基于COⅠ基因的DNA條形碼在鱉科動物鑒定上的應(yīng)用

唐偉+朱治任+汪財生++張明興++錢國英

摘要：為探討DNA條形碼在中華鱉不同地理群體鑒定上的可行性，以中華鱉COⅠ基因全長序列為對象設(shè)計通用引物，對中華鱉6個地理群體及鱉科不同屬間進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同地理群體中華鱉的遺傳距離在0.020 3～0.041 7之間，群體內(nèi)平均遺傳距離在0.011 3～0.033 8之間，種間與種內(nèi)的遺傳距離沒有形成有效的條形碼間隙，在基于個體遺傳距離的NJ樹上，各群體間的個體并沒有形成有效的分支。在對鱉科不同屬進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)屬間及屬內(nèi)遺傳距離形成了明顯的差異間隙，在NJ樹上，不同鱉按照屬的特性分別進(jìn)行聚類，并具有較高的節(jié)點支持率，聚類分析可信度高。因此，COⅠ基因作為DNA條形碼，能夠有效地用于區(qū)分鱉科動物的不同屬，但不適用于中華鱉地理群體的分離鑒定。

關(guān)鍵詞：DNA條形碼；COⅠ基因；中華鱉；地理群體；鱉科

中圖分類號： S932.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0030-06

中華鱉（Pelodiscus sinensis）隸屬于動物界（Animalia）脊索動物門（Chordata）脊索動物亞門（Vertebrata）爬行綱（Repitlia）龜鱉目（Chelonia）曲頸龜亞目（Cryotodira）鱉總科（Trionychoidea）鱉科（Trionychidae）中華鱉屬（Pelodiscus），又稱甲魚、水魚、王八等，主要生活在淡水水域，為水陸兩棲型動物。中華鱉地理分布非常廣泛，在我國主要分布于長江及黃河流域等，國外主要分布于越南、日本和朝鮮等地[1]。一般認(rèn)為，中華鱉無明顯的亞種分化，但是存在很多地理變異，如黃河流域的黃河群體、浙江省寧波市姚江流域的姚江群體等。我國因地域遼闊，南北緯度差異大，各地域的生態(tài)條件不盡相同，所以，中華鱉在不同的地域所形成的基本形態(tài)也不盡相同，部分鱉經(jīng)過人工的定向選育甚至還形成了新的品系，如清溪烏鱉。為保證中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定、健康和持續(xù)發(fā)展，進(jìn)行良種選育以改善中華鱉苗種的質(zhì)量極為重要，同時，通過有效的方法對不同地域中華鱉的種質(zhì)進(jìn)行鑒定和評價具有非常長遠(yuǎn)的意義。目前，DNA條形碼作為一種成熟的mtDNA分子標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于物種的鑒定，在龜鱉類[2-6]、魚類[7-9]、鳥類[10-11]、昆蟲類[12]、及甲殼動物[13]等物種上均有相關(guān)報道，但在中華鱉不同地理群體的研究上，尚未見報道。

DNA條形碼是Hebert等于2003年利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I亞基（cytochrome C oxidase subunit I，CO I）構(gòu)建物種鑒別體系時首次提出的，利用一段短的基因序列作標(biāo)記對物種進(jìn)行快速鑒定，并以此建立生物物種的個體與DNA序列一一對應(yīng)的關(guān)系[14]。Hebert等比較分析了動物界9個門中13 320個同屬不同物種的COⅠ基因序列，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)的差異基本上小于1%，種間的差異一般大于11.3%。因此，Hebert提出，應(yīng)用COⅠ基因作為條形碼進(jìn)行物種鑒定時，種間遺傳距離應(yīng)為種內(nèi)遺傳距離的10倍及以上，種間遺傳距離以2%為界[15]。

本研究通過對中華鱉6個地理群體的111個個體線粒體COⅠ基因序列進(jìn)行比對分析，探討COⅠ基因在中華鱉各群體間及群體內(nèi)的序列變異，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)而檢驗COⅠ基因作DNA條形碼在中華鱉群體鑒定上的有效性，以期為中華鱉地理群體的鑒定提供依據(jù)。同時，下載了鱉科不同屬的其他鱉類的COⅠ基因序列，進(jìn)行綜合比對，探討DNA條形碼在鱉科屬間鑒定的可行性。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗采集了不同地理群體的中華鱉（其中，姚江群體編號為Y1～Y34，日本群體編號為R1～R21，太湖群體編號為T1～T17，黃河群體編號為HH1～HH6，清溪烏鱉編號為 W1～W4和W6～W19，清溪花鱉編號為h1～h15），并結(jié)合從NCBI上下載的相關(guān)鱉科動物COⅠ基因序列一起進(jìn)行分析（表1）。其中，印度鱉屬的恒河鱉（Nilssonia gangeticus）、印度孔雀鱉（Nilssonia hurum）及黑鱉（Nilssonia nigricans）的拉丁名與藍(lán)色動物學(xué)網(wǎng)（http：//www.blueanimalbio.com/reptile/gui/bie.htm）的命名有異，此處不做更正，均以下載序列的命名為準(zhǔn)。

