俞燕芳 杜賢明 黃金枝 夏裕輝

(江西省蠶桑茶葉研究所 330202)

不同產(chǎn)地桑葉總酚、黃酮含量及抗氧化活性比較

俞燕芳 杜賢明 黃金枝 夏裕輝

(江西省蠶桑茶葉研究所 330202)

以7個(gè)地區(qū)的“農(nóng)桑14號(hào)”桑葉和4個(gè)地區(qū)的“強(qiáng)桑1號(hào)”桑葉為原料，采用比色法分別測(cè)定了桑葉總酚、總黃酮含量，以及桑葉提取液清除DPPH、清除ABTS能力和 FRAP等體外抗氧化活性。結(jié)果表明產(chǎn)地不同桑葉總酚、總黃酮的含量及其體外抗氧化活性有顯著差異，其中江西永新地區(qū)“農(nóng)桑14號(hào)”總酚和總黃酮的含量最高。

桑葉;產(chǎn)地;總酚;黃酮;抗氧化

桑葉營(yíng)養(yǎng)豐富、藥用價(jià)值高，是藥食兩用的植物資源。桑葉具有降血糖、降血壓、降血脂、抗衰老、抗腫瘤、消炎退腫等功效，其中多酚和黃酮，是桑葉發(fā)揮功效的主要活性成分[1～3]。我國(guó)地域遼闊，桑樹(shù)分布遍及全國(guó)各地，不同地域氣候土壤等環(huán)境條件差異大，勢(shì)必在很大程度上影響桑葉的物質(zhì)代謝及其植物化學(xué)物組成。有研究表明產(chǎn)地不同桑葉中的活性物質(zhì)含量也有差異[4～6]，但是大部分文獻(xiàn)中原料都是?？浦参锷orusalbaL.的干燥葉，而未標(biāo)明具體的桑樹(shù)品種。

選取不同產(chǎn)地相同品種桑葉為材料，對(duì)桑葉的總酚、黃酮含量及抗氧化活性進(jìn)行比較研究，為不同產(chǎn)地桑葉資源的利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

2015年10月20日采集四川、江西、湖北的“農(nóng)桑14號(hào)”和“強(qiáng)桑1號(hào)”桑葉，60℃烘干，粉碎，過(guò)60目篩備用。

1.1.2 試劑

沒(méi)食子酸、蘆丁、抗壞血酸、Trolox、DPPH、ABTS等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma，無(wú)水乙醇、過(guò)二硫酸鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(分析純)等試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)有限公司。

1.1.3 儀器

BIO-TEK ELX800 酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)、722型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、SK3310HP超聲清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 桑葉酚類(lèi)物質(zhì)的提取[7]

采用超聲輔助法提取桑葉多酚和黃酮。稱(chēng)取桑葉粉 0.5 g，置50 mL離心管中，加 70% 乙醇30 mL，超聲(300W)提取2次，每次30 min，合并提取液，以70%乙醇定容至100 mL，4℃保存。

1.2.2 總酚和總黃酮含量的測(cè)定[7]

桑葉總酚含量采用福林酚比色法測(cè)定，吸取 1.0 mL 桑葉提取液于 25 mL 容量瓶中，加入 2.0 mL Folin-Ciocalteu試劑，充分搖勻，5 min后加人 3 mL 10% Na2CO3溶液，混勻，加水定容，混勻后在30℃下避光放置反應(yīng)60min，以去離子水代替樣品溶液為空白，在760 nm處測(cè)定吸光值。桑葉樣品中的多酚含量以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)，結(jié)果表示為mg GAE/ g DW。

總黃酮含量采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測(cè)定：吸取 1.0 mL 桑葉提取液于 10 mL容量瓶中，加入 5% 亞硝酸鈉 0.4 mL。搖勻，放置 6 min，加入 10% 硝酸鋁 0.4 mL，搖勻，放置 6 min，加 4% NaOH 溶液 10.0 mL，加水定容，搖勻，放置 15 min，在 510 nm處測(cè)吸光值。桑葉樣品中的總黃酮含量以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)，結(jié)果表示為mg RE/ g DW。

1.2.3 桑葉提取液體外抗氧化能力的測(cè)定1.2.3.1 DPPH清除能力[8]

將100 μL的DPPH甲醇溶液(0.065 mmol/L)與20 μL的樣品溶液或空白溶液混溶在96孔板中，在室溫下反應(yīng)30 min，使用酶標(biāo)儀在517nm下測(cè)定其吸光值。以不同濃度的Trolox溶液(50、100、200、300、400和500 μmol/L)及其相應(yīng)的清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品溶液的DPPH清除能力以Trolox為參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為μmol TE/g DW。 清除DPPH自由基能力用如下公式計(jì)算：

其中：Ai為樣品溶液加DPPH試劑混合液的吸光度，Aj為樣品溶液加乙醇的吸光度，A0為DPPH溶液加樣品溶劑的吸光度。

1.2.3.2 ABTS清除能力[9]

將5 mL7.4 mmol/L ABTS儲(chǔ)備液與88 μL 2.6 mmol /L K2S2O8混勻，靜置12～16h，配制成ABTS工作液。ABTS工作液用80%的乙醇稀釋?zhuān)够旌先芤涸?34nm處吸光值為0.7±0.1，然后于96孔板中分別加入200 uL ABTS溶液和20 uL樣品溶液，震蕩混合均勻6 min后，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以不同濃度的Trolox溶液(25、50、100、200、400和500 μmol/L)及其相應(yīng)的清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品溶液的ABTS清除能力以 Trolox為參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為μmol TE/g DW。清除率計(jì)算公式如下：

