由耀輝，陳利維，項(xiàng)能雙，熊林穎，鄭小剛

(1.內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 內(nèi)江641000；2.內(nèi)江師范學(xué)院 果蔬類廢棄物資源化四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 內(nèi)江641000)

馬來酸酐酰化改性對(duì)大豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響

由耀輝1,2，陳利維1，項(xiàng)能雙1，熊林穎1，鄭小剛1

(1.內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 內(nèi)江641000；2.內(nèi)江師范學(xué)院 果蔬類廢棄物資源化四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 內(nèi)江641000)

研究馬來酸酐?；男詫?duì)大豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：隨著馬來酸酐用量的增大，大豆分離蛋白的?；仍龃?，等電點(diǎn)降低；隨著?；鹊脑龃?，大豆分離蛋白構(gòu)象松散，色氨酸殘基的微環(huán)境趨向于暴露于水的狀態(tài)，親水性增強(qiáng)；經(jīng)馬來酸酐?；男院?，大豆分離蛋白的溶解性、發(fā)泡性、乳化性及乳化穩(wěn)定性均顯著提升，但泡沫穩(wěn)定性有所下降。研究表明，馬來酸酐?；男源蠖狗蛛x蛋白是一種非常有前景的功能性食品添加劑。

大豆分離蛋白；馬來酸酐；?；?；功能性質(zhì)

大豆分離蛋白具有資源量豐富、成本低廉、營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)備受人們青睞，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域。然而，大豆分離蛋白較差的水溶性、乳化性、發(fā)泡性等缺點(diǎn)限制了其規(guī)模應(yīng)用[1-3]。因此，如何改善大豆分離蛋白的功能性質(zhì)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)?；男允歉纳频鞍踪|(zhì)功能性質(zhì)的有效途徑，其中又以琥珀?；Ч^佳。Franzen等[4]比較了琥珀?；鸵阴；男詫?duì)大豆蛋白功能性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)琥珀?；纫阴；行У靥嵘蠖沟鞍椎乃苄?、乳化性、發(fā)泡性等，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣得到了熊正俊等[5]的證實(shí)。Gruener等[6]分別對(duì)油菜籽12S球蛋白進(jìn)行琥珀酰化和乙?；男?，結(jié)果表明，?；笥筒俗?2S球蛋白的發(fā)泡性和乳化性顯著提升。Achouri等[7]對(duì)水解大豆分離蛋白琥珀?；男?，琥珀酸酐的引入改變了水解大豆分離蛋白的親疏水及電荷性能，導(dǎo)致水解大豆分離蛋白相對(duì)分子質(zhì)量及構(gòu)象的變化，進(jìn)而改善了水解大豆分離蛋白水溶性、乳化性、發(fā)泡性等。然而，琥珀酸酐不溶于水，其?；磻?yīng)是非均相反應(yīng)，容易引起反應(yīng)不均一等問題。與之相比，馬來酸酐是另一種常見的?；噭浣Y(jié)構(gòu)與琥珀酸酐相似，但水溶性優(yōu)于琥珀酸酐，此外馬來酸酐還具備不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)，有利于進(jìn)一步改性修飾，有望用于改善大豆分離蛋白的功能性質(zhì)。從現(xiàn)有資料來看，已有采用馬來酸酐對(duì)菜籽蛋白及非洲槐豆蛋白改性的相關(guān)報(bào)道[8-9]，但鮮見關(guān)于馬來酸酐對(duì)大豆分離蛋白改性的報(bào)道。因此，本文嘗試以馬來酸酐對(duì)大豆分離蛋白?；男裕到y(tǒng)研究不同?；葘?duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)及性能的影響，以期為大豆分離蛋白改性應(yīng)用提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆分離蛋白(食品級(jí))，鄭州博研生物科技有限公司；茚三酮(分析純)，上海三愛思試劑有限公司；D-果糖(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；馬來酸酐(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TU-1950紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-4600熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；ZS90Zeta電位儀，英國馬爾文公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 馬來酸酐酰化大豆分離蛋白

馬來酸酐?；蠖狗蛛x蛋白的反應(yīng)機(jī)理如圖1所示。較佳的反應(yīng)條件如下：稱取5 g大豆分離蛋白分散于100 mL蒸餾水中，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至10，轉(zhuǎn)移至裝有溫度計(jì)、攪拌器、恒壓滴液漏斗的三口燒瓶中，于60℃下孵化30 min。馬來酸酐的添加量分別為大豆分離蛋白質(zhì)量的20%、40%、60%，添加方式采用分批滴加。先稱取一半質(zhì)量的馬來酸酐將其配制成水溶液(即刻使用以減少馬來酸酐水解作用，下同)，滴加至體系中，在60℃條件下攪拌反應(yīng)1.5 h后，將余下的馬來酸酐配制成水溶液滴加至體系中，再反應(yīng)1.5 h，反應(yīng)過程中控制體系pH為9～10，最終體系pH調(diào)至6.0。選擇截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500的透析袋對(duì)?；蠖狗蛛x蛋白透析24 h以去除雜質(zhì)，凍干后用于分析表征。

