于海霞 郭 佳 劉東偉 秦 麗 余 琦 劉章鎖

瞬時受體電位離子通道3在糖尿病腎病小鼠的表達及意義

于海霞1,2,3郭 佳1,2劉東偉1,2秦 麗1,2,3余 琦1,2,3劉章鎖1,2

目的：研究瞬時受體電位離子通道3(TRPM3)在2型糖尿病腎病模型db/db小鼠腎組織的表達，以及高糖對人腎小管上皮細胞(HK2)和小鼠足細胞(MPC)TRPM3表達的影響。 方法：(1)將20只雄性5周齡db/db小鼠隨機分為兩組，各10只。同窩出生的db/m小鼠作為正常對照組(n=20)。待db/db小鼠生長至10周齡和18周齡后取血、尿標本測定相關生化指標，留取腎組織。利用Western blot、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和免疫組織化學方法，檢測正常對照組(db/m小鼠)及不同周齡(10周、18周)db/db小鼠腎組織中TRPM3的表達水平及分布情況。 (2)體外培養(yǎng)HK2和條件永生化MPC，分別按以下處理分組：對照組(D-葡萄糖5.6 mmol/L)；甘露醇組(D-葡萄糖5.6 mmol/L+甘露醇24.4 mmol/L)；高糖組(D-葡萄糖30 mmol/L)，培養(yǎng)24h、48h、72h收獲細胞，用Western blot和qRT-PCR檢測細胞中TRPM3的表達。 結果：(1)與db/m小鼠相比，db/db小鼠腎組織腎小管和腎小球中TRPM3的表達增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；(2)與正常對照組相比，高糖組HK2和MPC中TRPM3的表達均增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 結論：TRPM3可表達于糖尿病腎病小鼠腎臟組織的腎小管和腎小球中，且高血糖可誘導TRPM3在HK2細胞和MPC細胞的高表達；TRPM3可能參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

糖尿病腎病 瞬時受體電位離子通道3 人腎小管上皮細胞 條件永生化的小鼠足細胞

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥,是導致終末期腎病(ESRD)的主要病因之一。腎小球濾過屏障受損(足細胞損傷起關鍵作用)、腎小球硬化及腎間質纖維化在DN的進展中發(fā)揮重要作用[1]。瞬時受體電位通道(即TRP通道)是位于細胞膜上一類重要的陽離子通道，它可廣泛表達多種哺乳動物的組織和細胞[2]。TRP家族分為7個亞家族，不同亞型在腎臟發(fā)揮的作用不同。近年來，亞家族中TRPC6與瞬時受體電位離子通道3(TRPM3)備受關注。最早有研究指出，TRPC6基因突變能夠導致局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)，由此揭示了TRPC6與腎臟疾病的密切關系[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在DN的發(fā)病進程中，TRPC6能夠誘導細胞Ca2+內流改變，進而引起足細胞濾過功能的損傷，最終導致蛋白尿[4]。作為另一個鈣通透性離子通道TRPM家族中的一員，TRPM3主要表達于腦和腎臟。相關報道指出，TRPM3在背根神經節(jié)神經元中可參與調控機體的避害行為[5]。同時它能夠調控寡突膠質細胞的分化和中樞神經系統(tǒng)髓鞘的形成[6]。此外，還在維持腎臟的鈣離子穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，但是目前有關TRPM3在DN小鼠腎組織及細胞中的表達及作用研究較少。考慮到TRPC6在DN中的相關研究較多，因此本課題選取TRPC6為參照，同時比較TRPM3、TRPC6在DN小鼠腎組織中的表達分布情況及高糖環(huán)境下兩者在人腎小管上皮細胞、小鼠足細胞中的表達情況。

