樓柯浪 陶倩 張水利 俞冰 睢寧 張春椿

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

主成分分析下磐安浙貝母鱗莖最佳采收期的研究

樓柯浪 陶倩 張水利 俞冰 睢寧 張春椿

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

[目的]測定磐安浙貝母鱗莖主成分的含量，確定浙產(chǎn)浙貝母最佳采收期。[方法]分別采用HPLC-ELSD、酸性染料比色法、生物量法測定磐安地區(qū)浙貝母不同生長期鱗莖中貝母素甲、貝母素乙、總生物堿和生物量。[結(jié)果]磐安地區(qū)浙貝母鱗莖總生物堿含量在3月底、4月初最低，在5月初達(dá)到峰值，而鱗莖貝母素甲和貝母素乙含量變化規(guī)律則與其相反。結(jié)合生物量后，浙貝母鱗莖主成分含量在4月底5月初達(dá)到最高值。[結(jié)論]結(jié)合浙貝母鱗莖生物量、地上部分的生物學(xué)特性進(jìn)行綜合判斷，磐安地區(qū)浙貝母最佳采收期在其果期末期、枯萎初期。

浙貝母；總生物堿；含量測定；生物量；采收期；磐安；浙八味

浙貝母為百合科(Liliaceae)植物浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq．）的干燥鱗莖，味苦，性寒，歸肺心經(jīng)，具有清熱化痰、開郁散結(jié)之功效，常用于風(fēng)熱、燥熱、痰火咳嗽、乳癰、肺癰、瘰疬、心胸郁悶、瘡毒等癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，浙貝母具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎等作用[2]。對(duì)浙貝母的化學(xué)成分研究表明，浙貝母生物堿是其止咳、化痰和平喘等作用的有效成分[3]。浙貝母于每年10月下旬發(fā)根，次年2月發(fā)芽，花果期在3月底到4月中上旬，5月枯萎，通常于植株枯萎時(shí)采收。

浙江磐安為浙貝母的主產(chǎn)區(qū)，種植約 7.5× 104hm2，年產(chǎn)量600多噸[4]。但浙貝母采收時(shí)間往往根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)和市場供求來判斷的，造成采收期范圍波動(dòng)較大，直接影響了藥材質(zhì)量。為合理評(píng)價(jià)浙貝母藥材質(zhì)量，揭示浙貝母主產(chǎn)區(qū)磐安的浙貝母鱗莖生物堿類有效成分含量與生物量之間積累動(dòng)態(tài)規(guī)律，本文采用HPLC-ELSD、酸性染料比色法、生物量法，分別測定浙貝母鱗莖中貝母素甲、貝母素乙、總生物堿和生物量含量，綜合生物學(xué)特性，確定其最佳采收期。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 AR224CN電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；GZX-9070 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；Spectrumlab 22PC紫外分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；PHS-3TC型pH計(jì)（上海天達(dá)儀器有限公司）；B-220型電熱恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-2200DA型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Waters1525高效液相色譜儀（美國waters公司）；Empower 2色譜工作站（美國waters公司）；Waters2424蒸發(fā)光散色檢測器（美國waters公司）；HypersilC18（250mm×4.6mm，5μm，大連依利特分析儀器有限公司）；KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑 貝母素甲對(duì)照品（批號(hào)：110750-201110，中國生物制品檢定所）；貝母素乙對(duì)照品（批號(hào)：110751-200709，中國生物制品檢定所）；乙腈（色譜純，批號(hào)：3BA0015，Spectrum Chemical Mfg.Corp.）；溴麝香草酚藍(lán)、鄰苯二甲酸氫鉀、碘化鉍鉀、氫氧化鈉、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷、冰乙酸、乙酸乙酯均為分析純。

1.3 供試藥材 浙貝母鱗莖于不同時(shí)期采于浙江磐安大盤山，見表1。經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張水利教授鑒定為百合科植物浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）的鱗莖。

表1 供試藥材采集時(shí)間與生物量Tab.1 Collection time and biomass of tested materials

2 方法與結(jié)果

2.1 浙貝母鱗莖生物量的測定 將不同時(shí)期采來的新鮮浙貝母鱗莖洗盡，去芯芽，切厚片，曬干至恒重，稱重，計(jì)算其平均質(zhì)量作為生物量，結(jié)果見表1。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，浙貝母的生物量為縱坐標(biāo)作圖可以看出浙貝母鱗莖的重量在4月上、下旬和5月后增長緩慢，而在4月中旬增長迅速。見圖1。

