沈 芳，梁 培，陸 紅

（浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江杭州 311402）

苦參堿（matrine，MT）具有抗心律失常［1］、減輕心肌損傷、抗纖維化［2-4］、抗炎［5-6］、抗病毒和升白細胞［7］等多種藥理活性，是苦參（Sophora flavescensAit.）、山豆根（S.onkinensisGapnep.）和苦豆子（S.alopecuroidesL.）等中藥材的活性成分［8］?？鄥A葡萄糖注射液、注射用苦參堿和含苦參堿的中藥復方消銀方等多種臨床常用中藥均含有苦參堿成分。在與苦參堿相關(guān)的不良反應報道中，最為嚴重的是神經(jīng)系統(tǒng)不良反應［9］，臨床表現(xiàn)為異常步態(tài)［10］、心跳加速、頭暈眼花［11］、易興奮、疲乏、言語不清和肌肉抽搐［12］等。本課題組前期研究結(jié)果表明，MT在10和40 mg·kg-1劑量下可抑制ICR小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)，損害其平衡協(xié)調(diào)能力［13］。

大腦組織富含多價不飽和脂肪酸［14］，對自由基非常敏感［15］；神經(jīng)細胞為了維持正常生理功能需依賴高濃度葡萄糖代謝，線粒體氧化磷酸化是其主要糖代謝途徑，當外界刺激使線粒體氧化磷酸化受損，導致神經(jīng)細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆積，引起氧化應激反應［16-17］，進而損傷DNA和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生細胞毒效應［18］。本研究以PC12細胞為受試對象，研究MT的神經(jīng)毒性，并探討其毒性機制是否與ROS參與的線粒體途徑誘導細胞凋亡有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

MT購于南京廣潤制品有限公司（白色粉末，純度≥98%，批號：GR-133-140103）；DMEM/F12 培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；胎牛血清（批號：130126）購于杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%，T1320）購于中國Solarbio公司；甲基噻唑基四唑（methylthiazolyltetrazolium，MTT，批號：822A054）購于美國Sigma公司；Hoechst33342染色液（C1025）、AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（C1063）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（S0131）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（S0101）、ROS檢測試劑盒（S0033）、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒（C2006）、二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（P0012）均購于碧云天生物技術(shù)有限公司；β肌動蛋白（sc-47778）購于美國 Santa Cruz 公司；HRP-山羊抗小鼠lgG（BL001A）購于Biosharp公司；HRP-山羊抗兔lgG（BA1054）購于博士德生物公司；抗胱天蛋白酶原9抗體（ab32068）和抗胱天蛋白酶原3抗體（9ab32068）均購于美國Abcam公司；抗活化的胱天蛋白酶3抗體（#9665）購于美國CST公司；Bax抗體（#5023）和Bcl-2抗體（#4223）購于美國CST公司。

Electron 1287生物安全柜、HEPA CLASS100型細胞CO2培養(yǎng)箱和全波長多功能酶標儀（美國Thermo公司），UNIVERSAL320/320R臺式（常溫/冷凍）離心機（德國Hettich公司），Ti-U熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司），Mini-PROTEAN165-8004電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

PC12細胞為浙江中醫(yī)藥大學藥學院楊元宵博士饋贈，用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基（即培養(yǎng)液）在37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察PC12細胞生長情況，細胞融合至80%以上時經(jīng)胰酶消化，傳代。選取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.3 MTT法檢測細胞存活率

將PC12細胞以每孔5×103個接種于96孔板，置37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，至細胞融合度達70%～80%用于實驗。將細胞分為正常對照組和MT 2，4和8 mmol·L-1組，各組吸棄舊培養(yǎng)液，分別加入含MT 0，2，4和8 mmol·L-1的培養(yǎng)液每孔100 μL，每組設(shè)6個復孔。另設(shè)調(diào)零組（只加培養(yǎng)液，無細胞），用于去除溶液本底。分別于給藥6，12，24和48 h后，每孔加MTT（5 g·L-1）溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h后小心吸棄上清液，每孔加DMSO 150 μL，室溫下振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物，用酶標儀于490 nm波長測定各孔吸光度（A490nm）值，實驗重復3次。細胞存活率（%）=（給藥組A490nm-調(diào)零組A490nm）（/正常對照組A490nm-調(diào)零組A490nm）×100%。

1.4 Hoechst33342熒光染色觀察細胞核形態(tài)

細胞以每孔1×105接種于6孔板中，置37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，至細胞融合度達70%～80%時用于實驗。細胞分為正常對照組和MT（2，4和8 mmol·L-1）組，各組吸棄舊培養(yǎng)液，分別加入含 MT 0，2，4 和 8 mmol·L-1的培養(yǎng)液每孔2 mL，藥物作用24 h后，按Hoechst33342染色液說明書操作，置熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)變化。