材料與方法

材料與試劑 兔抗小鼠(或兔抗人)多克隆抗體TRPM3 (SantaCruz，CA)；兔抗小鼠(或兔抗人)多克隆抗體TRPC6(英國Abcam)；小鼠抗小鼠(或小鼠抗人)GAPDH單克隆抗體(中杉金橋生物工程公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗(北京鼎國昌盛生物技術公司)；RPIM 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(均購自美國Gibco)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone)；小鼠γ-干擾素(美國R&D systems)；cDNA合成試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒(日本東洋紡公司)；PV-9001免疫組化檢測試劑(中杉金橋生物工程公司)。

儀器與設備 安穩(wěn)血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)、液氮容器(北京恒奧生物科技有限公司)、CO2細胞培養(yǎng)箱、高速低溫離心機(德國Eppendorf)、高壓滅菌器(日本SANYO公司)、數(shù)顯恒壓恒流電泳儀(Tanon公司)、轉移電泳槽(天能Tanon公司)。

方法

實驗動物及分組 (1)C57BLKS/J的清潔級雄性db/db小鼠和db/m小鼠由南京模式動物中心提供，于河南省實驗動物中心動物房分籠飼養(yǎng)，同窩出生的5周齡小鼠經檢疫及適應性飼養(yǎng)1周。每籠5只，室溫18～24℃， 實驗期間自由進食飲水，喂養(yǎng)普通飼料，不使用胰島素和其他降糖藥物。(2)分組：將20只雄性5周齡db/db小鼠隨機分為兩組，各10只。同窩出生的db/m小鼠(20只)作為正常對照組。從6周齡起定期測定各組小鼠的體重，收集24h尿，禁食8 h后測尾尖血糖。飼養(yǎng)10周、18周后用5%水合氯醛按照0.1 ml/10g體重腹腔注射麻醉小鼠，收集心臟血，分離兩側腎臟，觀察一般情況，剝離腎包膜并留取腎臟，將腎臟皮質切成綠豆樣大小后置于光鏡液中固定，剩余腎組織置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

細胞培養(yǎng)及分組 (1)人近端腎小管上皮細胞系(HK2)(購自于中國典型培養(yǎng)物保藏中心)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的低糖(D-葡萄糖 5.6 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基中，細胞置于37℃、5%C02細胞培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)。0.25%胰酶消化，按需傳代，待細胞生長至 70%～80%融合時，用無血清培養(yǎng)基饑餓同步12h后隨機分為以下5組：①正常對照組(NG 5.6 mmol/L葡萄糖)；②甘露醇組(NG+M即5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇)；③高糖組(HG 30 mmol/L葡萄糖)，分別于24h、48h、72h各時間點收獲細胞。(2)條件性永生化小鼠足細胞株(MPC)由南方醫(yī)科大學聶靜教授(Southern Medical University，China)惠贈。參照Peter Mundle教授的方法[7]，增殖狀態(tài)下，未分化足細胞在33℃、5% CO2培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清、5.6 mmol/L葡萄糖、10 U/ml小鼠干擾素γ的RPMI1640培養(yǎng)基，待細胞生長至70%～80%融合后進行傳代或放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱使其分化，此時改用含10%胎牛血清、5.6 mmol/L葡萄糖、不含重組小鼠干擾素γ的RPMI 1 640培養(yǎng)基，培養(yǎng)足細胞12～14天，待其分化成熟后，余處理及分組同上。

生化指標檢測 空腹血糖采用快速血糖儀檢測，血生化在鄭州大學第一附屬醫(yī)院生化室檢測。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測相關mRNA表達 Trizol法提取動物腎組織和各實驗細胞中的總RNA，采用紫外線分光光度計測定各樣本RNA濃度，按反轉錄試劑盒說明書反轉錄獲得cDNA。用熒光定量PCR儀分別擴增內參照基因和各目的基因，用Ct值表示樣品中內參照基因和目的基因的相對含量。qRT-PCR擴增體系如下：PCR Master Mix 10 μl,上、下游引物(10 nmol/L)各1 μl,模板cDNA 2 μl，加RNase-free水補足至20 μl。循環(huán)條件:95℃ 30s、95℃ 5s和60℃ 32s，循環(huán)45次，重復實驗至少3次。各引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