2.2 浙貝母鱗莖總生物堿含量的測定

2.2.1 樣品溶液的制備 分別取不同時(shí)期采收的浙貝母鱗莖粉末（過四號(hào)篩）約2.00g，精密稱定，置錐形瓶中，加濃氨水4mL浸潤0.5h，精密加入三氯甲烷：甲醇（4:1）的混合溶劑40mL，稱定，混勻，置超聲儀（80W）中超聲1.0h，放冷，再稱定，加上述混合溶劑補(bǔ)足質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液10mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)尤燃淄槿芙獠⑥D(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻。

圖1 浙貝母時(shí)間-生物量曲線圖Fig.1 Biomass time curve of Fritillaria thunbergii Miq．

2.2.2 最大吸收波長的確定 精密稱取貝母素乙對(duì)照品2.4 mg，加三氯甲烷溶解并定容于10mL容量瓶中。精密吸取此標(biāo)準(zhǔn)品液2.0mL，加三氯甲烷使成15mL，置于分液漏斗中，再加入pH=5.0的鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液2mL，再加入0.001mol·L-1麝香草酚藍(lán)指示液2mL[5]，振搖15min，靜置30min后，分取三氯甲烷層，在350～650nm的波長處掃描；另取2.2.1項(xiàng)下不同時(shí)期采收的浙貝母鱗莖樣品液和三氯甲烷15mL，以同樣方法操作。如圖2可知浙貝母生物堿在酸性染料中最大吸收波長為415nm，根據(jù)“吸收最大，干擾最小”的原則確定浙貝母總生物堿測定的吸收波長為415nm。

圖2 生物堿酸性染料液的紫外——可見光吸收光譜Fig.2 UV Vis absorption spectra of acid dye solution

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下貝母素乙對(duì)照品溶液0.1、0.6、1.1、1.6、2.1mL至15mL容量瓶中，加三氯甲烷使成15mL，置于分液漏斗中，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行比色測定，以貝母素乙的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.0302X+0.1026，R2=0.9995。貝母素乙在1.6～33.6μg·mL-1的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液0.5mL至15mL容量瓶中，6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，測定吸光度。結(jié)果RSD=0.37%(n=6)＜3%，表明儀器性能良好。

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取3號(hào)浙貝母鱗莖6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法提取總生物堿；精密移鱗莖供試品溶液0.2mL，按“2.2.2”項(xiàng)下操作，于最大吸收波長處測定吸光度，計(jì)算RSD=0.55%(n=6)＜3%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.6 顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取對(duì)照品貝母素乙溶液0.5mL至15mL容量瓶中，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，樣品顯色后0、10、30、45、60、90、120min后于最大吸收波長處測定吸光度值。計(jì)算RSD=0.37%(n=6)＜3%，表明顯色在2h時(shí)間段內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的9份3號(hào)浙貝母鱗莖粉末2.00g，加入濃氨試液4 mL，再分別加入相當(dāng)于貝母素乙對(duì)照品0.096、0.12、0.144mg濃度的溶液，每個(gè)質(zhì)量平行3份，浸潤30min，置具塞錐形瓶中，精密加入用三氯甲烷∶甲醇（4:1）的混合溶液40mL，按優(yōu)化后的提取方式提取，制得樣品溶液，取0.1mL樣品溶液至15mL容量瓶中，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，以相應(yīng)試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在最大吸收波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率，RSD=2.93%(n=9)＜3%，表明回收率良好。

2.2.8 總生物堿含量測定 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)中所得樣品溶液0.1mL，置15mL容量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，以相應(yīng)試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在最大吸收波長處測定吸光度?？偵飰A量時(shí)間變化趨勢見圖3。

2.3 浙貝母鱗莖指標(biāo)性成分檢測

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18（250mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相：乙腈-（含0.05%三乙胺）水（75:25）。

2.3.2 樣品溶液的制備 在《中國藥典》（Ⅰ部）（2010版）[1]中記載樣品溶液制備方法上稍加改變，提取時(shí)由回流改為超聲。分別取不同產(chǎn)地浙貝母鱗莖粉末（過60目篩）2.00g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加濃氨水試液4.00mL，浸潤30min，精密加入氯仿∶甲醇（4:1）的混合溶劑40mL，稱定，混勻，超聲提取1h。再稱定，加上述氯仿∶甲醇（4:1）的混合溶劑，補(bǔ)足重量，濾過。精密量取上述濾液10mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得，作為樣品溶液備用。

圖3 浙貝母總生物堿量變化曲線圖Fig.3 The total alkaloid change curve of Fritillaria thunbergii Miq.