1.5 AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡

細胞接種、分組與藥物處理步驟同1.4，藥物作用24 h后收集PC12細胞，1000×g4℃離心5 min，充分吸棄上清液。按AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，樣品在1 h內(nèi)采用流式細胞儀（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm及575 nm）檢測PC12細胞凋亡率。

1.6 DCFH-DA染色后流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS含量

細胞接種、分組與藥物處理步驟同1.4，藥物作用24 h后收集細胞，1000×g室溫離心5 min，棄上清，加入1 mL DCFH-DA（10 μmol·L-1）重懸，置于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，無血清培養(yǎng)液洗滌3次，按ROS檢測試劑盒說明書操作，用流式細胞儀檢測熒光值計算ROS含量，激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm。

1.7 細胞內(nèi)SOD活性及MDA含量的測定

PC12細胞以4×106接種于25 cm2玻璃培養(yǎng)瓶，至細胞融合度達70%～80%時吸棄舊培養(yǎng)液，細胞分組與藥物處理步驟同1.4，每瓶加藥4 mL作用24 h。按照SOD和MDA試劑盒方法操作，用酶標儀分別測定A550nm和A450nm，計算樣品中總SOD活性及MDA含量。

1.8 細胞MMP測定

細胞以每孔1×105接種于6孔板中，置37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，至細胞融合度達70%～80%時用于實驗。將細胞分為正常對照組、MT（2，4和8 mmol·L-1）組和陽性處理（羰基氰化物間-氯苯基腙10 μmol·L-1）組，藥物作用24 h后吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，按照MMP檢測試劑盒說明操作后，用熒光顯微鏡觀察熒光強度變化，以此反映線粒體膜電位變化。

1.9 Western蛋白印跡法檢測胱天蛋白酶原3，胱天蛋白酶原9，活化的胱天蛋白酶3，Bax和Bcl-2蛋白含量

細胞接種、分組與藥物處理步驟同1.4，藥物作用24 h后吸棄舊培養(yǎng)液，將細胞裂解，1000×g4℃離心5 min，取上清液，用BCA法測定各組樣品總蛋白濃度，取20 μg總蛋白上樣，經(jīng)12%SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（1∶1000）4°C孵育過夜，二抗（1∶5000）室溫下孵育2 h，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行圖像采集，Imagel軟件進行半定量分析，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度（IA）值的比值表示目標蛋白相對表達水平。

1.1 0統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 MT對PC12細胞存活率的影響

如圖1所示，與正常對照組相比，MT作用8 h后，2 mmol·L-1組細胞存活率無顯著性差異，4和8 mmol·L-1組細胞存活率顯著性降低（P＜0.01）；當作用時間為≥12 h，MT各濃度組細胞存活率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），表明隨著苦參堿濃度的增加及作用時間的延長，其對PC12細胞的損傷愈加明顯。

Fig.1 Effect of matrine（MT）on viability of PC12 cells by methylthiazolyltetrazolium（MTT）assay.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control（0）group.

2.2 MT對PC12細胞凋亡的影響

Hoechst33342染色結(jié)果顯示，正常對照組細胞核大小均勻，染色質(zhì)無濃縮；而MT組隨濃度升高細胞數(shù)減少，胞質(zhì)濃縮，邊緣化，形態(tài)大小不一，甚至出現(xiàn)細胞核破碎（圖2）。AnnexinⅤ/FITC-PI雙染檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，MT各濃度組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）（圖3）。

2.3 MT對PC12細胞ROS含量的影響

如圖4所示，與正常對照組相比，MT 2，4和8 mmol·L-1組細胞內(nèi)ROS含量均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 MT對PC12細胞內(nèi)SOD活性及MDA含量的影響

Fig.2Effect of MT on apoptosis of PC12 cells by Hoechst33342 staining（×200）.Cells were treated with MT for 24 h，followed by staining with Hoechst3334210 mg·L-1 for 30 min at 37°C and observed under a fluorescence inverted microscope.Arrows indicate apoptotic cells.

Fig.3 Effect of MT on apoptotic of PC12 cells by flow cytometry.PC12 cells were treated with MT for 24 h，followed by incubation with AnnexinⅤ-FITC/PI for 20 min.B was the quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control（0）group.

與正常對照組相比，MT處理24 h后PC12細胞內(nèi)SOD活性顯著降低（P＜0.01）（圖5A）；MDA含量顯著增加（P＜0.01）（圖5B）。

Fig.4 Effect of MT on reactive oxygen species（ROS）level of PC12 cells by flow cytometry.Cells were treated with MT for 24 h，followed by staining with DCFH-DA 10 μmol·L-1 for 20 min at 37°C.B was the quantitative result of A.FI：fluoresccncc intensity.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control（0）group.