1.2總DNA的提取

中華鱉解剖前先置于0.05%的高錳酸鉀溶液中浸泡 10 min 殺菌后，頸部放血處死，按常規(guī)解剖步驟，迅速取前腿肌肉，用液氮研磨成粉末。稱取25～30 mg研磨后的粉末，裝于1.5 mL滅菌離心管中，按樣品信息編號，液氮速凍后于 -80 ℃ 保存。采用OMEGA公司的Tissue DNA Kit試劑盒提取中華鱉總DNA（詳見說明書）。用1.5%的瓊脂糖電泳檢測DNA提取的質(zhì)量，并用分光光度計檢測其吸光度及濃度后，將符合要求的DNA溶液稀釋成約30 ng/μL，待用。

1.3PCR擴(kuò)增和測序

采用Primer Premier 6.0結(jié)合Oligo 7軟件，以中華鱉線粒體COⅠ基因全長序列為對象，設(shè)計通用引物RC122-F（5′-CCAGTGACTTTAACCCGTTGAT-3′）和RC122-R（5′-GAGAAAGAAACATGAAGGTCATGTG-3′），均由華大基因合成。

PCR反應(yīng)采用50 μL體系，包括25 μL康為PCR Mix，2 μL RC122-F（10 μmol/L），2 μL RC122-R（10 μmol/L），17 μL ddH2O，4 μL DNA模板。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，33個循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴(kuò)增完成后，將PCR產(chǎn)物全部吸入到1×TBE緩沖液配制的1.5%瓊脂糖凝膠點樣孔，用100 V恒壓電泳檢測，確認(rèn)為所需目的條帶，進(jìn)行割膠及目的條帶回收，低溫保存送至華大基因進(jìn)行雙向測序。測序所用引物與PCR引物相同。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Lasergene v5.0軟件[16]中的SeqMan工具及CExpress軟件，根據(jù)測序結(jié)果中的峰值，對測得的序列進(jìn)行人工拼接。利用Clustal X 1.85軟件[17]對測序所得序列進(jìn)行排列比對，并輔助以人工校正；用DNAsp 5.1軟件計算各群體的單倍型數(shù)、多態(tài)位點數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）、平均核苷酸差異數(shù)（K）等參數(shù)；運用DAMBE軟件[18]，以TN93模型校正距離為橫坐標(biāo)，轉(zhuǎn)換和顛換數(shù)為縱坐標(biāo)，做散點分布圖，判斷其散點變化趨勢；將所有序列輸入到MEGA 6.0軟件中進(jìn)行比對[19]，計算各群體的堿基含量比、堿基轉(zhuǎn)換及堿基顛換等參數(shù)，采用Kimura 2-parameter（K2p）模型計算其遺傳距離，并采用Neighbour-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1中華鱉COⅠ基因的序列測定

采用自主設(shè)計的通用引物RC122-F、RC122-R，分別對不同地理群體中華鱉的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增后測序，所得序列確定為COⅠ基因片段后，采用Clustal X及MEGA軟件進(jìn)行排比核對，截取同源長度的序列為1 534 bp的片段（圖1）。由圖1可知，擴(kuò)增目的條帶清晰、整齊，無其他非特異性雜帶存在，并且測序時采用雙向測序程序，保證了測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2基于CO1基因?qū)χ腥A鱉不同地理群體的遺傳多樣性分析