其中：A0為ABTS溶液和樣品溶劑混合液的吸光度，Ai為ABTS溶液和樣品溶液混合液的吸光度，Aj為80%乙醇和樣品溶液的吸光度。

1.2.3.3 鐵離子還原能力(FRAP)[10]

在96孔酶標(biāo)板的每孔中，依次加入10 μL不同濃度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(200、300、400、600、800和1 000 μmol/L)和300 μL的ferric-TPTZ工作液，室溫反應(yīng)30 min后，于593 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度。桑葉提取液測(cè)定結(jié)果以抗壞血酸為參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為μmol AAE/g DW。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)“農(nóng)桑14號(hào)”的研究結(jié)果

從表1結(jié)果看出，不同產(chǎn)地 “農(nóng)桑14號(hào)”桑葉多酚、黃酮含量及體外抗氧化活性呈現(xiàn)顯著性差異，總酚、總黃酮含量在12.52～23.69 mg GAE/g DW和20.97～62.19 mg RE/g DW，清除DPPH、清除ABTS和 FRAP水平分別為 45.92～68.67 μmol TE/g DW、68.49～70.83 μmol TE/g DW 和 71.69～120.47 μmol AAE/g DW。其中江西永新的“農(nóng)桑14號(hào)”桑葉總酚、總黃酮含量最高，而四川南橋的總酚含量最低，四川中安的總黃酮含量最低。江西三個(gè)地區(qū)桑葉體外抗氧化能力無(wú)顯著差異，且普遍高于湖北武漢、四川南橋和四川中安。

表1 不同產(chǎn)地“農(nóng)桑14號(hào)”桑葉多酚、黃酮含量及抗氧化活性比較

2.2 不同地區(qū)“強(qiáng)桑1號(hào)” 的研究結(jié)果

從表2可知，不同產(chǎn)地 “強(qiáng)桑1號(hào)”桑葉多酚、黃酮含量也呈現(xiàn)顯著性差異。其中江西永新 “強(qiáng)桑1號(hào)”桑葉總酚、總黃酮含量最高，分別為20.27 mg GAE/g DW和 45.92 mg RE/g DW，江西修水桑葉的總酚、總黃酮含量最低，分別為15.59 mg GAE/g DW 和27.34 mg RE/g DW。四個(gè)地區(qū)中桑葉提取物DPPH清除能力最高的是江西永新(69.6μmol TE/g DW)，最低的是江西修水(66.88μmol TE/g DW)；清除ABTS能力水平無(wú)顯著性差異； FRAP水平最高的是江西永新(120.74 μmol AAE/g DW)，最低的是湖北武漢(100.76μmol AAE/g DW)。

表2 不同地區(qū)“強(qiáng)桑1號(hào)” 桑葉多酚、黃酮含量及抗氧化活性比較

3 討論

不同產(chǎn)地“農(nóng)桑14號(hào)”和“強(qiáng)桑1號(hào)”桑葉提取液總酚、總黃酮含量及其體外抗氧化能力呈顯著差異性，表明地域?qū)ιＨ~成分影響很大。由于試驗(yàn)所選擇的幾個(gè)地區(qū)氣候、土壤或者栽培措施管理等條件不是完全一致的，因此引起不同地區(qū)桑葉在營(yíng)養(yǎng)功能成分含量差異的原因還有待于進(jìn)一步研究。

江西三個(gè)產(chǎn)地“農(nóng)桑14號(hào)”和“強(qiáng)桑1號(hào)”桑葉的總酚、總黃酮含量由高到低呈相同趨勢(shì)：永新>樂(lè)安>修水，且在這三個(gè)產(chǎn)地均是“農(nóng)桑14號(hào)”含量高于“強(qiáng)桑1號(hào)”，說(shuō)明在選擇藥食用桑葉原料時(shí)，需考慮不同品種的差異。

[1] 王芳，勵(lì)建榮．桑葉的化學(xué)成分、生理功能及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．食品科學(xué)，2005，26(增刊)：111～116．

[2] 沈維治，廖森泰，鄒宇曉，等．不同類(lèi)型桑種質(zhì)資源的桑葉總多酚及單體酚類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定[J]．蠶業(yè)科學(xué)，2014，40(3)：493～497.

[3] 楊燕，王洪慶，陳若蕓．桑葉中的黃酮類(lèi)化合物[J]．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010(1)：77～81．

[4] 張如松，許靜怡，葉益萍，等．產(chǎn)地對(duì)桑葉中黃酮類(lèi)成分含量的影響[J]．中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2000，17(1)：11～13．

[5] 游元元，萬(wàn)德光，楊文宇，等．HPLC 法比較不同產(chǎn)地桑葉藥材品質(zhì)差異[J]．中國(guó)藥房，2010，21(35)：3314～3316．

[6] 馮穎，何俊，劉虹，等．不同產(chǎn)地桑葉中 6 種化學(xué)成分含量的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同時(shí)測(cè)定[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24 ( 3 )：572～574．

[7] 張亮亮，汪詠梅，徐曼，等．不同品種桑葉多酚和黃酮含量變化規(guī)律研究[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24(5)：1064～1066．

[8] Li H, Deng Z, Liu R, et al. Carotenoid compositions of coloured tomato cultivars and contribution to antioxidant activities and protection against H2O2-induced cell death in H9c2 [J]. Food Chemistry ，2013, 136：878～888.

[9] 韓光亮，李翠梅，Eduardo Cacace，等．改良的ABTS+法及其在優(yōu)化抗氧化活性物質(zhì)提取中的應(yīng)用[J]．衛(wèi)生研究，2004，33(5)：620～622．

[10] Khanizadeh S, Tsao R, Rekika D, et al. Polyphenol composition and total antioxidant capacity of selected apple genotypes for processing [J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2008, 21(5): 396～401.

江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：20151BBB60096)。