圖1 馬來酸酐?；蠖狗蛛x蛋白的反應(yīng)機(jī)理

1.2.2 ?；葴y(cè)定

稱取酰化前后的大豆分離蛋白粉末配制相應(yīng)的質(zhì)量濃度，采用茚三酮比色法測(cè)定伯氨基含量[10]，方法簡(jiǎn)要如下：以0.5 mol/L的磷酸緩沖液(pH 6.0)為溶劑，配制5 g/L的茚三酮溶液，棕色瓶?jī)?chǔ)存?zhèn)溆?。? mL已知濃度的蛋白質(zhì)溶液和1 mL茚三酮溶液混合，沸水浴反應(yīng)15 min，冷卻后加入體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇溶液定容到10 mL，以蒸餾水作空白，于570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，代入甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算伯氨基含量。?；鹊挠?jì)算公式如下：

?；?(未?；蠖狗蛛x蛋白伯氨基含量-?；蠖狗蛛x蛋白伯氨基含量)/未?；蠖狗蛛x蛋白伯氨基含量

1.2.3 等電點(diǎn)測(cè)定

稱取?；昂蟮拇蠖狗蛛x蛋白粉末配制1 g/L溶液，調(diào)節(jié)pH在2～8之間，測(cè)定Zeta電位，當(dāng)Zeta電位為0時(shí)的pH即為等電點(diǎn)(pI)。

1.2.4 熒光分析

以0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.2)作為溶劑，配制質(zhì)量濃度為1 g/L的?；昂蟠蠖狗蛛x蛋白溶液，在激發(fā)波長(zhǎng)295 nm、發(fā)射波長(zhǎng)范圍320～450 nm、狹縫寬度5 nm條件下，測(cè)定蛋白質(zhì)溶液熒光強(qiáng)度。

1.2.5 溶解性測(cè)定

以0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.2)作為溶劑，配制40 mL質(zhì)量濃度為10 g/L的?；昂蟠蠖狗蛛x蛋白溶液，充分?jǐn)嚢?0 min后，于4 000 r/min離心5 min，采用茚三酮比色法測(cè)定上清液?jiǎn)挝惑w積中的伯氨基含量[10]，與離心前原液?jiǎn)挝惑w積中伯氨基含量的比值即為溶解性。

1.2.6 發(fā)泡性及泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

以0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.2)作為溶劑，配制50 mL質(zhì)量濃度為10 g/L的酰化前后大豆分離蛋白溶液，將溶液置于攪拌機(jī)攪拌2 min后迅速轉(zhuǎn)移至250 mL量筒中，記錄0 min(初始)和30 min(終止)時(shí)的泡沫高度，初始高度(mL)作為發(fā)泡性指標(biāo)，終止高度與初始高度的百分比作為泡沫穩(wěn)定性指標(biāo)。

1.2.7 乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定

以0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.2)作為溶劑，配制質(zhì)量濃度為10 g/L的?；昂蟠蠖狗蛛x蛋白溶液，取25 mL大豆分離蛋白溶液和15 mL菜籽油，充分混合5 min后，置于帶刻度的離心管，4 000 r/min離心5 min，以離心后乳化層占總液體體積的百分比作為乳化性指標(biāo)。再次于4 000 r/min離心20 min，以殘留乳化層占原乳化層的百分比作為乳化穩(wěn)定性指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酰化度

?；磻?yīng)主要發(fā)生在大豆分離蛋白的伯氨基上，因此伯氨基數(shù)量的變化可以直接反映出酰化反應(yīng)是否有效地進(jìn)行。馬來酸酐用量對(duì)大豆分離蛋白酰化度的影響如圖2所示。經(jīng)測(cè)定未酰化大豆分離蛋白的伯氨基含量為31 mmol/100 g，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的基本一致。由圖2可知，隨著馬來酸酐用量的增大，大豆分離蛋白的?；仍龃蟆．?dāng)馬來酸酐用量為20%、40%和60%時(shí)，?；确謩e達(dá)到了0.66，0.80和0.92，這表明酰化反應(yīng)成功進(jìn)行。