將截取排比后同源長度相同的序列輸入到MEGA 6.0軟件中，以中華鱉COⅠ基因全長序列作參考，比對后發(fā)現(xiàn)，中華鱉COⅠ基因分為2個變異區(qū)間，靠近5′端400～700 bp區(qū)域為主要的變異區(qū)間，大部分變異位點都集中于此，此區(qū)域內(nèi)的保守位點相對較少；靠近3′端850～1 250 bp區(qū)域范圍內(nèi)，依稀存在部分變異位點，同時也包含大量保守位點區(qū)域。從 1 534 bp 的序列中，共檢測到928個保守位點（conserved sites，C）、337個簡約信息位點（parsimony-in formative sites，Pi）、606個變異位點（variable sites，V）、269個自裔位點（singleton site，S），分別占整個序列的60.50%、39.50%、21.97%、17.54%。統(tǒng)計堿基的組成發(fā)現(xiàn)，各堿基平均含量為A=30.10%、T=30.27%、C=23.41%、G=16.22%，其中 A+T的含量（60.37%）明顯高于C+G的含量（39.63%），表現(xiàn)出明顯的線粒體基因A+T堿基偏好性。各群體間的堿基平均含量差異不大，其中堿基A、T的含量相當(dāng)，G的含量最少。A+T的含量在3個密碼子位點中的含量均高于G+C的含量，其中以密碼子第3位點的含量最高，達(dá)70.2%。

運用DNAsp 5.1軟件分析不同群體中華鱉遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果（表2）顯示，112個不同地理群體的中華鱉個體中，共檢出了133個單倍型，其中姚江群體的最多，達(dá)41個，黃河群體僅8個。視6個地理群體中華鱉為一個總?cè)后w，則總?cè)后w的單倍型多樣性指數(shù)（Hd）為0.973，堿基多樣性指數(shù)（Pi）為0.017 1，平均核苷酸差異數(shù)（K）為26.314。姚江群體的單倍型多樣性顯示出最高水平，太湖群體和日本群體在單倍型多樣性（Hd）、堿基多樣性指數(shù)（Pi）及平均核苷酸差異數(shù)（K）上總體顯示出較為突出的遺傳多樣性，而黃河群體和清溪烏鱉則顯示出較為貧乏的核苷酸多樣性。

采用MEGA 6.0軟件，基于Kimura-2-parameter（K2p）模型計算中華鱉不同地理群體間的遺傳距離，結(jié)果（表3）顯示，中華鱉不同地理群體間的遺傳距離在0.020 3～0.041 7之間，其中遺傳距離最大的為日本群體與清溪烏鱉，最小的為日本群體與黃河群體。姚江群體與其他群體間的遺傳距離均大于0.02。種內(nèi)遺傳距離在0.011 3～0.033 8之間，從大到小的順序依次為清溪花鱉>清溪烏鱉>太湖群體>日本群體>姚江群體>黃河群體。

根據(jù)表3中中華鱉不同地理群體間的遺傳距離，用MEGA 6.0中的NJ程序，構(gòu)建基于群體間遺傳距離的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），顯示黃河群體與日本群體最先聚為一支，然后再與姚江群體聚類，接著依次分別與清溪花鱉、太湖群體及清溪烏鱉聚類。姚江群體與黃河群體、日本群體有相對較近的親緣關(guān)系，各群體中，黃河群體與日本群體間的親緣關(guān)系最近。

根據(jù)不同個體COⅠ基因序列信息，采用MEGA 6.0軟件基于Kimura-2-parameter（K2p）模型構(gòu)建分子進(jìn)化樹（圖3），由進(jìn)化樹可知，中華鱉各群體的個體散亂地聚于不同的分支，聚類不具有種的特性。

2.3基于COⅠ基因?qū)M科動物不同屬間的遺傳多樣性分析

本研究從NCBI上下載了與中華鱉同源性相近的其他鱉科動物的COⅠ基因序列（表1），用ClustalX1.85軟件進(jìn)行

人工排比后，保留共有序列，最后所得片段長度為650 bp。應(yīng)用MEGA 6.0軟件進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，整個鱉科動物COⅠ基因堿基A、T、C、G的平均含量分別為29.3%、293%、25.2%、16.3%，A+T含量（58.6%）高于C+G的含量（41.5%），所有鱉科動物中，核苷酸G的含量均較低，低于18%。統(tǒng)計各位點堿基使用情況，A-T堿基在第2位密碼子的使用量最高，為73.1%，而C-G堿基在第3位密碼子的使用量最高，為50.4%，甚至超過了A+T的含量，表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚。