2.3.3 對(duì)照品溶液的配制 取貝母素甲對(duì)照品、貝母素乙對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成1.0mL含貝母素甲0.20mg、貝母素乙0.22mg的溶液，即得，作為對(duì)照品溶液備用。

2.3.4 指標(biāo)性成分含量測定 分別精密吸取對(duì)照品溶液10μL、20μL，“2.3.2”項(xiàng)下樣品溶液5~15μL，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別計(jì)算貝母素甲、貝母素乙的含量。浙貝母色譜圖見圖4，貝母素甲（進(jìn)樣量為20μL）和貝母素乙（進(jìn)樣量為15μL）對(duì)照品HPLC-ELSD色譜圖見圖5、6。以生物量與貝母素甲、貝母素乙含量乘積值進(jìn)行綜合分析，描述其積累規(guī)律，見表2。貝母素甲、貝母素乙含量的時(shí)間變化曲線圖見圖7。浙貝母生物堿累積變化趨勢圖見圖8。

表2 6批次貝母素甲、素乙累積量Tab.2 Six batches of medicinal materials peimine,peiminine accumulation

3 分析與討論

3.1 生物量 廣義的生物量是生物在某一特定時(shí)刻單位空間的個(gè)體數(shù)、重量或含能量，可用于指某種群、某類群生物的（如浮游動(dòng)物）或整個(gè)生物群落的生物量。狹義的生物量僅以重量表示，可以是鮮重，或者是干重。本文所測生物量均為狹義的生物量，即為浙貝母鱗莖的干重。

圖4 3月30號(hào)浙貝母樣品HPLC-ELSD色譜圖Fig.4 In March 30th,HPLC-ELSD chromatography of Fritillaria thunbergii Miq.

圖5 貝母素甲標(biāo)準(zhǔn)品HPLC-ELSD色譜圖Fig.5 HPLC-ELSD chromatography of Peimine standard

圖6 貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品HPLC-ELSD色譜圖Fig.6 HPLC-ELSD chromatography of Peiminine standard

3.2 總生物堿 浙貝母所含生物堿種類繁多，如需準(zhǔn)確地測定總生物堿含量，則應(yīng)分離得到所有個(gè)體生物堿后再行測定，此操作繁瑣耗時(shí)，資源消耗大。總生物堿的測定一般以其中主要生物堿為代表計(jì)算的近似值，而已知浙貝母中貝母素乙含量豐富，檢測方法相對(duì)貝母素甲較為成熟，因此本文采用常用總生物堿檢測法酸性染料比色法，以貝母素乙含量作為總生物堿的近似值進(jìn)行測定。

圖7 貝母素甲、貝母素乙含量的時(shí)間變化曲線圖Fig.7 Peimine,peiminine content of the time change curve

圖8 浙貝母生物堿累積變化趨勢圖Fig.8 Change trend of alkaloids accumulation of Fritillaria thunbergii Miq.

3.3 浙貝母鱗莖不同成分的最佳采收期 由圖1可以看出浙貝母鱗莖的生物量在4月中旬增長迅速，于4月底之后增長速度放緩，趨于平穩(wěn)狀態(tài)，甚至有下降趨勢，可能是因?yàn)檎阖惸阜N質(zhì)之間的差異造成的，也可能是因?yàn)榛ü谥仓暾w消耗增大，營養(yǎng)成分供不應(yīng)求，浙貝母鱗莖生物量分解用于支撐植物生長發(fā)育。若單純以生物量為指標(biāo)，則浙貝母最佳采收期在4月底之后。

