周煥 張新 何泳 彭清平 王曉慧

·實驗研究·

調(diào)節(jié)性T細胞在小鼠抗腎小球基底膜型腎小球腎炎模型中的免疫調(diào)節(jié)機制研究

周煥 張新 何泳 彭清平 王曉慧

目的 探討在小鼠抗腎小球基底膜型腎小球腎炎(抗GBM腎炎)模型的腎炎進展中調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell, Treg)免疫調(diào)節(jié)機制，為早期干預(yù)免疫反應(yīng)，減輕病理損害提供理論依據(jù)。方法 將C57BL/6小鼠隨機分為2組即正常對照組和抗GBM腎炎模型組。在建模不同時間點即建模的第7、14、21、28天將小鼠處死后收集并檢測血清中的肌酐 (serum creatinine, SCr)、尿素氮 (blood urea nitrogen, BUN) 及尿蛋白含量，隨機尿中尿蛋白/肌酐比值(albumin-to-creatinine ratio, ACR)變化；留取腎臟標(biāo)本檢測病理改變。流式細胞術(shù)(fluorescence-activated cell sorting,FACS)檢測脾臟中Treg細胞表達情況；免疫印跡法 (Western blot) 檢測腎臟組織中DNA結(jié)合抑制因子3(Id3)和Foxp3等蛋白表達情況。結(jié)果 與正常對照組小鼠相比，抗GBM腎炎模型組小鼠腎臟病理示GBM不規(guī)則彌漫增厚甚至部分斷裂、系膜細胞和基質(zhì)增生、新月體形成；免疫熒光示鼠IgG和兔IgG在基底膜呈線性沉積；SCr、BUN、尿蛋白和ACR增加明顯(P<0.05);抗GBM腎炎模型組中細胞和蛋白水平檢測到的相關(guān)因子均呈規(guī)律性表達：與正常對照組相比，隨著病情進展抗GBM腎炎模型組中Th17細胞的表達比例呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而與此同時Treg細胞則從第7天開始即出現(xiàn)升高的趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；抗GBM腎炎模型組小鼠腎臟組織中Foxp3及Id3的蛋白表達均較正常對照組明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；Id3的蛋白表達與Treg細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子水平相關(guān)。結(jié)論 在抗GBM腎炎的免疫進程中，Treg發(fā)揮重要作用，這種作用可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Id3有關(guān)。

調(diào)節(jié)性T細胞；抗腎小球基底膜型腎小球腎炎；DNA結(jié)合抑制因子3

抗腎小球基底膜型腎小球腎炎(抗GBM腎炎)是急進性腎小球腎炎中病情進展迅速、治療預(yù)后最差的一種自身免疫性疾病[1-2]，因此對于抗GBM腎炎早期的免疫細胞研究，將有助于全面了解其發(fā)病機制，為早期干預(yù)其免疫反應(yīng)，阻斷病理進程提供依據(jù)。T細胞的免疫應(yīng)答是抗GBM腎炎進展過程中最重要的一個環(huán)節(jié)[3]。未分化的CD4+T 細胞能夠分化發(fā)育為不同的細胞亞型如 Th1 細胞、Th2 細胞、Th17 細胞和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell, Treg)等，這些細胞均以不同的方式參與介導(dǎo)多種疾病免疫應(yīng)答反應(yīng)[4-5]。其中CD4+CD25+FOXP3+的Treg細胞作為一個特殊的T細胞亞群，在疾病免疫應(yīng)答中起了免疫抑制作用[6]。那么Treg細胞在抗GBM腎炎的病程進展中究竟是如何變化的及在其免疫應(yīng)答中起了怎樣的作用至今仍未有效的定論。DNA結(jié)合抑制因子3(Id3)是一種相對分子質(zhì)量僅為13 000的核蛋白，受到T細胞抗原受體(T cell receptor，TCR)或B細胞抗原受體(B cell receptor，BCR)介導(dǎo)信號的刺激后能在多種細胞的核內(nèi)廣泛表達，從而調(diào)節(jié)多個細胞的生長和分化。有研究證實在自身免疫性疾病哮喘模型中Id3可在轉(zhuǎn)錄水平對Treg細胞的分化進行調(diào)控[7-9]。本研究著重探討小鼠抗GBM腎炎模型的腎炎進展中Treg細胞免疫調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)機制。

