吳明昊 劉劍 胡桂才 高宇 張寶紅 周瑾 趙亞娟

·實(shí)驗研究·

利拉魯肽對胰島素抵抗大鼠腎臟8-羥基脫氧鳥苷、丙二醛及超氧化物歧化酶表達(dá)的影響

吳明昊 劉劍 胡桂才 高宇 張寶紅 周瑾 趙亞娟

目的 研究利拉魯肽對胰島素抵抗(insulin resistance，IR)大鼠腎臟8-羥基脫氧鳥苷(8- hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量的影響。方法 54只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成對照組(普通飲食)16只、模型組(高脂飲食)38只。喂養(yǎng)8周末各組取5只行高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗評價各組IR狀態(tài)，判定IR造模成功后再將高脂喂養(yǎng)組隨機(jī)分為IR組、干預(yù)組1(利拉魯肽100 μg·kg-1·d-1)、干預(yù)組2(利拉魯肽200 μg·kg-1·d-1)。藥物干預(yù)2周后，測定各組大鼠血肌酐(serum creatinine,SCr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、24 h尿蛋白量以及腎組織中8-OHdG、MDA和SOD含量，并應(yīng)用電鏡觀察各組腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果 IR組的SCr、BUN、24 h尿蛋白定量、8-OHdG、MDA分別為(26.31±0.60) μmol/L、(10.43±0.50) mmol/L、(7.13±0.60) mg、(32.81±2.96) ng/L和(7.7±1.0) nmol/mg，與對照組[(15.55±0.42) μmol/L、(5.34±1.33) mmol/L、(2.18±0.29) mg、(13.30±1.72) ng/L、(3.3±0.4) nmol/mg]比較均明顯升高(均P<0.05)，而SOD表達(dá)下降[(175.0±7.7) U/mg比(237.1±12.4) U/mg,P<0.05)]；與IR組比較，干預(yù)組1的24 h尿蛋白定量[(6.46±0.44) mg]、8-OHdG[(28.54±2.71) ng/L]、MDA[(6.6±1.0) nmol/mg]表達(dá)均減少(均P<0.05)；與IR組比較，干預(yù)組2的SCr[(24.07±1.05) μmol/L]、BUN[(9.53±0.53) mmol/L]、24 h尿蛋白定量[(4.60±0.40) mg]、MDA[(5.7±0.5) nmol/mg]、8-OHdG[(20.06±1.65) ng/L]表達(dá)均降低(均P<0.05)，而SOD[(216.1±10.6) U/mg]表達(dá)升高(P<0.05)；與干預(yù)組1比較，干預(yù)組2的SCr、BUN、24 h尿蛋白量、MDA、8-OHdG均降低(均P<0.05)，而SOD表達(dá)升高(P<0.05)。結(jié)論 利拉魯肽可呈濃度依賴性降低腎臟氧化應(yīng)激水平，可能是阻斷IR所致腎損傷的原因之一。

利拉魯肽；胰島素抵抗；8-羥基脫氧鳥苷；丙二醛；超氧化物歧化酶

胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是發(fā)生腎損害、導(dǎo)致腎衰竭的獨(dú)立危險因素，其中機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡在IR所致腎損傷的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用[1-2]。利拉魯肽是臨床應(yīng)用的新型降糖藥物，有研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可改善IR大鼠所致的腎損傷，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究應(yīng)用利拉魯肽干預(yù)IR大鼠，觀察藥物對大鼠腎臟8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量的影響以及電鏡下組織學(xué)改變，旨在探討利拉魯肽對腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。

材料與方法

一、動物模型的建立與分組

雄性Wistar大鼠54只(4周，230～260 g，購自維通利華)。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為2組：對照組16只，高脂組38只。54只大鼠喂養(yǎng)8周后各組取5只行清醒狀態(tài)高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗技術(shù)，準(zhǔn)確評價實(shí)驗大鼠IR狀態(tài)。IR大鼠造模成功后，再隨機(jī)分為3組，分別為IR組、干預(yù)組1、干預(yù)組2，各11只。第9周開始干預(yù)組繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)，同時給予不同濃度利拉魯肽皮下注射(干預(yù)組1：利拉魯肽100 μg·kg-1·d-1、干預(yù)組2：利拉魯肽200 μg·kg-1·d-1)。對照組和IR組以等量生理鹽水皮下注射。藥物干預(yù)2周后，各組取5只大鼠行高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗，其余6只大鼠腹主動脈取血測定血清各項指標(biāo)，剪取腎臟組織-80 ℃冰箱凍存，留取部分腎臟標(biāo)本行透射電鏡。

