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      長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸?;撬嵘险{(diào)基因1在肺腺癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義研究*

      2017-05-10 23:55:08韓鸚贏沈鵬
      關(guān)鍵詞:腺癌試劑盒編碼

      韓鸚贏,沈鵬

      (1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;2.天津市第一中心醫(yī)院 免疫科,天津 300192)

      長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸牛磺酸上調(diào)基因1在肺腺癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義研究*

      韓鸚贏1,沈鵬2

      (1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193;2.天津市第一中心醫(yī)院 免疫科,天津 300192)

      目的 探討長(zhǎng)鏈非編碼核醣核酸?;撬嵘险{(diào)基因1(lncRNA-TUG1)在肺腺癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。方法選取2012年1月-2014年12月間于天津市第一中心醫(yī)院胸外科行手術(shù)切除的肺腺癌患者的腫瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織40例。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)lncRNA-TUG1在組織中的表達(dá)水平,分析lncRNA-TUG1表達(dá)與患者臨床病例資料間的相關(guān)性;通過siRNA沉默人肺腺癌A549細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-TUG1的表達(dá),采用噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默lncRNA-TUG1后A549細(xì)胞增殖變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化,qRT-PCR及W estern blot檢測(cè)P16表達(dá)變化。結(jié)果lncRNA-TUG1在肺癌組織中表達(dá)水平高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(t=3.873,P=0.000),肺癌組織中l(wèi)ncRNA-TUG1高表達(dá)與腫瘤直徑增大(P=0.033)及高TNM分期(P=0.045)相關(guān);lncRNA-TUG1特異性siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后可抑制細(xì)胞增殖(P=0.041)并上調(diào)凋亡細(xì)胞比例(t=3.206,P=0.007);qRT-PCR及W estern blot結(jié)果證實(shí),沉默lncRNA-TUG1后可促進(jìn)P16 mRNA及蛋白表達(dá)水平(P=0.000)。結(jié)論lncRNA-TUG1在肺腺癌組織中表達(dá)上調(diào)并與腫瘤惡性臨床病理特征有關(guān),lncRNA-TUG1可能通過下調(diào)抑癌基因P16的表達(dá)來促進(jìn)肺腺癌生長(zhǎng)。

      lncRNA-TUG1;肺腺癌;增殖;凋亡;P16

      肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1],由于其早期癥狀隱匿,手術(shù)后易復(fù)發(fā)且放化療敏感性低等生物學(xué)特點(diǎn),肺癌已成為危害我國人民群眾身體健康的重大公共衛(wèi)生問題[2]。肺癌病理類型復(fù)雜,其中肺腺癌是女性和非吸煙者較為常見且惡性程度較高的病理類型之一[3],對(duì)肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的研究對(duì)于尋找新的治療靶點(diǎn)及提高我國肺癌診治水平具有重要意義。

      長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸(long noncoding ribonucleic acid,lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA[4],在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[5]。最新研究指出,長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸牛磺酸上調(diào)基因1(long noncoding ribonucleic acid taurine up-regulated gene 1,lncRNA-TUG1)在癌癥進(jìn)展過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[6],例如在結(jié)腸癌中,低表達(dá)的lncRNA-TUG預(yù)示著患者有較差的預(yù)后,并且對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲具有抑制作用[7]。而通過文獻(xiàn)檢索筆者發(fā)現(xiàn),其在肺腺癌中的臨床意義及生物學(xué)功能尚不清楚。本研究通過檢測(cè)lncRNA-TUG1的表達(dá)及對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡過程的調(diào)控作用,研究lncRNA-TUG1在肺癌生長(zhǎng)中的臨床意義及作用機(jī)制,為肺癌的分子診斷與靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