Western印跡法檢測蛋白表達 (1)組織蛋白的提取：取液氮凍存的腎組織，加適量裂解液后充分研磨，4℃ 裂解組織，12 000×rpm低溫離心10 min，取上清液，BCA法測蛋白濃度，不煮蛋白，直接將各組蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，然后濕轉將膠上蛋白轉移至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉2h，4℃一抗孵育過夜，各抗體工作濃度分別為：TRPM3抗體(1∶ 1 500)、TRPC6抗體(1∶ 1 500)、GAPDH抗體(1∶ 2 000)。次日1×TSBT洗膜三次、10 min/次，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶ 2 500)或山羊抗小鼠二抗(1∶ 2 500)室溫孵育2h，1×TSBT洗膜三次、10 min/次。用Tanon全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)進行曝光成像，以GAPDH為內參，Image J軟件分析條帶并計算TRPM3、TRPC6蛋白表達水平。(2)細胞蛋白的提?。菏占鹘M細胞，按照全細胞裂解液說明書冰上提取總蛋白，12 000×rpm低溫離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，余方法同上。按相同實驗條件、用不同批次細胞重復實驗至少3次。

免疫組織化學 用石蠟包埋小鼠腎組織，切成3 μm厚度薄組織，貼于防脫片上，60℃恒溫箱烤片2h，后于4℃冰箱內保存。用前烤片30 min，經二甲苯、梯度酒精進行脫蠟、水化，PBS洗滌5 min/次×3次，微波修復抗原，待恢復室溫后PBS洗滌5 min/次×3次，3%H2O2室溫孵育30 min以阻斷內源性過氧化物酶，PBS洗滌5 min/次×3次，山羊血清封閉20 min，分別滴加一抗TRPM3(1∶ 150)、TRPC6(1∶ 150)，4℃孵育過夜；次日PBS洗滌5 min/次×3次后滴加相應HRP標記的二抗及反應增強液，顯微鏡下控制DAB顯色時間，蘇木素染核，梯度酒精脫水、二甲苯透明后封片。陰性對照組使用PBS 替代一抗。

結 果

糖尿病腎病小鼠腎組織TRPM3、TRPC6的表達分布

一般狀態(tài)和生化指標 db/db小鼠的體重和空腹血糖、24h尿蛋白和肌酐水平均高于同周齡db/m小鼠(P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠生化指標情況

db/db：糖尿病腎病模型小鼠；db/m：正常對照組；*：與同周齡db/m小鼠相比，P<0.05

腎組織TRPM3、TRPC6表達 Western 印跡法示，10周db/db小鼠和18周db/db小鼠腎組織中TRPM3、TRPC6蛋白表達量明顯高于db/m小鼠(P<0.05)；qRT-PCR結果與Western印跡結果趨勢一致(圖1)。

腎組織TRPM3、TRPC6免疫組織化學結果 TRPM3、TRPC6主要表達于細胞質，呈棕色。與同周齡db/m小鼠相比，db/db小鼠腎組織腎小管和腎小球中的TRPM3、TRPC6表達明顯增多(圖2、3)。

高糖環(huán)境下HK2和MPC細胞TRPM3、TRPC6的表達情況

HK2細胞 (1) Western 印跡結果顯示，與NG組相比，HG組中TRPM3、TRPC6蛋白表達隨高糖培養(yǎng)時間延長逐漸增多(均P<0.05)。qRT-PCR結果與Western印跡結果趨勢一致(圖4)；(2) 對各組中TRPM3、TRPC6蛋白表達水平進行相關性分析顯示，兩者呈線性正相關(r=0.609，P=0.016)。