用MEGA 6.0軟件，基于Kimura-2-parameter模型計算不同鱉科動物間的遺傳距離，發(fā)現(xiàn)鱉科動物各種間的遺傳距離在0.013 1～0.268 8之間，其中以黃河鱉與小鱉間的遺傳距離最小，為0.013 1，而努比亞緣板鱉（Cyclanorbis elegans）與清溪烏鱉間的遺傳距離最大，達(dá)0.268 8。中華鱉不同群體相互間的遺傳距離在0.013 1～0.048 3之間，均低于0.050。與中華鱉屬遺傳距離相對較近的為我國南方特有品種——砂鱉（Trionyx axenaria），其與中華鱉各地理群體的遺傳距離在0.048 7～0.066 9之間。

利用MEGA 6.0軟件中的Tamura 3-parameter mode（T92）+Gamma Distributed（G）的組合模型進(jìn)行計算，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），以1 000次自展分支檢驗（Bootstraps test）可靠性。由圖4可知，不同鱉科動物按照其屬的特性相互聚類，其中，中華鱉屬（Pelodiscus）的7個地理群體（姚江群體、清溪烏鱉、清溪花鱉、太湖群體、日本群體、黃河群體及小鱉）相互聚為一個大支，節(jié)點支持率為97%；鱉屬（Trionyx）的砂鱉（Trionyx axenaria）獨自占有一支，并與中華鱉屬的分支聚在一起，節(jié)點支持率為99%；山瑞鱉屬（Palea）的山瑞鱉（Palea steindachneri）獨自占有一支；印度鱉屬（Aspideretes）印度孔雀鱉（Nilssonia hurum）及黑鱉（Nilssonia nigricans）相互聚類，節(jié)點支持率為96%，并與緬甸孔雀鱉屬 （Nilssonia）的緬甸孔雀鱉（Nilssonia formosa）匯聚，然后再與恒河鱉（Nilssonia gangeticus）聚類，節(jié)點支持率為95%，提示印度鱉屬可能與緬甸孔雀鱉屬同系。亞洲鱉屬（Amyda）的中南半島大鱉（Amyda cartilaginea）獨為一支；斑鱉屬（Rafetus）的幼河斑鱉（Rafetus euphraticus）和斑鱉（斯氏鱉）（Rafetus swinhoei）相互聚為一支，節(jié)點支持率為92%；緣板鱉屬（Lissemys）的印度箱鱉（Lissemys punctata）和緬甸箱鱉（Lissemys scutata）相互聚為一支，節(jié)點支持率為95%；盤鱉屬（Cyclanorbis）的努比亞盤鱉（Cyclanorbis elegans）和塞內(nèi)加爾盤鱉（Cyclanorbis senegalensis）相互聚類，并與圓鱉屬（Cycloderma）的贊比亞圓鱉（Cycloderma frenatum）聚為一個大支。緣板鱉屬、盤鱉屬及圓鱉屬3個屬共同聚為一個大支，節(jié)點支持率為99%，提示這3個屬間親緣關(guān)系較近。

3討論

3.1基于COⅠ基因?qū)Σ煌乩砣后w中華鱉的遺傳差異性分析

6個中華鱉地理群體中COⅠ基因序列的A、T、C、G堿基平均含量為30.10%、30.27%、23.41%、16.22%，其中以堿基G的含量最低，這是線粒體DNA的一個顯著特點[20]，A+T的含量（60.37%）明顯高于C+G的含量（39.63%），表現(xiàn)出明顯的線粒體堿基偏好性。密碼子各位點的A+T含量均高于G+C的含量，其中以第3位點的含量最高，達(dá)70.2%。Desalle等指出，DNA進(jìn)化過程中，近緣物種間DNA編碼區(qū)序列因較多發(fā)生同義突變，序列中轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率一般較顛換高[21]。本研究中的轉(zhuǎn)換/顛換比為1.4，表明COⅠ基因序列的突變沒有達(dá)到飽和，可以進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建分析。

視6個地理群體中華鱉為一個總?cè)后w，則總?cè)后w的單倍型多樣性指數(shù)為0.973，堿基多樣性指數(shù)為0.017 1。Grant等認(rèn)為，當(dāng)單倍型多樣性>0.5，核苷酸多樣性>0.005時，則該物種具有相對較高的遺傳多樣性[22]。由此可以看出，本研究中的6個不同地理群體的中華鱉均具有較高的遺傳多樣性，這為我國中華鱉種質(zhì)資源的保護(hù)奠定了基礎(chǔ)。