      1 資料與方法

      1.1 臨床標(biāo)本及主要試劑

      選取2012年1月-2015年12月于天津市第一中心醫(yī)院行手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)為肺腺癌患者的腫瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣>2 cm)40例。其中女性27例,男性13例;平均年齡(53.2±2.1)歲。RNA提取試劑盒fast 200購自上海飛捷生物科技有限公司。lncRNA-TUG1 siRNA及陰性對(duì)照siRNA,lncRNA-TUG1引物(正向引物5'-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG-3',反向引物5'-TAG CAGTTCCCCAATCCTTG-3'),P16引物(正向引物5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3',反向引物5'-CCACCTAAATCAACCTCCAACCA-3'),β-actin引物(正向引物5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3',反向引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3')均購自上海吉瑪生物科技有限公司。噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]試劑盒及Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購自上海生工生物科技有限公司,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR) 試劑盒[Prime ScriptTMRT reagentKi(tPerfect Real Time)]及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒[SYBRPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)]均購自大連寶生物工程有限公司,兔抗人P16多克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國CST公司。肺癌A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司。

      1.2 RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)

      按fast 200說明書分別提取組織及A549細(xì)胞中總RNA,經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè),光密度(optical delnsity,OD)260/OD280在1.9~2.1者為合格樣品。取500ng總RNA為模板,按RT-PCR試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,采用Random 6及Oligo-dT雙引物法逆轉(zhuǎn)錄細(xì)胞內(nèi)lncRNA及mRNA。逆轉(zhuǎn)錄完成后,以 2μl cDNA配制 qRT-PCR體系,按qRT-PCR說明書要求擴(kuò)增靶基因。

      1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

      A549細(xì)胞接種于6孔板中,接種密度以過夜培養(yǎng)后融合度可達(dá)50%為準(zhǔn)。依據(jù)2000說明書,以無血清改良伊格爾培養(yǎng)基做溶媒配制轉(zhuǎn)染試劑及siRNA工作液,分別向A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染lncRNA-TUG1 siRNA(lncRNA-TUG1組)及陰性對(duì)照siRNA(NC組)。轉(zhuǎn)染6 h后更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。

      1.4 MTT檢測(cè)

      分別收集轉(zhuǎn)染24、48及72 h后的A549細(xì)胞,重懸后以2 000/孔接種于96孔板中,調(diào)整細(xì)胞懸液體積為100μl/孔,培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。每孔加入10μl MTT試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清液后加入二甲基亞砜溶液溶解甲瓚結(jié)晶,15min內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)下的OD值。

      1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

      A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后使用PBS溶液洗滌細(xì)胞2次,按試劑盒說明書要求,采用Binding buffer(1×)重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至2×105/ml,于檢測(cè)管中加入195μl細(xì)胞懸液后加入5μl Annexin V-FITC,避光孵育15min后,使用200μl Binding buffer(1×)洗滌細(xì)胞并以1000 r/min離心細(xì)胞3min,再次以190μl Binding buffer(1×)溶液重懸細(xì)胞后加入10μl Propidium Iodide,避光孵育15min后于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

      1.6 Western blot檢測(cè)

      收集轉(zhuǎn)染72 h的A549細(xì)胞,使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,聚氰基丙烯酸正丁酯法測(cè)定總蛋白濃度。每孔上樣50μg蛋白后以BIO-RAD垂直電泳系統(tǒng)分離目的蛋白,以1∶1 000稀釋的P16及β-actin一抗結(jié)合相應(yīng)目的蛋白,以1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗結(jié)合一抗,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法發(fā)光檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

      1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

      數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)或ANOVA檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 lncRNA-TUG1在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)

      經(jīng)PCR定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),肺腺癌組織中l(wèi)ncRNATUG1的相對(duì)表達(dá)量(6.236±0.331)與對(duì)應(yīng)癌旁組織(2.344±0.107)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.873,P=0.000)。腫瘤直徑及TNM分期不同,肺腺癌組織中l(wèi)ncRNA-TUG1的表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中,腫瘤直徑增大(≥5 cm,P=0.034),高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期,P=0.041)者lncRNA-TUG1的表達(dá)水平較高。見附表。

      2.2 沉默lncRNA-TUG1對(duì)A549細(xì)胞增殖凋亡功能的影響

      通過qRT-PCR檢測(cè)證實(shí),lncRNA-TUG1特異性siRNA能明顯沉默細(xì)胞內(nèi)lncRNA-TUG1的表達(dá)水平,(1.000±0.000)vs(0.337±0.021)(t=23.466,P=0.000)。見圖1A。

