張子間，盧 杰，安久濤，孟慶梅，馬艷飛

(山東理工大學 資源與環(huán)境工程學院，山東 淄博 255049)

突變菌PS 2對石油烴污染土壤的修復研究

張子間，盧 杰，安久濤，孟慶梅，馬艷飛

(山東理工大學 資源與環(huán)境工程學院，山東 淄博 255049)

在實驗室條件下模擬了石油烴污染土壤的生物修復試驗，發(fā)現(xiàn)突變菌PS 2對土壤中的石油烴污染物降解速度明顯高于其野生菌株SY-02. 對土壤中的土著微生物、含水量、接種量、分散劑等影響微生物降解速度的因素進行研究，結(jié)果表明：土壤中的土著微生物對石油烴的降解有明顯的促進作用；當土壤含水量在20%～25%之間時，石油烴的降解效果最好，其最高降解率達到93%；當接種量在150～250 mL之間時，突變菌PS 2對石油烴的降解效果最好，其中接種量為200 mL時，其降解率最高為93.4%. 土壤分散劑可以明顯地提高石油烴的生物降解速度，其中稻殼作為分散劑降解效果最好，其最終降解效率達到93.1%. 該研究結(jié)果可以為石油烴污染環(huán)境的高效生物修復提供參考依據(jù)和理論基礎(chǔ).

石油烴；PS 2菌；土壤修復

在石油開采過程中，石油經(jīng)常會灑落到地面，使土壤和地下水受到污染[1-2].石油中的烷烴、環(huán)烷烴和多環(huán)芳烴類物質(zhì)通過食物鏈進入人體，嚴重危害人體健康[3]. 目前治理土壤石油污染的方法有物理法、化學法和生物法，其中生物法由于成本較低、方法簡單、無二次污染等特點，成為土壤石油污染修復的重要發(fā)展方向[4-5]. 傳統(tǒng)的生物法治理土壤石油污染都是利用分離到的野生菌對石油烴污染物的同化降解作用，使其完全礦化，轉(zhuǎn)變?yōu)闊o污染的無機物質(zhì)(CO2和H2O).提高微生物降解效率的方法則主要通過投加不同種類的石油烴降解菌群、改善土壤條件(如pH值、濕度、供氧及添加微量元素等)來實現(xiàn)[6-12]. 而將紫外誘變技術(shù)、離子注入技術(shù)、基因工程技術(shù)、激光誘變技術(shù)等現(xiàn)代工業(yè)微生物育種技術(shù)[13]用于高代謝能力石油烴降解菌的選育，并將選育出的具有高代謝能力的降解菌應用于石油烴污染土壤生物修復的相關(guān)研究較少. 本文在傳統(tǒng)生物修復技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用激光誘變育種技術(shù)選育出的具有高代謝能力的突變菌PS 2對石油烴污染土壤修復進行了研究.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

綠針假單胞菌(P.chlororaphisSY-02).

綠針假單胞菌突變株P(guān)S2：為以P.chlororaphisSY-02的菌懸液作為誘變材料，經(jīng)激光誘變選育而得的高效石油烴降解菌，由本實驗室保藏.

1.2 主要儀器

BS-TE恒溫振蕩培養(yǎng)箱；GC9160氣相色譜儀(日本島津)；TDL-60B型低速臺式離心機；FA-1004型電子天平.

1.3 培養(yǎng)基與試劑

LB培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基[14]. 柴油(本實驗中以柴油代表石油烴)由齊魯石化煉油廠提供(約含65%芳香烴和30%脂肪烴)；其它試劑均為AR級國產(chǎn)試劑.

1.4 實驗土樣

試驗用土采集自張店區(qū)普通農(nóng)田. 土樣經(jīng)碎散、除雜、過篩(1mm)、混均，密封閉光儲存在儲存容器內(nèi)，備用. 對土樣基本性質(zhì)做了測定，測定結(jié)果見表1.

表1 土樣的基本理化性質(zhì)

1.5 實驗方法

1.5.1 土樣的制備

稱取30.27g柴油，加入到15kg的土樣中，混勻，使土壤中柴油含量為2g/kg(即石油烴濃度0.2%)，密封閉光儲存在儲存容器內(nèi)(圖1)，備用.