材料與方法

一、材料與試劑

SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，周齡5～8周，體質(zhì)量15～20 g，由北京華阜康公司提供，飼養(yǎng)于同濟醫(yī)學(xué)院動物實驗中心；兔抗小鼠 GBM 多克隆血清(南京金斯瑞公司制備)；兔IgG、弗氏佐劑、FITC-羊抗兔-IgG、FITC-羊抗鼠-IgG(美國Sigma公司)；小鼠血尿肌酐、尿素氮檢測試劑盒(美國Biovision公司)；流式抗體、紅細胞裂解液、固定劑和破膜劑、Foxp3專用固定劑和破膜劑(美國 eBioscience)；BCA蛋白檢測試劑盒、總蛋白及核蛋白提取試劑盒(中國碧云天公司)；LaminA/C核內(nèi)參抗體(美國Abcam公司)；Anti-Id3抗體(美國BD公司)；Anti-Foxp3抗體(美國 Abgent 公司)。

二、儀器與設(shè)備

組織脫水機、石蠟包埋機、石蠟切片機(德國Leica公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(德國 Biometra 公司)等。

三、方法

1.提取小鼠GBM抗原及制備兔抗小鼠GBM多克隆血清 取SPF級C57BL/6小鼠40只，頸椎脫臼法處死，取其雙側(cè)腎臟，剝除腎包膜，剪取腎臟皮質(zhì)，于1×酶抑制劑(50×酶抑制劑加1×PBS配制)中研磨。利用篩網(wǎng)法取腎小球并超聲粉碎，離心，取沉淀，檢測抗原純度。純度達標(biāo)的抗原即為所需的小鼠GBM抗原。然后將上述抗原注射2只新愛爾蘭大白兔體內(nèi)，使其致敏，2周后重復(fù)注射，共注射3～5次直至酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 檢測血清效價較高后，處死家兔最終獲得80 ml的血清，其效價分別為1∶64 000和1∶128 000。該過程由南京金斯瑞公司完成。

2.小鼠抗GBM新月體腎炎模型的建立及檢測 SPF級C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機分為2組即正常對照組和抗GBM腎炎模型組(模型組),2組均給予兔IgG和完全弗氏佐劑等體積腹腔注射，于第10天開始模型組每2～3 d腹腔注射兔抗小鼠GBM血清；而正常對照組則給予兔正常血清。分別于建模第7、14、21、28天處死小鼠收集血、尿和新鮮的脾臟、腎臟待檢，觀察病理損害的進展情況。檢測正常對照組及模型組不同時間點尿蛋白含量；利用肌酐、尿素氮檢測試劑盒，按照說明書分別檢測血中各生化指標(biāo)的濃度；小鼠腎臟皮質(zhì)，1/4用包埋劑包埋，切片后，經(jīng)直接免疫熒光法染色，檢測熒光情況。1/4腎皮質(zhì)用固定劑固定、脫水、包埋、切片后行過 雪夫染色(Periodic Acid-Schiff stain, PAS)染色,觀察腎臟的病理改變。

3.免疫印跡法(Western blot) 取少許小鼠腎臟組織，研磨后按照組織核蛋白提取試劑盒說明書提取腎臟組織核蛋白，并按照BCA法蛋白檢測試劑盒說明書測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品加入1/4體積的5×蛋白上樣緩沖液于EP管中，震蕩混勻后瞬時離心，置于100 ℃的水浴箱中變性失活10 min。經(jīng)過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和轉(zhuǎn)膜后。將LaminA/C核內(nèi)參抗體；Anti-Id3抗體；Anti-Foxp3抗體，按照說明書稀釋到一定比例后與膜蛋白孵育，4 ℃過夜。用封閉液按1∶2 000濃度配制二抗，37 ℃搖床上孵育1 h后進行化學(xué)發(fā)光法顯影，Image J 軟件對其條帶進行定量分析。以LaminA/C作為核內(nèi)參抗體，檢測Id3和Foxp3的蛋白表達情況。

4.流式細胞術(shù)(fluorescence-activated cell sorting,FACS)檢測 取小鼠新鮮脾臟組織，分離單個細胞懸液，淋巴細胞分離液獲取所需脾臟單細胞懸液。根據(jù)Treg細胞流式抗體說明書進行標(biāo)記，1 h內(nèi)進行流式檢測。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