二、相關(guān)檢測指標(biāo)測定

1.高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗 喂養(yǎng)第8周末和藥物干預(yù)2周后，各取5只大鼠，10%水合氯醛麻醉，右側(cè)頸動、靜脈插管，注射肝素封管。3 d后，禁食、水1 d，在大鼠清醒狀態(tài)下，以4 mU·kg-1·min-1速度向頸靜脈輸注胰島素和30%葡萄糖(5 mg·kg-1·min-1起始)。每15 min從頸動脈抽血測血糖，根據(jù)血糖情況調(diào)整葡萄糖輸注率，使血糖維持在4.5～5.5 mmol/L，連續(xù)3次即為穩(wěn)態(tài)，計算穩(wěn)態(tài)下的平均葡萄糖輸注率(glucose infusion rate,GIR)。

2. 相關(guān)指標(biāo)的測定 ①于第10周末，用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液(禁食，不禁水)，記總尿液量，3 000 r/min，離心10 min，取上清。用免疫比濁法測24 h尿蛋白定量。②相關(guān)血液指標(biāo)的測定：大鼠腹主動脈取血，室溫放置2 h，離心機(jī)1 200 r/min，離心20 min，取上清分裝至EP管中，-80 ℃冰箱保存。應(yīng)用全自動生化分析儀測定大鼠血肌酐(serum creatinine,SCr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)。

3.剪取腎臟組織測定腎組織中的8-OHdG、MDA和SOD含量 取腎組織0.5 g加0.9%氯化鈉溶液4.5 ml(重量/體積比1∶9)制成勻漿液，4 000 r/min，離心約10 min，取上清液。按試劑盒說明書：雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測大鼠腎組織8-OHdG的水平、水溶性四氮唑(water soluble tetrazolium,WST-1)法測定SOD活性、硫代巴比妥酸(thibabituric acid,TBA)法測定MDA含量(試劑盒均購于南京建成生物工程研究所)。

4.腎臟組織電鏡觀察 取腎組織，眼科剪將腎組織剪成體積約為1 mm×1 mm×1 mm的組織方塊，于3.1%戊二醛浸泡，再于1%鋨酸固定，經(jīng)脫水、滲透、包埋、切片等處理，透射電鏡下觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、高胰島素-葡萄糖鉗夾實(shí)驗結(jié)果

對照組GIR為(30.21±2.51) mg·kg-1·min-1，高脂組GIR為(20.41±3.64) mg·kg-1·min-1，與對照組比較，高脂組GIR明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示高脂誘導(dǎo)IR大鼠模型造模成功。利拉魯肽干預(yù)2周后各組GIR：與對照組比較，高脂組GIR降低更明顯(P<0.05)；經(jīng)利拉魯肽治療后，干預(yù)組1、干預(yù)組2的GIR與高脂組比較，GIR均升高，干預(yù)組2升高更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(表1)

表1 4組大鼠各項指標(biāo)檢測比較±s)

注：與對照組相比：aP<0.05；與IR組相比：bP<0.05；與干預(yù)組1相比：cP<0.05

二、相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果

與對照組比較，IR組的SCr、BUN、24 h尿蛋白定量、8-OHdG、MDA明顯升高(P<0.05)，而SOD表達(dá)下降(P<0.05)；與IR組相比，干預(yù)組1僅24 h尿蛋白定量、MDA、8-OHdG減少(P<0.05)；而干預(yù)組2的SCr、BUN、24 h尿蛋白定量、MDA、8-OHdG均降低(P<0.05)，SOD表達(dá)升高(P<0.05)；與干預(yù)組1相比，干預(yù)組2的SCr、BUN、24 h尿蛋白定量、MDA、8-OHdG均降低(P<0.05)，SOD表達(dá)升高(P<0.05)。(表1)