在種群遺傳距離分析上，杜啟艷等認(rèn)為，物種在科、屬、種3個水平上遺傳距離的差別若小于2%，則可確定為同一物種[23]。本研究中，6個不同地理群體中華鱉間的遺傳距離在2.03%～4.17%之間，種間平均遺傳距離為2.58%，各群體間的遺傳距離均大于2%，其中黃河群體與日本群體間的遺傳距離（2.03%）最小。Anderson指出，物種在長期地理分隔以后，再發(fā)生雜交行為，可能會產(chǎn)生漸滲雜交的現(xiàn)象，從而降低物種的種間遺傳距離[24]。日本群體中華鱉是早年從我國引種過去，經(jīng)過長期的性狀改良，再從日本引入我國的一個地理群體，作為一個改良后的新品系，備受養(yǎng)殖戶及消費者的喜愛，其養(yǎng)殖面積及區(qū)域也日益擴(kuò)增，在養(yǎng)殖過程中難免存在與其他中華鱉群體雜交的情況，產(chǎn)生漸滲雜交的現(xiàn)象，從而造成其與黃河群體或其他群體間的遺傳距離相對較小。因此，按照杜啟艷等的標(biāo)準(zhǔn)[23]，本研究中的6個地理群體中華鱉均達(dá)到了種的分化水平。

3.2COⅠ基因作為DNA條形碼在鱉類鑒定中的有效性分析

COⅠ基因是線粒體基因組中常用的作為DNA條形碼的標(biāo)記基因[25]，其5′端區(qū)域的一段序列既包含有大量的保守區(qū)以進(jìn)行通用引物的擴(kuò)增，又包含有效的變異區(qū)可進(jìn)行不同物種的區(qū)分，并且在大多數(shù)動物中，COⅠ基因都存在顯著的基因變異，因此，動物界中的物種鑒定通常選擇COⅠ基因來作為DNA條形碼[7，14，26]。Hebert等提出，利用線粒體COⅠ基因作DNA條形碼對不同物種進(jìn)行鑒定時，最關(guān)鍵的是種群的種間遺傳距離必須大于種內(nèi)遺傳距離，并且差距在10倍及以上，其中種間的遺傳距離以2%為界[15]。

本研究對中華鱉不同地理群體進(jìn)行遺傳差異性分析時發(fā)現(xiàn)，種間遺傳距離在0.020 3～0.041 7之間，均已達(dá)到2%以上種的分化水平，種內(nèi)平均遺傳距離在0.011 3～0.033 8之間，種間與種內(nèi)的遺傳距離并沒有形成10倍的有效差異，相反，個別群體中，種內(nèi)的平均遺傳距離甚至大于種間，如清溪花鱉及日本群體。在基于個體COⅠ基因差異的NJ進(jìn)化樹上，相同群體的不同個體并沒有按照種的特性進(jìn)行聚類，而是零散地聚于各個分支，個別個體甚至單獨成支。這可能與近緣物種的雜交有關(guān)。傳統(tǒng)分類法通過斑點、體色等外部特征將中華鱉的不同地理群體區(qū)分開來。而中華鱉因相似的生活環(huán)境，缺乏有效的隔離機制，特別是近些年來，大量的引種、倒種及種間雜交，以期培育出優(yōu)良性狀（生長性能及表型性能）的品種，致使中華鱉不同群體間雜交紊亂，使得群體間基因的滲透概率較高。mtDNA呈母系遺傳，雜交子代的mtDNA幾乎全都來自母本，而控制物種表型性狀的基因可能來源于核DNA。因此，基于COⅠ基因作DNA條形碼對近緣雜交地理群體的鑒定可能存在一定程度的缺陷，需要結(jié)合核DNA的相關(guān)鑒定才能得到比較真實可靠的結(jié)果。根據(jù)種間與種內(nèi)遺傳距離差異度及進(jìn)化樹分析，本研究認(rèn)為，COⅠ 基因不能將中華鱉的不同地理群體鑒定開來。

在對鱉科不同屬間的遺傳差異性分析時發(fā)現(xiàn)，屬間遺傳距離在0.063 9～0.244 6之間，屬內(nèi)平均遺傳距離在 0.038 5～0.136 7之間[27]，屬間與屬內(nèi)之間形成了明顯的差異空隙，非常適用于DNA條形碼的鑒別。在鱉科不同屬的NJ進(jìn)化樹上，不同鱉按照屬的特性分別進(jìn)行聚類，并具有較高的節(jié)點支持率，聚類分析可信度高。因此，本研究認(rèn)為，COⅠ基因作為DNA條形碼，能夠有效地用于鱉科不同屬間的鑒定。

參考文獻(xiàn)：

[1]周婷. 中國龜鱉動物的分布[J]. 四川動物，2006，25（2）：272-276.