圖1 實驗土樣圖片

1.5.2SY-02及其突變株P(guān)S2對石油烴污染土壤的降解試驗

供試土樣為沙質(zhì)土壤，置于直徑20cm的玻璃培養(yǎng)皿中，其基本理化性質(zhì)見表1.將SY-02及其突變株P(guān)S2分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，離心收集菌體后用無菌水沖洗菌體并分別制成5%的菌懸液.然后根據(jù)實驗要求取200mLSY-02或其突變株P(guān)S2的菌懸液加入到1kg的模擬石油污染土壤中，同時向土樣中加入50mL的無機鹽培養(yǎng)液，攪拌均勻. 試驗分2組進行，Ⅰ：(1)滅菌土樣+石油烴；(2)滅菌土樣+石油烴+5%P.chlororaphisSY-02菌懸液；(3)滅菌土樣+石油烴+5%PS2菌懸液.Ⅱ：(1)非滅菌土樣十石油烴;(2)非滅菌土樣十石油烴+5%P.chlororaphisSY-02菌懸液；(3)非滅菌土樣十石油烴+5%PS2菌懸液，每個處理重復3次，土樣滅菌采用濕熱法，重復滅菌兩次.將實驗土樣置于室溫20℃條件下避光培養(yǎng)30d，進行石油烴污染土壤的生物修復試驗，并分別于處理后的0、3、5、10、15、20、25、30d取土壤樣品，測定土樣中殘余石油烴的含量.實驗過程中定期翻動土壤改善土壤的通氣狀況，定時向?qū)嶒炌翗友a加無菌水，使各處理中土壤濕度保持相同(保持土壤含水量約25%).

1.5.3 土壤水分含量對突變菌PS2降解石油烴的影響

供試土樣為沙質(zhì)土壤，土壤含水率分別設(shè)定為10%、15%、20%、25%、30%和35%，其余處理同1.5.2節(jié)，處理25d后取樣測定土壤中殘余石油烴的含量.在試驗中適當補充喪失的水分，使土壤中水分含量始終保持在設(shè)定水平.

1.5.4 接種量對突變菌PS2降解石油烴的影響

供試土樣為沙質(zhì)土壤，分別取100mL、150mL、200mL、250mL和300mL突變菌PS2的菌懸液加入到1kg的模擬石油污染土壤中，其余處理同1.5.2節(jié)，處理25d后取樣測定土壤中殘余石油烴的濃度.實驗過程中定時向?qū)嶒炌翗友a加無菌水，使各處理中土壤濕度保持相同(保持土壤含水量約25%).

1.5.5 分散劑對突變菌PS2降解石油烴的影響

分別將60g已滅菌的鋸末、秸稈末、麩皮和稻殼加入到1kg模擬石油污染土壤中，然后根據(jù)實驗要求加入200mL突變菌PS2的菌懸液，同時向土樣中加入50mL的無機鹽培養(yǎng)液，攪拌均勻.處理20d后取樣測定土壤中殘余石油烴的含量.實驗過程中定時向?qū)嶒炌翗友a加無菌水，使各處理中土壤濕度保持相同(保持土壤含水量約25%).

1.5.6 石油烴的提取與測定

稱取土樣5.0g,置于50mL碘量瓶中靜置過夜,分3次加入正己烷溶劑為20mL、10mL、10mL，每次混合均勻中速振蕩30min，置于高速離心機離心15min.離心后的上清液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，沉淀部分再重復振蕩離心步驟.合并3次振蕩離心獲得的上清液，定容后測定石油烴的含量并計算降解率。石油烴(柴油)濃度測定采用氣相色譜法(GC)[15].

2 結(jié)果與討論

2.1 SY-02及其突變株P(guān)S 2對石油烴污染土壤的降解試驗

在石油烴污染土壤生物修復實驗中，SY-02及其突變株P(guān)S2對石油烴的降解效果見圖2.

由圖2(a)可以看出，與對照組(滅菌土樣+石油烴)相比，P.chlororaphisSY-02及其突變菌PS2的石油烴最終降解率分別達到了70%和90%以上，取得了較好的降解效果.而由圖2(b)可以看出在30d的修復期內(nèi)，與對照組(非滅菌土樣+石油烴)相比接種P.chlororaphisSY-02和PS2菌液的兩個處理土壤中的石油烴降解率分別達到了72.5%和98%. 實驗結(jié)果還表明：在相同的修復時間內(nèi)采用非滅菌土樣處理Ⅱ的石油烴降解效率明顯高于采用滅菌土樣處理Ⅰ.這主要是因為石油烴是由多種化學組分組成，因此須由各種功能不同的微生物共同作用才可能徹底降解其中的石油烴污染物. 在非滅菌土樣中P.chlororaphisSY-02及其突變菌PS2分別與土壤中的微生物組成了石油烴降解菌群，從而提高了石油烴污染物的微生物降解效率.