所有的實驗重復(fù)至少3次。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組實驗數(shù)據(jù)之間比較采用方差(ANOVA)分析，2組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、成功建立小鼠抗GBM腎炎的模型 腎臟光鏡病理結(jié)果顯示，相對于正常對照組，模型組從病變的第7天開始就出現(xiàn)腎臟病理的改變，如基底膜的增厚斷裂、系膜細胞和基質(zhì)的增生及腎小管的擴張，甚至新月體的形成。選取病變第28天這一時間點，腎臟受損程度逐漸加重；免疫熒光顯示，病變從免疫后第7天開始模型組小鼠的腎小球內(nèi)可見鼠IgG沿GBM呈線性沉積，且隨著病變的進展熒光強度逐漸增強(圖1A)；與此同時，亦可見兔IgG沿GBM的線性沉積，且隨著病情的進展熒光強度逐漸減弱，系膜區(qū)也可見熒光的沉積(圖1B)。各組小鼠的生化指標(biāo)檢測結(jié)果也顯示該模型的建立成功：各階段的血尿素氮(圖2A)、血肌酐(圖2B)、尿蛋白(圖2C)以及尿蛋白/肌酐比值(圖2D)均較正常對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注:A:各組小鼠腎組織病理改變結(jié)果(PAS染色,×400);B:抗GBM腎炎模型組小鼠腎組織IgG沉積情況(免疫熒光,×400)圖1 抗GBM腎炎模型組和正常對照組腎臟病理及熒光表達

二、Th17和Treg細胞在模型組中的表達水平

與正常對照組相比，隨著病情進展抗GBM腎炎模型組中Th17細胞的表達比例呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而與此同時，Treg細胞則從第7天開始即出現(xiàn)升高的趨勢，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)(圖3A、圖3B)；但檢測外周血中白細胞介素17、轉(zhuǎn)化生長因子β和白細胞介素10的變化趨勢卻與上述不同(圖中未列出)。

注:于建模第7、14、21和28天分別獲取正常對照組和模型組血、尿樣本,通過ELISA方法檢測血尿素氮(A)、血肌酐(B)、隨機尿蛋白(C)及尿蛋白/肌酐比值(D)的表達情況;與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 抗GBM腎炎模型組和正常對照組血、尿生化指標(biāo)的表達

三、在模型組腎臟組織中Id3、Foxp3的表達

提取正常對照組和模型組小鼠腎臟組織中的核蛋白，通過Western blot的方法檢測Treg細胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及Id3的蛋白表達情況，結(jié)果見圖4A、圖4B。結(jié)果顯示模型組小鼠腎臟組織中Foxp3及Id3的蛋白表達均較正常對照組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

討 論

炎癥免疫反應(yīng)是抗GBM腎小球腎炎病理進展和轉(zhuǎn)歸的重要環(huán)節(jié)，本研究從免疫細胞Treg細胞入手進行探討，我們發(fā)現(xiàn)：①在抗GBM 腎炎早期，隨著病情的進展，Treg細胞的表達量上調(diào)，且表現(xiàn)為時間依賴性的特點；②在抗GBM腎炎模型中Treg細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3水平變化與Id3相關(guān)。

關(guān)于抗GBM腎炎的認識主要來自實驗動物模型。抗GBM腎炎的動物模型的制備有多種方法，比較成熟的有以下三種：實驗性自體免疫腎小球腎炎模型、腎毒血清腎炎模型及實驗性自體免疫脈管炎模型[10]。在研究中根據(jù)不同的研究目的使用不同的實驗?zāi)Ｐ?。本實驗主要研究在新月體腎炎發(fā)病機制中T細胞的免疫作用，故采用腎毒血清腎炎模型[11]。通過采用經(jīng)典的建模方法[12],無論是從免疫熒光、光鏡病理還是尿蛋白、生化指標(biāo)來看，我們都已成功建立了抗GBM腎炎的動物模型：與正常對照組小鼠相比，抗GBM腎炎模型組小鼠腎臟光鏡病理顯示GBM不規(guī)則彌漫增厚甚至部分斷裂、系膜細胞和基質(zhì)增生、新月體形成；免疫熒光顯示鼠IgG和兔IgG在基底膜呈線性沉積；血肌酐、血尿素氮、隨機尿蛋白及隨機尿中尿蛋白/肌酐比值增加明顯。成功的動物模型為我們后續(xù)探索新月體腎炎發(fā)病機制奠定堅實的基礎(chǔ)。

作為一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的T淋巴細胞亞群，Treg細胞在維持自身免疫耐受方面發(fā)揮著重要作用[13]。在前言中，我們已經(jīng)了解到Treg細胞與自身免疫性疾病之間的關(guān)系密切。通過輸注Treg細胞可以達到減輕病理損害、改善臨床癥狀的目的[14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)相對于正常對照組而言，抗GBM腎炎模型組的Treg細胞比例增加，至觀察的28天為止Treg細胞比例一直處于增加的趨勢(圖4)。說明在抗GBM腎炎病情進展過程中，抑制炎癥反應(yīng)Treg細胞發(fā)揮重要作用。