由圖3可知，浙貝母總生物堿從3月底到4月底5月初總體呈增長趨勢，5月10日和5月21日相差不大，較5月1日呈下降趨勢，趨于平緩。若單以浙貝母總生物堿為指標(biāo)，則浙貝母最佳采收期在4月底、5月初期。并且浙貝母總生物堿結(jié)合生物量之后可更直觀的發(fā)現(xiàn)采收浙貝母實(shí)現(xiàn)價(jià)值最大化的時(shí)間亦在4月底5月初期，即浙貝母花果期。王艷紅等采用酸性染料比色法與兩相滴定法測得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明不同采收期的平貝母中總生物堿高含量有兩個(gè)時(shí)期，即花果期與 8月開始延至 10月份的枯萎中后期[6]。而在李松林等采用酸性染料比色法測定江蘇南通和浙江寧波兩產(chǎn)地不同月份的浙貝母總生物堿的月積累動(dòng)態(tài)，確定了浙貝母以5月份為最佳采收期[7]。由此可初步推斷貝母總生物堿含量在其花果期達(dá)到峰值。

由圖7可以看出，貝母素甲和貝母素乙含量隨著時(shí)間變化整體呈下降趨勢，3月30日到4月9日下降最快，之后趨于平緩。若以貝母素甲和貝母素乙含量為判斷指標(biāo)，則最佳采集時(shí)間為3月底4月中上旬，與王和平等得出的結(jié)論一致[8]。但綜合其生物量不難發(fā)現(xiàn)，浙貝母貝母素甲和貝母素乙的量從4月上旬快速升高，5月初之后放緩，如圖8。若只單考慮總生物堿或其主要有效成分，沒有從鱗莖的生物量變化與其內(nèi)在的有效成分含量之間的關(guān)系來說明，會(huì)導(dǎo)致確定采收期的時(shí)間比較模糊，甚至兩者結(jié)論完全相反。

3.4 環(huán)境因子對(duì)浙貝母鱗莖采收期的影響 本實(shí)驗(yàn)以浙貝母鱗莖生物量結(jié)合總生物堿、貝母素甲和貝母素乙含量為判斷指標(biāo)可確定磐安地區(qū)浙貝母最佳采收期為4月底5月初，即浙貝母花果期末期，枯萎初期。但因地理環(huán)境不同，氣候差異，土壤差別等環(huán)境因子影響，無法以偏概全確定全國浙貝母最佳采收期。如鄭堅(jiān)等發(fā)現(xiàn)浙江文成、江蘇南通浙貝母出苗早于浙江鄞縣、文成、鄞縣浙貝母，枯萎期早于南通[9]。浙貝母的強(qiáng)適應(yīng)性使其無論高低海拔，內(nèi)陸海島均能適應(yīng)生長。因此固定的時(shí)間節(jié)點(diǎn)無法準(zhǔn)確地描述全國范圍內(nèi)浙貝母的最佳采收期，還需結(jié)合浙貝母地上部分生物學(xué)特性進(jìn)行綜合判斷。

3.5 浙貝母鱗莖的最佳采收期 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)浙貝母鱗莖總生物堿、貝母素甲和貝母素乙質(zhì)量增長趨于平緩時(shí)正處于浙貝母花果期與枯萎期過渡階段，與王艷紅、李松林等人[6-7]測得浙貝母總生物堿含量在花果期處于峰值、果期與枯萎期出現(xiàn)低程度下降相符。由此可初步判斷，浙貝母最佳采收期在其果期末期、枯萎初期。

References:

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:94．National Pharmacopoeia Commission.al.Pharmacopoeia of the People's Republic of China 2010 edition of a[S]. Beijing:China Pharmaceutical Scienceand Technology Press,2010:94.

[2] 卓詩勤,張浩,丁弋娜,等.硫熏和鮮切浙貝母的化學(xué)成分及其藥理作用的比較研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2016,34(3): 618-621. ZHUO Shiqin,ZHANG Hao,DING Yina,et al.A Comparative Study on the Chemical Constituents and PharmacologicalEffectsofSulfurFumed and Fresh Fritillaria thunbergii[J].Journal of Chinese Medicine,2016,34(3):618-621.

[3] 喬立俊.延胡索有效成分提取工藝研究[J].中藥制劑工程與技術(shù),2009,10(6):23．QIAO Lijun.Study on Extraction Technology of Active Components from Corydalis yanhusuo[J].Traditional Chinese Medicine Preparation Engineering and Technology, 2009,10(6):23.