三、腎臟電鏡結(jié)果

與對照組相比，IR組腎小球基底膜明顯增厚、厚薄不均、部分足突腫脹、融合或消失。與IR組相比，利拉魯肽干預(yù)組腎小球基底膜增厚均有所減輕，足突腫脹緩解，且干預(yù)組2改善腎組織病理變化更為明顯。(圖1)

討 論

既往研究表明，機(jī)體IR狀態(tài)是導(dǎo)致腎損傷的始動因素之一，IR可通過胰島素樣生長因子-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、內(nèi)皮素-1、高胰島素血癥等途徑導(dǎo)致腎損害[3-4]，其中氧化應(yīng)激因素日益受到關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)IR大鼠出現(xiàn)24 h尿蛋白定量增加、腎功能的改變，腎小球基底膜明顯增厚、足突腫脹、融合或消失，證實(shí)IR可致腎臟損害。

氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)是指體內(nèi)活性氧簇和活性氮簇的產(chǎn)生增多，引起細(xì)胞生物膜脂質(zhì)過氧化，胞內(nèi)蛋白激酶變性以及DNA損傷[5]。氧化應(yīng)激可減少使血管內(nèi)皮舒張因子(NO)的生成以及生物利用度，引發(fā)腎小球血管內(nèi)皮功能受損，加速腎小球硬化，此外還可促進(jìn)糖化產(chǎn)物的生成，造成腎小球結(jié)節(jié)性病變[6]。體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高可促進(jìn)腎臟炎癥狀態(tài)加重，促使機(jī)體IR狀態(tài)進(jìn)一步加重。羥自由基和單線態(tài)氧可以攻擊DNA鏈上的鳥嘌呤堿基使C-8位發(fā)生羥化而生成加合物8-OHdG，8-OHdG是DNA氧化損傷的特異產(chǎn)物。研究認(rèn)為，組織或體液中的8-OHdG是一種反映DNA氧化損傷的敏感指標(biāo)[7]。MDA為脂質(zhì)過氧化物裂解產(chǎn)物，可引起蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)，亦可與核酸等發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞代謝廣泛性障礙。組織中MDA的含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，進(jìn)而間接反映細(xì)胞損傷程度[8]；SOD為抗氧化系統(tǒng)中重要一員，可清除氧自由基阻斷其對機(jī)體造成的損害[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IR組大鼠腎組織8-OHdG、MDA含量升高、SOD活性降低，提示IR所致腎損傷與腎臟氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

圖1 電鏡觀察各組大鼠足細(xì)胞足突情況(×30000,箭頭所指為足細(xì)胞足突) A:對照組;B:IR組;C:干預(yù)組1;D干預(yù)組2

GLP-1受體激動劑利拉魯肽是一種新型降糖藥物，藥理濃度作用體內(nèi)GLP-1受體，呈葡萄糖依賴模式刺激胰島素的分泌，因其獨(dú)特降糖機(jī)制和廣泛的胰腺外效應(yīng)備受關(guān)注[10]。近幾年基礎(chǔ)及臨床研究證實(shí)，利拉魯肽對腎臟的保護(hù)作用，如增加尿鈉排出、減少尿蛋白等，但具體機(jī)制尚不明確[11-12]。本實(shí)驗通過高脂飲食誘導(dǎo)IR大鼠模型，并給予利拉魯肽藥物進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠GIR下降、IR減輕，腎臟組織學(xué)改變得到改善，腎功能有所恢復(fù)，尿蛋白明顯減少，證實(shí)利拉魯肽對IR大鼠腎臟具有保護(hù)作用。而利拉魯肽干預(yù)組大鼠腎組織SOD表達(dá)升高，8-OHdG、MDA表達(dá)減少，證實(shí)了利拉魯肽明顯降低腎臟氧化應(yīng)激水平且效應(yīng)呈一定濃度依賴性。