注:A:Th17細胞;B:Treg細胞;與正常對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 抗GBM腎炎模型組和正常對照組的不同時期Th17細胞和Treg細胞變化水平

注:Ctrl:正常對照組;7d、14d、21d:抗GBM腎炎模型組不同階段;各組腎臟組織中Id3(圖A)和Foxp3(圖B)的核蛋白表達情況;與正常對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 腎臟組織中Id3、Foxp3的表達

既然在自身免疫性疾病病情進展過程中Treg細胞如此重要，那么對其發(fā)育和分化調(diào)節(jié)的研究則首當(dāng)其沖成為人們研究的重點。目前比較公認的機制有以下幾方面：參與淋巴細胞發(fā)育的雙陰性選擇和β選擇過程中轉(zhuǎn)錄因子Id3/E2A；GATA3和RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX)即遵循Notch信號傳導(dǎo)途徑；其他轉(zhuǎn)錄因子如B細胞淋巴瘤/白血病11b(BCL11b)；成髓細胞瘤病毒癌基因同源基因(Myb)等[15]。本研究中我們注意到Id3的調(diào)節(jié)機制。

Id3蛋白屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)蛋白家族。因其缺乏基礎(chǔ)DNA結(jié)合域，只能形成非DNA結(jié)合型二聚體復(fù)合物，與另一種HLH蛋白家族E2a發(fā)生競爭抑制，從而影響靶基因的表達[6]。有研究證實在自身免疫性疾病哮喘模型中Id3能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Th17細胞和Treg細胞的分化，且在Id3敲除鼠中，Th17細胞蛋白比例明顯升高而Treg細胞顯著降低，同時哮喘模型病理損害加重[16-20]。所以在研究自身免疫性疾病新月體腎炎的發(fā)病機制時，我們主要研究Id3的調(diào)節(jié)機制。我們發(fā)現(xiàn)在腎臟組織中，抗GBM腎炎病變的早期Id3的表達量就有增加(圖4)。由此可以肯定Th17/Treg細胞失衡及其轉(zhuǎn)錄因子變化與Id3表達水平的改變相關(guān)。當(dāng)然，在體內(nèi)環(huán)境下，不能排除其他因素影響淋巴細胞水平的變化，若能將相關(guān)淋巴細胞分離出來在體外單獨研究，將會更有利于對其進行研究，這也是我們下步研究的重點。

我們的研究首次發(fā)現(xiàn)了Id3在T細胞介導(dǎo)的新月體型抗GBM 腎炎發(fā)病過程中的重要作用，為預(yù)防和治療新月體腎炎提供新的靶點。當(dāng)然，本研究對于Id3是調(diào)控Treg細胞表達仍有許多未研究的方面，如具體的機制和信號通路以及Id3對于其他淋巴細胞的影響等，將在以后的研究中進一步探討和完善。

[1] Zou J, Hannier S. Healthy individuals have Goodpasture autoantigen-reactive T cells [J]. Am Soc Nephrol, 2008, 19(2): 396-404.

[2] 梁亮， 王紅. Th17細胞與自身免疫性疾病[J]. 免疫學(xué)雜志， 2010， 26(3)： 264-270.

[3] 計子瑤， 李碩， 馮輝. T淋巴細胞在新月體腎小球腎炎發(fā)病中作用的研究進展[J]. 2016，32(10)： 1419-1422.

[4] Caza T， Landas S． Functional and phenotypic plasticity of CD4+T cell subsets [J]． Biomed Res Int，2015， 2015:521957．

[5] Vieira Braga FA， Hertoghs KM， van Lier RA， et al． Molecular characterization of HCMV-specific immune responses: Parallels between CD8+T cells， CD4+T cells， and NK cells[J]．Eur J Immunol， 2015， 45(9): 2433-2445.

[6] Belkaid Y, Piccirillo CA, Mendez S, et al. CD4+CD25+regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity [J]. Nature, 2002, 420(6915): 502-507.

[7] Nutt SL, Kee BL. The transcriptional regulation of B cell lineage commitment. Immunity, 2007, 26(6): 715-725.

[8] Massari ME, Murre C. Helix-loop-helix proteins: regulators of transcription in eucaryotic organisms[J]. Mol Cell Biol, 2000, 20(2): 429-440.

[9] Murre C. Helix-loop-helix proteins and lymphocyte development[J]. Nat Immunol, 2005, 6(11): 1079-1086.

[10]韋鳳美, 金玉. 急進性腎小球腎炎動物模型研究進展[J]. 中國實驗動物學(xué)報, 2010, 18(5): 441-445.