圖2 馬來酸酐用量對(duì)大豆分離蛋白?；鹊挠绊?/p>

2.2 等電點(diǎn)

大豆分離蛋白是典型的兩性化合物，當(dāng)其溶液Zeta電位為0時(shí)的pH即為大豆分離蛋白的等電點(diǎn)(pI)。馬來酸酐?；瘜?duì)大豆分離蛋白等電點(diǎn)的影響如圖3所示。由圖3可知，未改性大豆分離蛋白的pI為4.8，隨著酰化度的增加，大豆分離蛋白的pI逐漸降低，當(dāng)?；葹?.66、0.80和0.92時(shí)，pI分別下降至4.2、4.0和3.9。這是因?yàn)轷；磻?yīng)將大豆分離蛋白陽離子的伯氨基轉(zhuǎn)化為陰離子的馬來酰基，導(dǎo)致了pI向低pH處偏移。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步佐證了?；磻?yīng)成功進(jìn)行。

圖3 ?；葘?duì)大豆分離蛋白等電點(diǎn)的影響

2.3 熒光分析

大豆分離蛋白的內(nèi)源熒光主要源于分子中色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸的苯環(huán)和共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，一般來說，采用280 nm激發(fā)，內(nèi)源熒光主要來自疏水性色氨酸殘基和親水性酪氨酸殘基，但由于存在酪氨酸殘基向色氨酸殘基的能量轉(zhuǎn)移，酪氨酸與色氨酸的熒光光譜不能被區(qū)分；采用295 nm激發(fā)，僅有疏水性色氨酸殘基被激發(fā)[12-14]。因此，本文選擇295 nm作為內(nèi)源熒光激發(fā)波長(zhǎng)，研究馬來酸酐?；瘜?duì)大豆分離蛋白色氨酸殘基熒光特性的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著酰化度的增加，大豆分離蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸減小。其原因可能是?；磻?yīng)使色氨酸殘基所處微環(huán)境發(fā)生變化，引入的馬來?；?雙鍵結(jié)構(gòu))對(duì)色氨酸殘基產(chǎn)生了熒光猝滅作用。

圖4 ?；葘?duì)大豆分離蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

根據(jù)Burstein等[15]提出的色氨酸殘基微環(huán)境的3個(gè)特點(diǎn)：當(dāng)最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)在330～332 nm時(shí)，色氨酸殘基微環(huán)境處于完全非極性區(qū)域；當(dāng)最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)在340～342 nm時(shí)，色氨酸殘基有限暴露于水中；當(dāng)最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)在350～353 nm時(shí)，色氨酸殘基完全暴露于水中。由圖4可知，未改性大豆分離蛋白的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)在342 nm，此時(shí)色氨酸殘基處于有限暴露于水的狀態(tài)，隨著?；鹊脑龃?，最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)紅移，這表明?；磻?yīng)破壞了大豆分離蛋白原有的有序結(jié)構(gòu)，使部分包埋在分子內(nèi)部的色氨酸殘基趨向于完全暴露于水的狀態(tài)。其原因可能是酰化過程處于堿性條件下，有助于大豆分離蛋白分子的溶脹，使分子結(jié)構(gòu)松散[12]，同時(shí)酰化反應(yīng)將大豆分離蛋白陽離子的伯氨基轉(zhuǎn)變?yōu)殛庪x子的馬來?；?，與原有的陰離子基團(tuán)形成靜電排斥，導(dǎo)致多肽鏈的伸展和水分子的滲入[4,8]。

2.4 溶解性

圖5為?；葘?duì)大豆分離蛋白溶解性的影響。由圖5可知，?；男阅茱@著提高大豆分離蛋白的溶解性，隨著酰化度的增大，大豆分離蛋白的溶解性增加，當(dāng)?；葹?.66、0.80和0.92時(shí)的溶解性分別是未改性大豆分離蛋白的1.35、1.54倍和1.82倍。溶解性的增加一方面是由于?；^程堿性溶脹作用及馬來酰基引入產(chǎn)生的靜電排斥導(dǎo)致大豆分離蛋白分子構(gòu)象變得更加松散，與水分子間的相互作用增強(qiáng)；另一方面源于引入的馬來?；哂休^強(qiáng)的親水性，同時(shí)產(chǎn)生的靜電排斥使大豆分離蛋白分子間不易聚集[16]。