      成功沉默A549細(xì)胞內(nèi)lncRNA-TUG1表達(dá)后,采用MTT法檢測(cè)lncRNA-TUG11表達(dá)水平變化對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響。與NC組比較,沉默lncRNA-TUG1后A549細(xì)胞的增殖活力下降(P=0.039)。對(duì)轉(zhuǎn)染72 h后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC和PI染色,通過流式細(xì)胞儀分析染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默lncRNA-TUG1對(duì)A549細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用,(19.295±1.077)vs(9.383±1.014),(t=4.406,P=0.038)。見圖1B~D。

      2.3 沉默lncRNA-TUG1對(duì)A549細(xì)胞中P16表達(dá)的影響

      P16是一種能通過與細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合物結(jié)合來抑制細(xì)胞周期進(jìn)展的抑癌蛋白。在A549細(xì)胞內(nèi)沉默lncRNA-TUG1表達(dá)后,通過qRT-PCR和 Western blot檢測(cè)表明,P16 mRNA[(1.000±0.000)vs(3.471±0.109),t=25.796,P=0.000]及蛋白[(0.386±0.050)vs(0.882±0.107),t=26.038,P=0.000]水平均較NC組升高,提示lncRNA-TUG1可能是通過抑制P16表達(dá)實(shí)現(xiàn)促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用的。見圖2A、B。

      附表 lncRNA-TUG1表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 (n=40,±s)

      附表 lncRNA-TUG1表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 (n=40,±s)

      項(xiàng)目lncRNA-TUG1相對(duì)表達(dá)量P值年齡<50歲6.719±0.211≥50歲 5.528±0.112 0.677吸煙與否吸煙6.193±0.121不吸煙 6.348±0.214腫瘤直徑<5 cm 4.853±0.237≥5 cm 6.894±0.214組織學(xué)分級(jí)G1~G26.089±0.107 G3 6.313±0.132淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無5.743±0.027有6.488±0.051 TNM分期無4.517±0.028有6.383±0.201 0.780 0.034 0.743 0.087 0.041

      圖1 沉默lncRNA-TUG1對(duì)A549細(xì)胞增殖凋亡的影響

      圖2 沉默lncRNA-TUG1對(duì)A549細(xì)胞P16表達(dá)的影響

      3 討論

      在我國,肺癌長(zhǎng)期占據(jù)惡性腫瘤發(fā)病率的首位[8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,生物靶向治療已成為肺癌重要的輔助治療手段,針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的易瑞沙、特羅凱及凱美納的分子靶向藥物已在肺癌治療上獲得巨大成功[9-11]。因而,尋找和研究有效的肺癌分子治療靶點(diǎn)對(duì)改善廣大肺癌患者預(yù)后具有重要意義。

      越來越多的證據(jù)顯示,包括mRNA及l(fā)ncRNA在內(nèi)的多種非編碼RNA對(duì)細(xì)胞的生理及病理過程具有重要影響。lncRNA-TUG1在組織發(fā)育和疾病的發(fā)生過程中均具有重要作用,例如神經(jīng)生物學(xué)證據(jù)表明,在小鼠大腦皮層發(fā)育的多個(gè)關(guān)鍵時(shí)期均能夠檢測(cè)到lncRNA-TUG1表達(dá)的顯著上調(diào)[12],而內(nèi)分泌學(xué)研究結(jié)果則表明,沉默lncRNA-TUG1的表達(dá)會(huì)促進(jìn)胰腺β細(xì)胞的凋亡和胰島素分泌[13]。ZHANG等[14]的研究表明,lncRNA-TUG1在骨肉瘤組織中的表達(dá)上調(diào)與腫瘤體積增大、術(shù)后化療抵抗及高Enneking分期相關(guān),生存分析曲線結(jié)果也證實(shí)高表達(dá)的lncRNA-TUG1預(yù)示著較短的術(shù)后無瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間,上述結(jié)果表明lncRNA-TUG1對(duì)于腫瘤患者有一定的臨床治療效果監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷價(jià)值。