Shiraki等[13]在體外細(xì)胞實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽通過促進(jìn)SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶的表達(dá)從而減輕腫瘤壞死因子α導(dǎo)致的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。Hendrato等[14]利用利拉魯肽干預(yù)1型糖尿病大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平明顯減輕，尿蛋白水平也明顯減少，因此推測利拉魯肽可能具有改善糖尿病大鼠氧化應(yīng)激的直接效應(yīng)，且該效應(yīng)不依賴于血糖濃度。Shimoda等[15]在糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)利拉魯肽通過抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激水平而減少β細(xì)胞的凋亡。此研究和上述研究結(jié)果一致，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，IR可導(dǎo)致腎臟損傷且氧化應(yīng)激參與此過程。利拉魯肽具有抗氧化作用，可能通過降低腎臟部位氧化應(yīng)激水平，即降低腎組織8-OHdG、MDA表達(dá)水平，上調(diào)腎組織SOD表達(dá)水平，從而起到對腎臟的保護(hù)作用。然而利拉魯肽又是通過何種路徑調(diào)控腎臟氧化應(yīng)激水平，相關(guān)機(jī)制仍需我們進(jìn)一步研究。

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Effects of liraglutide on 8-OHdG, MDA and SOD of kidney in insulin resistance rats

WUMing-hao*,LIUJian,HUGui-cai,GAOYu,ZHANGBao-hong,ZHOUJin,ZHAOYa-juan.

*ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China

HUGui-cai,E-mail:cdguicaihu@126.com

Objective To observe the effects of liraglutide on 8-OHdG, MDA and SOD of kidney in insulin resistance (IR) rats.Methods According to random number table method, 54 Wistar male rats were divided into normal control group (normal diet) and IR model group (high fat diet). IR was evaluated by hyperinsulinemic euglycemic clamp technique after 8 weeks. After IR rat models were successfully established, the animals in high fat diet group were randomly divided into IR group, intervention group 1 (liraglutide: 100 μg·kg-1·day-1), and intervention group 2 (liraglutide: 200 μg·kg-1·day-1). After treatment for 2 weeks with liraglutide, SCr, BUN, 24-h urine protein, and 8-OHdG, MDA and SOD in the renal tissues were determined. The morphology and structure in the renal tissues were observed by electron microscope.Results As compared with control group, the levels of SCr, BUN, 24-h urine protein, 8-OHdG, and MDA were significantly increased in IR group (8-OHdG: 32.81±2.96 ng/L vs. 13.30±1.72 ng/L; MDA: 7.7±1.0 nmol/mg vs. 3.3±0.4 nmol/mg, allP<0.05) and the expression of SOD was decreased (175.0±7.7 U/mg vs. 237.1±12.4 U/mg,P<0.05). As compared with the IR group, 24-h urine protein, 8-OHdG and MDA were decreased in intervention group 1 (8-OHdG: 28.54±2.71 ng/L vs. 32.81±2.96 ng/L; MDA: 6.6±1.0 nmol/mg vs. 7.7±1.0 nmol/mg,P<0.05); SCr, BUN, 24-h urine protein, MDA and 8-OHdG were decreased (8-OHdG: 20.06±1.65 ng/L vs. 32.81±2.96 ng/L; MDA: 5.7±0.5 nmol/mg vs 7.7±1.0 nmol/mg, allP<0.05) and SOD was increased in intervention group 2 (216.1±10.6 U/mg vs. 175.0±7.7 U/mg,P<0.05). As compared with the intervention group 1, SCr, BUN, 24-h urine protein, MDA and 8-OHdG were decreased (allP<0.05) and SOD was increased in intervention group 2 (P<0.05).Conclusions Liraglutide could decrease the kidney oxidative stress in a concentration-dependent manner, which may be one of the reasons for the renal injury induced by IR.

Liraglutide; Insulin resistance; 8-hydroxydeoxyguanosine; Malonaldehyde; Superoxide dismutase

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.03.010

067000 河北承德，承德醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院(吳明昊，劉劍)；067000 河北承德，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科(胡桂才，張寶紅，周瑾，趙亞娟)，內(nèi)分泌科(高宇)

胡桂才，E-mail:cdguicaihu@126.com

2016-04-10

2016-11-07)