圖5 ?；葘?duì)大豆分離蛋白溶解性的影響

2.5 發(fā)泡性及泡沫穩(wěn)定性

圖6為酰化度對(duì)大豆分離蛋白發(fā)泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響。由圖6可知，大豆分離蛋白的發(fā)泡性隨?；鹊脑龃蠖粩嗵岣?。未改性的大豆分離蛋白發(fā)泡性僅為32 mL，而?；葹?.66、0.80和0.92 時(shí)，其發(fā)泡性分別達(dá)到68、85 mL和91 mL，比未改性的大豆分離蛋白分別增加了113%、166%和184%。同時(shí)也可以發(fā)現(xiàn)，酰化后大豆分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性明顯下降。未改性大豆分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性為84.4%，而?；葹?.66、0.80和0.92時(shí)，其泡沫穩(wěn)定性分別下降為33.8%、30.6%和28.5%。這是因?yàn)轷；磻?yīng)后，大豆分離蛋白的肽鏈伸展，活性基團(tuán)充分暴露，有利于泡沫的形成，并且溶解性的提高使更多的蛋白質(zhì)分子參與到泡沫的形成；而馬來?；囊雽?dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥，阻礙蛋白質(zhì)分子在泡沫氣液表面的穩(wěn)定分布，從而降低了泡沫的穩(wěn)定性[9,17-18]。

圖6 酰化度對(duì)大豆分離蛋白發(fā)泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響

2.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性

大豆分離蛋白富含親疏水基團(tuán)，是一種天然的乳化劑。但是未改性的大豆分離蛋白水溶性差，且大部分疏水基團(tuán)包埋在分子內(nèi)部，故而乳化性能較差。圖7為?；葘?duì)大豆分離蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響。由圖7可知，隨著酰化度的增大，大豆分離蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性均顯著增強(qiáng)。這是由于酰化反應(yīng)改善了大豆分離蛋白的水溶性，分子構(gòu)象松散，肽鏈伸展，疏水基團(tuán)充分暴露，有利于將油脂包裹形成膠束，從而使乳化性提高；馬來?；囊胧剐纬傻娜榛z束與水之間具有良好的親和性，同時(shí)又增強(qiáng)了膠束間的靜電排斥作用，使膠束高度分散不易聚結(jié)，從而提高了乳化穩(wěn)定性[19-20]。

圖7 ?；葘?duì)大豆分離蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

3 結(jié) 論

如何改善大豆分離蛋白的功能性質(zhì)是當(dāng)前食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。以馬來酸酐為酰化劑對(duì)大豆分離蛋白?；男?，通過改變?；瘎┯昧亢铣刹煌；却蠖狗蛛x蛋白。研究發(fā)現(xiàn)：隨著酰化度的增大，大豆分離蛋白的溶解性、發(fā)泡性、乳化性及乳化穩(wěn)定性得到明顯改善，但泡沫穩(wěn)定性有所下降。機(jī)理研究表明：酰化反應(yīng)導(dǎo)致大豆分離蛋白分子構(gòu)象松散，疏水基團(tuán)暴露于水相；馬來?；囊胍环矫嬖黾恿擞H水基團(tuán)，另一方面也加強(qiáng)了大豆分離蛋白分子的靜電排斥作用，使之更穩(wěn)定地存在水中。

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歡迎訂閱2017年度《中國油脂》

Effect of maleylation on functional properties of soy protein isolate

YOU Yaohui1,2，CHEN Liwei1，XIANG Nengshuang1， XIONG Linying1，ZHENG Xiaogang1

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Neijiang Normal University，Neijiang 641000， Sichuan, China; 2. Key Laboratory of Fruit Waste Treatment and Resource Recycling of the Provincial Higher Learning Institutes， Neijiang Normal University，Neijiang 641000,Sichuan,China)

The effect of maleylation on functional properties of soy protein isolate was studied. The results showed that the acylation degree of soy protein isolate increased, and the isoelectric point of soy protein isolate decreased with dosage of maleic anhydride increasing. With acylation degree increasing, the conformation of soy protein isolate was loose, and the microenvironment of tryptophan residue tended to expose to water, and the hydrophilicity of soy protein isolate improved. While maleylation impaired the foam stability, the solubility, foam capacity, emulsifying capacity and emulsion stability of maleylated soy protein isolate were markedly ameliorated. The research showed good potential for maleylated soy protein isolate as functional food additive.

soy protein isolate; maleic anhydride; acylation degree; functional property

2016-08-31;

2017-01-04

國家自然科學(xué)基金(21506103)

由耀輝(1986)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)資源化利用(E-mail)allenyouyaohui@163.com。

鄭小剛，講師，博士(E-mail)zhengxg123456@163.com。

TS201.2;TQ937

A

1003-7969(2017)04-0099-05