[4] 徐金中,張紅葉,馬喜彥,等.浙江主產(chǎn)區(qū)栽培浙貝母種質(zhì)遺傳多樣性的AFLP分析[J].中草藥,2010,41(1):109-110. XU Jinzhong,ZHANG Hongye,MA Xiyan,et al.Genetic diversity of Fritillaria thunbergii cultivated in main producing areas of Zhejiang Province by AFLP analysis[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs,2010,41(1):109-110.

[5] 徐曉婷,田婧,林宏英,等.浙貝母總生物堿提取工藝優(yōu)化研究[J].世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化),2012,82(6):2231-2234. XU Xiaoting,TIAN Jing,LIN Hongying,et al.Study on Extraction Technology of Total Alkaloids from Fritillaria thunbergii[J].World Science and Technology(Modernization of Traditional Chinese Medicine),2012,82(6):2231-2234.

[6] 王艷紅,吳曉民,鄭友蘭.不同產(chǎn)地和采收期的平貝母總生物堿含量[J].中藥材,2006,29(1):8-9. WANG Yanhong,WU Xiaomin,ZHENG Youlan.al.The total alkaloid content of Fritillaria ussuriensis from different producing areas and harvest time[J].Chinese Traditional and Medicinal Materials,2006,29(1):8-9.

[7] 李松林,李萍,卞蕓蕓,等.浙貝母總生物的月積累動(dòng)態(tài)的研究[J].中國中藥雜志,1999,24(10):592-593. LI Songlin,LI Ping,BIAN Yunyun,et al.Study on the Monthly Accumulation Dynamics of Fritillaria thunbergii [J].Chinese JournalofTraditionalChinese Medicine, 1999,24(10):592-593.

[8] 王和平,高莉莉,董珂.浙貝母不同采集時(shí)間及加工方法的研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2007,35(6):35-36. WANG Heping,GAO Lili,DONG Ke.Study on different acquisition time and processing method ofFritillaria thunbergii[J].Chinese JournalofTraditionalChinese Medicine,2007,35(6):35-36.

[9] 鄭堅(jiān),陶正明,李林,等.不同產(chǎn)區(qū)浙貝母種(鱗)莖環(huán)境因子及產(chǎn)量研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,35(5):356-358. ZHENG Jian,TAO Zhengming,LI Lin,et al.Studies on environmental factors and yield of Fritillaria thunbergii seedling in different areas[J].Zhejiang Agricultural Sciences,2005,35(5):356-358.

Study on the Best Harvest Time of Fritillaria Thunbergii in Pan'an Based on Main Components

LOU Kelang,TAO Qian,ZHANG Shuili,et al Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

[Objective]Dynamic changes of biomass and alkaloids of Fritilarise thunbergii Bulbus were determined to assess the optimal collection time. [Methods]The contents of total alkaloids in the bulbs of Fritillaria thunbergii at different growth stages were determined by HPLC-ELSD,acid dye colorimetric method and biomass method.[Results]The total alkaloid content of Fritillaria thunbergii bulb in Pan’an in late March and early April the lowest peak in early May,and the bulb of peimine and peiminine in the opposite.Combined with biomass,the main components in bulbs of Fritillaria thunbergii reached the highest value at the end of April and early May.[Conclusion]Combined with the biomass in bulbs of Fritillaria thunbergii and the biological characteristics of the ground part of the comprehensive judgment,we found that the best harvest period of Fritilarise thunbergii.was between the end stage of its fruit stage and the early stage of withering stage.

Fritillaria thunbergii Miq.;total alkaloids;determination of content;biology quantity;harvest period；Pan’an；eight drugs in Zhejiang

R282.71

A

1005-5509（2017）04-0329-07

10.16466/j.issn1005-5509.2017.04.018

2016-12-21）

浙江省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)資金項(xiàng)目（浙經(jīng)信醫(yī)化〔2010〕492號(hào)）；國家自然科學(xué)基金青年基金（81603222）；浙江省博士后科研項(xiàng)目擇優(yōu)資助（浙人社發(fā)[2016]73號(hào)）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY12H28006）

Fund projects:Zhejiang Province specialfund project"The modernization oftraditionalChinese medicine(Z.J.X.Y.H [2010]492);National Natural Science Foundation of Zhejiang Province(81603222);Merit funded postdoctoral scientific research project(Z.R.S.F[2016]73)；Zhejiang Provincial Natural Science Foundation Project(LY12H28006).

張春椿，E-mail：10928485@qq.com