Fig.5 Effect of MT on superoxide dismutase（SOD）activity（A）and malondialdehyde（MDA）content（B）of PC12 cells by hydroxylamine method and thiobarbi?turic acid method.Cells were treated with MT for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control（0）group.

2.5 MT對PC12細胞MMP的影響

如圖6所示，正常對照組PC12細胞在熒光顯微鏡下呈均勻而強烈的紅色熒光，說明細胞MMP正常。羰基氰化物間-氯苯基腙10 μmol·L-（1陽性處理）組細胞線粒體受損，視野下幾乎無紅色熒光，而顯示綠色熒光；MT處理24 h后，隨給藥濃度增加PC12細胞紅色熒光強度逐漸減弱，綠色熒光增強，表明MT能降低PC12細胞MMP。

Fig.6 Effect of MT on mitochondrial membrane potential（MMP）of PC12 cells by JC-1 staining.Cells were treated with MT for 24 h，stained with JC-1 and observed under a fluorescence inverted microscope.The red fluorescence represents the normal MMP，and the green fluorescence represents the decrease of MMP，carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone（CCCP）was the positive control（0）group.

2.6 MT對PC12細胞內(nèi)胱天蛋白酶原3、胱天蛋白酶原9、活化的胱天蛋白酶3、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

圖7所示，與正常對照組相比，MT各濃度組PC12細胞內(nèi)胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3蛋白水平顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），活化的胱天蛋白酶3蛋白水平顯著上升（P＜0.05，P＜0.01），提示胱天蛋白酶被剪切發(fā)生活化。圖8所示，與正常對照組相比，MT各濃度組PC12細胞內(nèi)Bcl-2蛋白水平顯著下降（P＜0.01），Bax蛋白水平顯著上升（P＜0.01）。與正常對照組相比，MT各濃度組均顯著降低Bcl-2/Bax的比值（P＜0.01）（圖8C），也進一步表明苦參堿能誘導PC12細胞凋亡。

Fig.7 Effect of MT on expression of procaspase 3，procaspase 9 and cleaved-caspase 3 of PC12 cells by Western blotting.See Fig.5 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control（0）group.

Fig.8 Effect of MT on Bcl-2 and Bax expression of PC12 cells by Western blotting.See Fig.5 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control（0）group.

3 討論

研究結(jié)果表明，隨著MT的濃度增加及作用時間延長，MT對PC12細胞的毒性增強。Hoechst33342染色后，熒光倒置顯微鏡下觀察PC12細胞核固縮、破裂，且AnnexinⅤ-FITC/PI染色結(jié)果表明MT能夠引起PC12細胞凋亡，提示MT具有一定的神經(jīng)毒性。

氧化應激學說在神經(jīng)毒性機制的研究中占有重要地位，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對ROS的攻擊特別敏感，ROS過多可以損傷細胞，細胞損傷后又會加劇ROS的蓄積，從而進一步誘導細胞凋亡。線粒體是為細胞生命活動提供能量的直接場所，線粒體呼吸鏈通過歧化作用和超氧負離子生成ROS，過量的ROS可以誘發(fā)線粒體膜電位降低［19］，使線粒體膜通透性增加，細胞色素c和細胞凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）等從線粒體膜內(nèi)釋放至胞質(zhì)中，細胞色素c與凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）形成多聚復合體，通過Apaf-1使胱天蛋白酶原9自我剪切活化并激活胱天蛋白酶級聯(lián)反應，從而激活胱天蛋白酶原3，導致細胞凋亡的發(fā)生［20］。而線粒體通路由含結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族成員Bid，Bim和Bax等在接受到細胞內(nèi)的死亡信號后激活［21］。Bcl-2蛋白家族以抗凋亡蛋白Bcl-2和抑凋亡蛋白Bax為代表，而Bcl-2/Bax可作為判斷細胞凋亡敏感性的指標［22］。本研究結(jié)果顯示，給予MT處理的PC12細胞MMP降低，且胱天蛋白酶原9和胱天蛋白酶原3顯著下降，表明胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3被激活，而Bcl-2/Bax的比值也顯著下降，提示MT通過激活線粒體途徑誘導PC12細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度MT處理PC12細胞24 h后ROS含量增加，并呈劑量依賴性；同時SOD活性顯著下降，而MDA含量顯著增加。

綜上所述，MT對PC12細胞具有一定毒性，其機制可能與促發(fā)氧化應激損傷，激活線粒體途徑，誘導細胞凋亡有關(guān)。

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