圖1 各組小鼠腎組織中TRPM3、TRPC6蛋白和mRNA表達情況db/db：糖尿病腎病模型小鼠；db/m：正常對照組；TRPM3：瞬時受體電位離子通道3；TRPC6：瞬時受體電位通道6；A、B：Western Blot檢測TRPM3、TRPC6蛋白結果；C：qRT-PCR檢測TRPM3、TRPC6 mRNA結果；*：與db/m(10周)相比，P<0.01

圖2 各組小鼠腎組織中TRPM-3、TRPC-6免疫組化結果(IH，×200)db/db：糖尿病腎病模型小鼠；db/m：正常對照組；TRPM3：瞬時受體電位離子通道3；TRPC6：瞬時受體電位通道6

圖3 小鼠腎組織中TRPM3、TRPC6表達的半定量分析TRPM3：瞬時受體電位離子通道3；TRPC6：瞬時受體電位通道6；*：與db/m(10周)相比，P<0.05；△：與db/m(18周)相比，P<0.05

MPC細胞 (1)Western印跡結果顯示，與NG組相比，HG組中TRPM3、TRPC6蛋白表達隨高糖培養(yǎng)時間延長逐漸增多(均P<0.01)。qRT-PCR結果與Western印跡結果趨勢一致(圖5)；(2) 對各組中TRPM3、TRPC6蛋白表達水平進行相關性分析顯示，兩者呈線性正相關(r=0.939，P<0.01)。

討 論

db/db小鼠是早期DN的模型，有研究證實，db/db小鼠自第8～10周開始出現(xiàn)蛋白尿及腎功能損害[8]。本研究顯示，自第6周開始，db/db小鼠的血糖較db/m小鼠升高，出現(xiàn)多飲、多尿、體重增加。自第10周開始，db/db小鼠的尿蛋白較db/m小鼠明顯增高，這都與既往研究結果一致，這說明DN小鼠模型建立成功。

TRPM3是一種瞬時受體電位通道，可介導Ca2+、Mn2+、Zn2+等進入細胞[9](以通透Ca2+為主)，參與機體的各種病理生理過程。有研究表明，TRPM3能夠介導胰島素的分泌[10]，還可以下調增殖的血管平滑肌中炎癥因子IL-6的表達[11]。它主要表達于人體腎臟中，在鈣離子穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，但具體機制仍然處于待研究階段。新近研究指出，腎透明細胞癌中TRPM3的表達上調，這可能與TRPM3誘導細胞鈣離子內流增多進而引起細胞的自噬有關，由此可利用TRPM3通道為切入點對腎臟腫瘤進行靶向治療[12]，這表明TRPM3通道在腎臟中發(fā)揮的作用不可小覷。而截止目前，TRPM3與DN的關系鮮有報道，且其在小鼠腎臟組織中的表達及分布情況并不十分清楚。因此，本研究通過DN模型小鼠，我們發(fā)現(xiàn)db/db小鼠腎臟組織TRPM3 mRNA及其蛋白表達水平較正常對照組小鼠(db/m)升高，且隨著周齡的增加TRPM3的表達也隨之升高；免疫組化結果提示db/db小鼠腎小管和腎小球中TRPM3表達上調；此外我們的研究以人腎小管上皮細胞和小鼠足細胞為實驗對象，從細胞水平驗證了高糖能夠誘導HK2和MPC中TRPM3的高表達。這表明TRPM3可能在DN的發(fā)生發(fā)展中產生了作用。

圖4 高糖對HK-2中TRPM3、TRPC6蛋白和mRNA表達情況TRPM3：瞬時受體電位離子通道3；TRPC6：瞬時受體電位通道6；NG：正常對照組；NG+M：甘露醇組;HG：分別為D-葡萄糖30 mmol/L 24h/48h/72h組；A/B：Western blot檢測TRPM3、TRPC6蛋白結果；C：qRT-PCR檢測TRPM3、TRPC6 mRNA結果;*：與NG組相比，P<0.05

