衡過氧化物清除能力上起重要作用[7]。Zeng等報(bào)道，L-蘋果酸可提升大鼠肝臟細(xì)胞中SOD mRNA的表達(dá)量[8]。Fer[KG-*5]n[DD（-1*2][HT6]′[DD）]andez-Iglesias等發(fā)現(xiàn)，在葡萄籽原花色素提取物和富含二十二碳六烯酸（DHA）的水藻提取物混合作用下，大鼠SOD活性、肝臟SOD表達(dá)量顯著提高[9]。

設(shè)正常對(duì)照組小鼠脂肪中SOD mRNA表達(dá)吸光度為1，計(jì)算其他各組mRNA表達(dá)相對(duì)吸光度。由表2、圖1可知，在肝臟中，與空白對(duì)照組相比，高脂模型組小鼠肝臟中SOD mRNA表達(dá)量下降45.0%（P<0.05）；與高脂模型組相比，青錢柳多糖高劑量組、中劑量組、辛伐他汀組小鼠肝臟中SOD mRNA表達(dá)量顯著或極顯著升高（P<0.05或P<0.01），上升率分別為130.9%、527%、56.4%，此外低劑量組也上升40.0%。在脂肪中，與空白對(duì)照組相比，高脂模型組小鼠脂肪中SOD mRNA表達(dá)量下降330%，差異極顯著（P<0.01）；與高脂模型組相比，青錢柳多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組、辛伐他汀組小鼠脂肪中SOD mRNA表達(dá)量分別上升了50.7%、38.8%、104%、23.9%，且高劑量和低劑量組與之差異顯著（P<005）。結(jié)果表明，青錢柳多糖可通過調(diào)節(jié)SOD mRNA的表達(dá)量提高抗氧化能力。

2.2青錢柳多糖對(duì)高脂血癥小鼠肝臟中GSH-Px mRNA表達(dá)的影響[HT]

作為一種重要的催化氧化酶，谷胱甘肽過氧化物酶廣泛分布在細(xì)胞質(zhì)、線粒體內(nèi)， 不僅能清除生物體內(nèi)自由基，還能

阻斷脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不被破壞[10]。Han等研究發(fā)現(xiàn)，2種富含花青素的紫薯提取物可顯著提高大鼠肝臟中GSH-Px的表達(dá)水平，從而抑制肝臟中脂質(zhì)過氧化的發(fā)生[11]；另外有研究顯示，在紅茶提取物干涉下，秀麗隱桿線蟲細(xì)胞中GSH-Px的活性增加，其mRNA表達(dá)水平也顯著上升[12]。設(shè)空白對(duì)照組小鼠組織中GSH-Px mRNA 表達(dá)吸光度為1，計(jì)算其他各組mRNA表達(dá)相對(duì)吸光度。由表3、圖2可見，在肝臟中，與空白對(duì)照組相比，高脂模型組小鼠GSH-Px mRNA表達(dá)量升高4.2%；與高脂模型組相比，青錢柳多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組及辛伐他汀組小鼠肝臟中GSH-Px mRNA表達(dá)量沒有顯著性差異，隨著

2.3青錢柳多糖對(duì)高脂血癥小鼠CAT mRNA表達(dá)的影響

過氧化氫酶又稱觸酶，是生物防御體系中重要的末端氧化酶。CAT主要作用是清除生物體內(nèi)的過氧化氫，它以過氧化氫為底物，催化1對(duì)電子的轉(zhuǎn)移，將其最終分解為水、氧氣，進(jìn)而阻止對(duì)機(jī)體有害的羥基自由基生成[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香提取物可以提高高脂膳食小鼠肝臟中CAT mRNA的活性和表達(dá)水平，并減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[14]。

設(shè)空白對(duì)照組小鼠肝臟中CAT mRNA表達(dá)吸光度為1，計(jì)算其他各組mRNA表達(dá)相對(duì)吸光度。由表4、圖3可見，在肝臟中，與空白對(duì)照組相比，高脂模型組小鼠肝臟中CAT mRNA 表達(dá)量下降42.0%（P<0.05）；與高脂模型組相比，青錢柳多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組、辛伐他汀組小鼠肝臟中CAT mRNA表達(dá)量分別提高了108.6%、89.7%、241%、41.4%，其中高劑量組肝臟中CAT mRNA表達(dá)量較高脂模型組極顯著提高（P<001）。在脂肪中，與空白對(duì)照組相比，高脂模型組脂肪中CAT mRNA下降6.0%；與高脂模型組比較，青錢柳多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組、辛伐他汀組CAT mRNA表達(dá)量提高幅度分別為39.4%、39.4%、106%、287%。結(jié)果說明，青錢柳多糖可影響CAT在肝臟中的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化能力，在脂肪組織中各組CAT mRNA的表達(dá)量未出現(xiàn)顯著差異，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因?yàn)镃AT主要存在于動(dòng)物的肝臟、紅細(xì)胞中，在脂肪中表達(dá)

3結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳多糖能顯著提高小鼠SOD、GSH-Px、CAT基因的表達(dá)量，從而提升體內(nèi)抗氧化酶的活性和清除自由基的能力，在分子水平上解釋了青錢柳多糖抗脂質(zhì)過氧化的可能的機(jī)制，可為青錢柳的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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