[11]Tipping PG, Holdsworth SR. T cells in crescentic glomerulonephritis[J]. J Am Soc Nephrol, 2006, 17(5): 1253-1263.

[12]Odobasic D, Kitching AR, Semple TJ, et al. Inducible co-stimulatory molecule ligand is protective during the induction and effector phases of crescentic glomerulonephritis[J]. J Am Soc Nephrol, 2006, 17(4): 1044-1053.

[13]Hu D, Miller SC. Evidence of a lineage shift between natural (NK) killer cells and T lymphocytes in the spleen and blood of neonatally thymectomized, young adult C3H mice[J]. Cur Pedia Res, 2014, 18(1)： 43-47.

[14]Wolf D, Hochegger K, Wolf AM, et al. CD4+CD25+regulatory T cells inhibit experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis in mice[J]. J Am Soc Nephrol, 2005，16(5): 1360-1370.

[15]Naito T, Tanaka H, Naoe Y, et al. Transcriptional control of T-cell development[J]. Int Immunol, 2011, 23(11): 661-668.

[16]Maruyama T, Li J, Vaque JP, et al. Control of the differentiation of regulatory T cells and T(H)17 cells by the DNA-binding inhibitor Id3[J]. Nat Immunol, 2011, 12(1): 86-95.

[17]Jones ME, Zhuang Y. Acquisition of a functional T cell receptor during T lymphocyte development is enforced by HEB and E2A transcription factors[J]. Immunity, 2007, 27(6): 860-870.

[18]Rivera RR, Johns CP, Quan J, et al． Thymocyte selection is regulated by the helix-loop-helix inhibitor protein, Id3[J]. Immunity, 2000, 12(1): 17-26.

[19]Zhou L, Lopes JE, Chong MM, et al. TGF-β-induced Foxp3 inhibits TH17 cell differentiation by antagonizing Rorγt function[J]. Nature, 2008, 453(7192): 236-240.

[20]Bain G, Cravatt CB, Loomans C, et al. Regulation of the helix-loop-helix proteins, E2A and Id3, by the Ras-ERK MAPK cascade[J]. Nat Immunol, 2001, 2(2): 165-171.

Immunoregulation mechanism of Treg cells in anti-GBM glomerulonephritis model of mice

ZHOUHuan,ZHANGXin,HEYong,PENGQing-ping,WANGXiao-hui.

DivisionofNephrology,DepartmentofInternalMedicine,WuhanFifthHospital,Wuhan430050,China

WANGXiao-hui,E-mail: 390638252@qq.com

Objective To explore the immunoregulation mechanism of Treg cells in anti-GBM glomerulonephritis model of mice, and provide theoretical basis for early intervention of immune response and alleviating pathologic damage.Methods C57BL/6 mice were randomly divided into nephritic group and normal control group. The anti-GBM glomerulonephritis model was established in the mice of the nephritic group. At different time points of 7th, 14th, 21st and 28th day, mice were sacrificed. The serum was collected, and creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), urine albumin and albumin-to-creatinine ratio (ACR) were tested. Renal pathological changes were observed. Treg cells in the spleen were examined by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Western blotting was used to detect the expression of Id3 and Foxp3 protein in the renal tissues.Results The irregular thickening and breakage of GBM, glomerular mesangial cells, matrix proliferation, and crescent formation were observed in nephritic group. Immunofluorescence showed rabbit IgG and mouse IgG linearly deposited along the GBM in nephritic group. SCr, BUN, urine albumin and ACR increased significantly in nephritic group as compared with normal control group (P<0.05). The anti-GBM glomerulonephritis model group of cells, and protein expression levels of relevant indicators show the law：FACS showed Th17 cells declined after increased, while Tregs increased significantly from 7th day (P<0.05 orP<0.01); The protein expression levels of Id3 and the transcription factors Foxp3 in anti-GBM glomerulonephritis group were increased significantly(P<0.05 orP<0.01). The expression levels of Id3 protein were positive correlated with the Tregs′ transcription factors.Conclusions In the immune process of anti-GBM nephritis, Treg plays an important role, which may be related to the transcriptional regulator Id3.

Treg cells; Anti-GBM glomerulonephritis; Id3

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.03.009

武漢市衛(wèi)計委科研項目(WX16C09)

430050 武漢市第五醫(yī)院腎內(nèi)科(周煥，張新，何泳，彭清平，王曉慧)；作者周煥與張新并列為第一作者

王曉慧，E-mail：390638252@qq.com

2017-02-03

2017-03-07)