圖5 高糖對MPC中TRPM3、TRPC6蛋白和mRNA表達情況TRPM3：瞬時受體電位離子通道3；TRPC6：瞬時受體電位通道6；NG：正常對照組；NG+M：甘露醇組;HG：分別為D-葡萄糖30 mmol/L 24h/48h/72h組；*：與NG組相比，P<0.01；A、B：Western Blot檢測TRPM3、TRPC6蛋白結果；C：qRT-PCR檢測TRPM3、TRPC6 mRNA結果

作為瞬時受體電位通道家族的另一成員，TRPC6是足細胞裂孔膜蛋白的一員，能夠介導鈣離子內流進而調節(jié)足細胞的功能，維系腎小球的正常濾過，成為近年來研究的熱點。有學者發(fā)現(xiàn)，高糖能夠誘導體外培養(yǎng)的足細胞中TRPC6的表達增多，最終引起足細胞骨架蛋白的損傷[13]。也有研究提出，高血糖可誘導TRPC6在DN大鼠腎小球中的高表達，這可能參與了DN大鼠足細胞的損害和蛋白尿的形成[14]。DN中氧化應激的出現(xiàn)及活性氧簇(ROS)的增加可上調TRPC6的表達[15-16]，同時，TRPC6還可參與血管緊張素Ⅱ誘導足細胞損傷的病理生理過程[17]。本次研究從組織水平和細胞水平證實了TRPC6在DN小鼠腎組織和高糖環(huán)境處理后各細胞系中的表達均是增多的，這與既往研究的部分結果一致。

綜上所述，高血糖能誘導TRPC6和TRPM3在糖尿病腎病小鼠腎組織、人腎臟腎小管上皮細胞及小鼠腎小球足細胞的高表達。據(jù)此，我們推測TRPM3可能如TRPC6一樣也在DN發(fā)病進程中發(fā)揮著重要的作用，而其是否受氧化應激因子的調控及其能否通過調控鈣離子的濃度進而影響DN的進展，這些具體的機制尚待進一步深入探究。

1 Mclennan SV,Fisher E,Martell SY,et al.Effects of glucose on matrix metalloproteinase and plasmin activities in mesangial cells:Possible role in diabetic nephropathy.Kidney Int Suppl,2000,77:S81-S87.

2 Nilius B,Owsianik G.The transient receptor potential family of ion channels.Genome Biol,2011,12(3):218.

3 Winn MP,Conlon PJ,Lynn KL,et al.A mutation in the TRPC6 cation channel causes familial focal segmental glomerulosclerosis.Science,2005,308(5729):1801-1804.

4 Moller CC,Wei C,Altintas MM,et al.Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease.J Am Soc Nephrol,2007,18(1):29-36.

5 Vriens J,Owsianik G,Hofmann T,et al.TRPM3 is a nociceptor channel involved in the detection of noxious heat.Neuron,2011,70(3):482-494.

6 Hoffmann A,Grimm C,Kraft R,et al.TRPM3 is expressed in sphingosine-responsive myelinating oligodendrocytes.J Neurochem,2010,114(3):654-665.

7 Mundel P,Reiser J,Zuniga MBA,et al.Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.Exp Cell Res,1997,236(1):248-258.

8 Wang LH,Liu JS,Ning WB,et al.Fluorofenidone attenuates diabetic nephropathy and kidney fibrosis in db/db mice.Pharmacology,2011,88(1-2):88-99.

9 Wagner TF,Drews A,Loch S,et al.TRPM3 channels provide a regulated influx pathway for zinc in pancreatic beta cells.Pflugers Arch,2010,460(4):755-765.

10 Thiel G,Muller I,Rossler OG.Signal transduction via TRPM3 channels in pancreatic beta-cells.J Mol Endocrinol,2013,50(3):R75-R83.