      通過對(duì)臨床組織標(biāo)本中l(wèi)ncRNA-TUG1的表達(dá)檢測(cè)證實(shí)lncRNA-TUG1高表達(dá)于肺腺癌組織當(dāng)中。以患者不同臨床病理特征為亞組的分析表明,lncRNA-TUG1高表達(dá)與肺癌患者腫瘤直徑增大及高TNM分期密切相關(guān)。與其在骨肉瘤、膀胱癌[15]及腦膠質(zhì)瘤[16]中的報(bào)道結(jié)果相一致。為進(jìn)一步探討lncRNA-TUG1在肺腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能,筆者應(yīng)用siRNA特異性敲低肺腺癌A549細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-TUG1表達(dá),通過MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀分析證實(shí)沉默lncRNA-TUG1對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡均有影響。

      P16又名MTS1,是細(xì)胞周期調(diào)控中的基本基因之一,能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4結(jié)合,負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂。超過50%的人類腫瘤細(xì)胞株中存在P16的純合子缺失或者突變。因而,有學(xué)者認(rèn)為P16是比P53更重要的一種新型抗癌基因[17]。研究表明[18],多梳蛋白抑制復(fù)合物 2(polycomb repressive complex 2,PRC2)能通過對(duì)P16啟動(dòng)子H3K27位點(diǎn)進(jìn)行甲基化修飾而抑制P16的表達(dá)。而肝細(xì)胞癌中的lncRNA-TUG1能夠通過與PRC2復(fù)合物中EZH2和SUZ12 2種組分的結(jié)合而將PRC2募集至抑癌因子KLF2的啟動(dòng)子區(qū)域,進(jìn)而促進(jìn)HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[19]。綜合上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果,筆者分析lncRNA-TUG1的促肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用可能是在表觀遺傳學(xué)層面通過啟動(dòng)子區(qū)域甲基化修飾作用而抑制P16的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。為證實(shí)該假說,筆者通過siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù),特異性敲低A549細(xì)胞內(nèi)lncRNA-TUG1的表達(dá),通過qRT-PCR檢測(cè)及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),沉默lncRNA-TUG1可提高A549細(xì)胞內(nèi)P16的表達(dá)水平,初步探明lncRNA-TUG1的作用機(jī)制。

      綜上所述,lncRNA-TUG1在肺腺癌組織中表達(dá)升高。lncRNA-TUG1可能通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制下調(diào)P16的表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此,lncRNA-TUG1在肺癌生物靶向治療中具有一定的研發(fā)價(jià)值。

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      (張蕾 編輯)

      Expression of long noncoding RNA TUG1 and its role in proliferation and apoptosis of lung adenocarcinoma*

      Ying-ying Han1,Peng Shen2
      (1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Departmentof Immunology,Tianjin First Central Hospital,Tianjin 300192,China)

      ObjectiveTo study the expression of long noncoding RNA TUG1(lncRNA-TUG1)in lung adenocarcinoma and its role in regulation of proliferation and apoptosis of A549 cells.MethodsThe lung adenocarcinoma tissues and matched paracancerous tissueswere collected from 40 patientswho had surgical resection between January 2012 and December 2014.The expression oflncRNA-TUG1was detected by qRT-PCR.lncRNA-TUG1specific siRNA was transfected into A549 cells.MTT assay and flow cytometer(FCM)were used to measure cell proliferation and apoptosis,respectively.The expression of P16 was detected by qRT-PCR and Western blot.ResultsThe expression oflncRNA-TUG1was significantly higher in the lung adenocarcinoma tissues than in the paracancerous tissues(t=3.873,P<0.001).High expression oflncRNA-TUG1was positively associated with large tumor diameter(t=4.273,P=0.033)and advanced TNM stage(t=4.273,P=0.045).Knockdown oflncRNA-TUG1significantly suppressed cell proliferation and induced apoptosis in the A549 cells(P<0.05).Moreover,the expressions of P16 mRNA andprotein were upregulated whenlncRNA-TUG1was silenced(P<0.001).ConclusionsLncRNA-TUG1is overexpressed in lung adenocarcinoma tissues and associated with cell growth.LncRNA-TUG1may promote the progression of lung adenocarcinoma by inhibiting P16 expression.

      lncRNA-TUG1;lung adenocarcinoma;proliferation;apoptosis;P16

      R 734.2

      A

      10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.009

      1005-8982(2017)07-0041-05

      2016-08-07

      天津市衛(wèi)生局中醫(yī)處課題基金項(xiàng)目(No:2015047)

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