蔣紅　賈艾敏　劉琬椿等

摘要：目的 觀察三氧化二砷（ATO）對人關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLSs）生長的影響，探討ATO對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（KA）的潛在治療作用。方法 原代培養(yǎng)人關(guān)節(jié)FLSs，傳至第3-5代時(shí)，以不同濃度的ATO處理細(xì)胞，通過ELISA對上清液中的TNF-a、IL-1水平進(jìn)行檢測，采用MTT法檢測不同處理組細(xì)胞生長情況。結(jié)果 不同濃度的ATO處理后，ELISA結(jié)果顯示試驗(yàn)各組TNF-d、IL-1檢出水平均顯著低于對照組（P<0.05），MTT結(jié)果顯示隨藥物濃度增加和處理時(shí)間延長，抑制作用增強(qiáng)。結(jié)論 ATO可抑制人FLSs生長，并可發(fā)揮抑制滑膜細(xì)胞分泌的功效，進(jìn)而對RA炎性、免疫過程產(chǎn)生干預(yù)作用，提示可作為治療RA的潛在藥物。

關(guān)鍵詞：三氧化二砷；成纖維樣滑膜細(xì)胞；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制在目前臨床研究中尚未形成統(tǒng)一認(rèn)知，但既往大量報(bào)道中均提示關(guān)節(jié)滑膜的異常增殖反應(yīng)在骨組織、軟骨組織的侵襲與破壞中有著非常重要的作用，這一機(jī)制提示三氧化二砷（arsemic trioxide，ATO）可能通過抑制細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡的方式發(fā)揮對RA疾病的治療效果。研究。引顯示人成纖維樣滑膜細(xì)胞（6broblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs）的過度增生和分泌在RA的發(fā)病和發(fā)展中具有重要作用。本研究通過觀察ATO對人FLSs生長的影響，探討ATO是否對RA具有潛在的治療作用。

1.資料與方法

1.1一般資料 采集2015年5月-2015年11月在我院風(fēng)濕科住院的RA患者的關(guān)節(jié)積液4例（男1例，女3例，41-67歲，平均年齡55.4歲），體外原代培養(yǎng)人FLSs。三氧化二砷（ATO）（10 mg/瓶，購自哈爾濱制藥有限公司）；ELISA試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）

1.2方法

1.2.1人FLSs培養(yǎng)，方法參照文獻(xiàn)。4例患者的關(guān)節(jié)滑液經(jīng)處理后均成功獲得大量成纖維樣細(xì)胞，經(jīng)鑒定該細(xì)胞為CD68陰性細(xì)胞，即FLSs。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，取第3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 ELISA檢測 將滑膜細(xì)胞按1x10個/孔接種于6孔板中，每個標(biāo)本的細(xì)胞接種4孔，每孔1組，培養(yǎng)24 h，按照A-TO終濃度0 umol/L、0.5 umol/L、2.0 umol/L和8.0 umol/L加入相應(yīng)培養(yǎng)孔中繼續(xù)培養(yǎng)。4孔分別為對照組（0 umol/L）、試驗(yàn)1組（0.5 umol/L）、試驗(yàn)2組（2.0 umo]/L）和試驗(yàn)3組（8.0umol/L）。將反應(yīng)24 h后的上清液取出，并通過ELISA法對上清液中TNF-a、IL-1水平進(jìn)行檢測。

1.2.3 MTT檢測 將滑膜細(xì)胞按5x10個，孔接種于96孔板中，每個標(biāo)本的細(xì)胞接種24孔，6孔1組，培養(yǎng)24 h，每組加入相應(yīng)藥物濃度與前述完全一致，另設(shè)空白（只加培養(yǎng)液）組6孔。培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d和5 d后，吸去原培養(yǎng)液，每孔加200ul無血清H-DMEM培養(yǎng)液及20ul的MTr（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心棄上清，每孔加入150 ul DMSO，混勻10min后，在酶標(biāo)儀上測定各孔490 nm處的吸光度A值，最后計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.3觀察指標(biāo) 對比對照組、試驗(yàn)各組細(xì)胞TNF-a、IL-1的檢出水平差異，并觀察各組ATO對人FLSs的生長狀況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料表示為（x±s），用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料表示為[n（%）]，用x2檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 ELISA結(jié)果 試驗(yàn)各組TNF-a、IL-1檢出水平均顯著低于對照組（P<0.05）；試驗(yàn)3組TNF-a、IL-1檢出水平顯著低于試驗(yàn)2組、1組（P<0.05）；試驗(yàn)2 TNF-a、IL-1檢出水平顯著低于試驗(yàn)1組（P<0.05），見表1。

2.2 MTT結(jié)果對照組細(xì)胞生長良好，觀察第1-2 d對照組與試驗(yàn)各組對比無明顯差異（P>0.05）；第3 d開始，試驗(yàn)各組活細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組（P<0.05），且濃度越高，作用劑量依賴性越顯著，見圖1。

3.討論

RA是目前臨床上比較常見的一種自身免疫性疾病，其病因尚未明確。研究表明，F(xiàn)LSs過度增生和分泌是RA發(fā)病的重要基礎(chǔ)，參與關(guān)節(jié)的炎癥發(fā)展和關(guān)節(jié)破壞。FLSs可表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征，呈類腫瘤細(xì)胞樣異常增殖，侵入到軟骨和軟骨下的骨質(zhì)，并產(chǎn)生炎性介質(zhì)、促炎癥細(xì)胞因子及抗炎癥細(xì)胞因子、分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等。TNF-a以及IL-1是RA發(fā)生、發(fā)展過程中重要的炎癥因子，抑制FLSs的增殖和活化是目前研究RA的熱點(diǎn)，可能為臨床上治療RA提供新的思路或靶點(diǎn)。

ATO是傳統(tǒng)中藥砒石的主要成分，對K562、NB4等腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，F(xiàn)LSs具有腫瘤細(xì)胞樣異常增殖的特性，故本研究擬探討ATO是否能影響人FLSs的生長，不同濃度的ATO處理FLSs后。ELISA結(jié)果：試驗(yàn)各組TNF-a、IL-1檢出水平均顯著低于對照組（P<0.05）；MTT顯示：細(xì)胞生長均受到不同程度的抑制，隨藥物濃度增加，抑制效果增強(qiáng)。與對照組細(xì)胞的吸光度A值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示ATO能抑制人FLSs的增殖。

滑膜增生是RA的特征性病理表現(xiàn)，增生的滑膜可形成血管翳依附于軟骨表面，介導(dǎo)骨和軟骨的破壞，F(xiàn)LSs凋亡不足與滑膜增生有關(guān)。介導(dǎo)FLSs凋亡可能是治療RA的有效途徑。本研究通過ELISA和MTT檢測ATO可以有效抑制人FLSs中TNF-a、IL-1的水平，對炎癥以及免疫反應(yīng)產(chǎn)生抑制效果，ATO能夠促進(jìn)人FLSs的凋亡，對人FLSs增殖反應(yīng)抑制效果確切，通過影響細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)代謝的方式加速細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮治療效果。細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜的、嚴(yán)格受多基因調(diào)控的主動細(xì)胞死亡過程。因此，關(guān)于ATO通過怎樣的途徑誘導(dǎo)人FLSs凋亡還需要進(jìn)一步研究?？傊珹TO能影響人FLSs的生長，可作為治療RA的潛在藥物。