11 Naylor J,Li J,Milligan CJ,et al.Pregnenolone sulphate- and cholesterol-regulated TRPM3 channels coupled to vascular smooth muscle secretion and contraction.Circ Res,2010,106(9):1507-1515.

12 Hall DP,Cost NG,Hegde S,et al.TRPM3 and miR-204 establish a regulatory circuit that controls oncogenic autophagy in clear cell renal cell carcinoma.Cancer Cell,2014,26(5):738-753.

13 楊賀,趙波,孟可欣,等.TRPC6在高糖所致足細胞骨架F-actin損傷中的作用.哈爾濱醫(yī)科大學學報,2013,47(4):297-300.

14 Zhang X,Song Z,Guo Y,et al.The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats.Mol Cell Biochem,2015,399(1-2):155-165.

15 Sudhir VShah,Radhakrishna Baliga,Mohan Rajapurkar,et al.Oxidants in chronic kidney disease.J Am Soc Nephrol,2007,18(1):16-28．

16 Wang Z,Wei X,Zhang Y,et al.NADPH oxidase-derived ROS contributes to upregulation of TRPC6 expression in puromycin aminonucleoside-induced podocyte injury.Cell Physiol Biochem,2009,24(5-6):619-626.

17 蔡佳盈,沈世忠,萬建新.瞬時受體電位通道蛋白6參與血管緊張素Ⅱ誘導足細胞損傷的信號傳導機制.腎臟病與透析腎移植雜志,2014(5):458-461.

(本文編輯 青 松)

Expression of transient receptor potential melastatin 3 in diabetic nephropathy mice

YUHaixia1,2,3,GUOJia1,2,LIUDongwei1,2,QINLi1,2,3,YUQi1,2,3,LIUZhangsuo1,2

1DepartmentofNephrology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China2NephrologyResearchInstituteofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China3InstituteofClinicalMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China

LIUZhangsuo(E-mail:zhangsuoliu@sina.com)

Objective：To study the expression of transient receptor potential melastatin 3 (TRPM3) in the internationally recognized db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy, in human tubular epithelial cells (HK2) and conditionally immortalized mouse podocytes (MPC) under high glucose. Methodology：Twenty male five-week db/db mice were randomly divided into two groups (eachn=10), and we used db/m mice of littermate as the normal control group (n=20). At the age of 10 weeks and 18 weeks, the samples of blood, urine and renal tissues were collected. The biochemical indexes were measured. The expression of TRPM3 in renal tissues was assessed by Western blot、qRT-PCR and immunohistochemistry respectively. HK2 and MPC were cultured in vitro and divided into the following groups: (1) Normal control group (D-glucose 5.6 mmol/L); (2) Mannitol group (D-glucose 5.6 mmol/L+D-mannitol 24.4 mmol/L); (3) High glucose group (D-glucose 30 mmol/L).The corresponding indexes were measured at 24th，48th and 72th hour. Western blot and qRT-PCR were used to examine the expression of TRPM3 in protein and mRNA. Results：Compared with the 10w db/m mice, the expression of TRPM3 in the 10w db/db and 18w db/db mice was increased significantly (P<0.05). In cultured HK2 and MPC, the protein and mRNA expression of TRPM3 was increased in High glucose group, compared with the normal control group (P<0.05). Conclusion：TRPM3 can be expressed in the renal tubules and glomerulus of mouse, and high glucose can induce the higher expression of TRPM3 in HK2 and MPC. TRPM3 may be involved in the development of diabetic nephropathy.

diabetic nephropathy transient receptor potential melastatin 3 human tubular epithelial cells (HK2) conditionally immortalized mouse podocytes (MPC)

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.02.008

1鄭州大學第一附屬醫(yī)院腎臟內科(鄭州，450052)；2鄭州大學腎臟病研究所；3河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室

劉章鎖(E-mail:zhangsuoliu@sina.com)

2016-11-02

? 2017年版權歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有