[2]Lee J C I，Tsai L C，Liao S P，et al. Species identification using the cytochrome b gene of commercial turtle shells[J]. Forensic Science International：Genetics，2009，3（2）：67-73.

[3]吳平，徐珞珊. 中藥材龜甲的分子鑒定研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報，1998，33（4）：304-309.

[4]Le M，Raxworthy C J，McCord W P，et al. A molecular phylogeny of tortoises （Testudines：Testudinidae） based on mitochondrial and nuclear genes[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2006，40（2）：517-531.

[5]辛翠娜，王瑩，彭建軍，等. DNA條形碼在龜鱉類物種鑒定中的應(yīng)用[J]. 林業(yè)實用技術(shù)，2010（4）：12-14.

[6]杜鶴，崔麗娜，張輝，等. 鱉甲及其混偽品的DNA分子鑒定[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，13（2）：429-434.

[7]Ward R D，Zemlak T S，Innes B H，et al. DNA barcoding Australias fish species[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B：Biological Sciences，2005，360（1462）：1847-1857.

[8]Hubert N，Hanner R，Holm E，et al. Identifying Canadian freshwater fishes through DNA barcodes[J]. PLoS One，2008，3（6）：e2490.

[9]柳淑芳，陳亮亮，戴芳群，等. 基于線粒體COⅠ基因的DNA條形碼在石首魚科（Sciaenidae）魚類系統(tǒng)分類中的應(yīng)用[J]. 海洋與湖沼，2010，41（2）：223-232.

[10]Kerr K C R，Stoeckle M Y，Dove C J，et al. Comprehensive DNA barcode coverage of North American birds[J]. Molecular Ecology Notes，2007，7（4）：535-543.

[11]Hebert P D N，Stoeckle M Y，Zemlak T S，et al. Identification of birds through DNA barcodes[J]. PLoS Biol，2004，2（10）：e312.

[12]Hajibabaei M，Janzen D H，Burns J M，et al. DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（4）：968-971.

[13]Cywinska A，Hunter F F，Hebert P D N. Identifying Canadian mosquito species through DNA barcodes[J]. Medical and Veterinary Entomology，2006，20（4）：413-424.

[14]Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society of London B：Biological Sciences，2003，270（1512）：313-321.

[15]Hebert P D N，Ratnasingham S，de Waard J R. Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J]. Proceedings of the Royal Society of London B：Biological Sciences，2003，270（Suppl 1）：S96-S99.

[16]Burland T G. DNASTARs Lasergene sequence analysis software[J]. Methods in Molecular Biology，2000，132：71-91.

[17]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al. The CLUSTAL_X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（24）：4876-4882.

[18]Xia X，Xie Z. DAMBE：software package for data analysis in molecular biology and evolution[J]. Journal of Heredity，2001，92（4）：371-373.

[19]Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al. MEGA 6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2013，30（12）：2725-2729.

[20]Meyer A. Evolution of mitochondrial DNA in fishes[J]. Biochemistry and Molecular Biology of Fishes，1993，2：1-38.

[21]Desalle R T，F(xiàn)reedman T，Prager E M，et al. Tempo and mode of sequence evolution in mitochondrial DNA of Hawaiian Drosophila[J]. Journal of Molecular Evolution，1987，26（1/2）：157-164.

[22]Grant W，Bowen B W. Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes：insights from sardines and anchovies and lessons for conservation[J]. Journal of Heredity，1998，89（5）：415-426.

[23]杜啟艷，常重杰. DNA條形碼在鑒定物種中的應(yīng)用[J]. 生物學(xué)教學(xué)，2010，35（12）：60-61.

[24]Anderson E. Introgressive hybridization[M]. New York：John Wiley and Sons，1949.

[25]Simon P，Dupuis R，Costentin J. Thigmotaxis as an index of anxiety in mice. Influence of dopaminergic transmissions[J]. Behavioural Brain Research，1994，61（1）：59-64.

[26]Vences M，Thomas M，Bonett R M，et al. Deciphering amphibian diversity through DNA barcoding：chances and challenges[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B：Biological Sciences，2005，360（1462）：1859-1868.

[27]唐偉. 姚江水系中華鱉種質(zhì)特征研究[D]. 上海：上海海洋大學(xué)，2015.高金秋，周建朝，王孝純，等. 部分高抗低磷脅迫基因型甜菜AFLP指紋圖譜的構(gòu)建[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（6）：36-38.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.007