(a) 滅菌土樣

(b) 非滅菌土樣

2.2 土壤水分含量對突變菌PS 2降解石油烴的影響

水分的含量是影響石油烴微生物降解轉(zhuǎn)化的一個重要因素；同時在土壤環(huán)境中，水分還參與所有物質(zhì)的轉(zhuǎn)運、吸收、消化以及生物酶的反應，沒有水分微生物就無法生存，因此土壤中水分含量的高低直接影響到微生物降解石油烴的效率.不同含水率對突變菌PS2石油烴降解效率的影響見圖3.

圖3 不同含水率對石油烴降解的影響

由圖3可知，當水分含量在25%時，突變菌PS2生長最好，石油烴的降解效率最高，可達到93%. 實驗結(jié)果表明突變菌PS2的代謝需要一定的空隙度和較高的空氣相對濕度，適當?shù)暮什粌H有利于土壤中氣體的交換，同時還使菌體的表面保持濕潤，有利于土壤中微生物的生長和對石油烴的降解.因此本修復試驗中設(shè)定土壤含水率25%較為合適.

2.3 接種量對突變菌PS 2降解石油烴的影響

接種量對突變菌PS2降解石油烴的影響結(jié)果見圖4.

圖4 不同接種量對石油烴降解的影響

由圖4可以看出，當接種量在150～250mL之間時，突變菌PS2對石油烴的降解效果最好，其中接種量為200mL時，其降解率最高為93.4%. 當接種量大于200mL時，隨著接種量的增加石油烴的降解率不斷降低，這可能是由于降解菌的密度抑制作用造成的.因為隨著接種量的增加，突變菌PS2大量生長，菌體密度大大增加，導致單位體積內(nèi)生物量過多，造成土壤中碳源和微量元素短缺，從而不利于單個菌株的生長及微生物對石油烴的吸收降解，而且過多的接種量還會造成污染土壤修復成本的增加.因此本試驗中選擇200mL為較合適接種量.

2.4 不同分散劑對突變菌PS 2降解石油烴的影響

各種分散劑不僅能膨松土壤，使土壤顆粒間保持一定的孔隙度，提供氧氣、二氧化碳遷移和交換的有利條件，還可以保持土壤溫度，調(diào)節(jié)土壤水分的含量，從而有利于微生物對石油烴的降解. 由圖5可以看出，添加各種分散劑可以明顯地提高突變菌PS2對石油烴的降解速率，其中稻殼和鋸末作為分散劑對石油烴降解效率的提高影響較大，其最終石油烴降解率分別比對照組提高了23%和20%，麩皮和秸稈末次之.這是由于麩皮和秸稈末粉碎度較小，減少了氧氣供給，因而不利于突變菌PS2的生長和對石油烴的降解，使得最終降解率較低.

圖5 不同分散劑對石油烴降解的影響

3 結(jié)論

(1)通過滅菌土壤和未滅菌土壤對照試驗發(fā)現(xiàn)，在滅菌土壤和未滅菌土壤中，突變菌PS2的石油烴降解率都明顯高于野生菌P.chlororaphisSY-02.

(2)土壤中的土著微生物對石油烴的降解起促進作用，這是因為土著微生物在與污染物接觸過程中，通過誘導也可以獲得降解能力.

(3)微生物對石油烴的降解易受土壤環(huán)境的影響，土壤含水量、菌液接種量、土壤分散劑等都能在很大程度上改變微生物的降解速度. 當水分含量在20%～25%之間時，突變菌PS2對石油烴的降解效果最好，其最高降解率達到93%；當接種量在150～250mL之間時，突變菌PS2對石油烴的降解效果最好，其中接種量為200mL時，其降解率最高為93.4%. 土壤分散劑可以顯著地提高石油烴的生物降解速度，其中稻殼作為分散劑降解效果最好，其最終降解效率達到93.1%.

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(編輯：姚佳良)

Remediation of petroleum hydrocarbons contaminated soil by degrading mutant strain PS 2

ZHANG Zi-jian, LU Jie, AN Jiu-tao, MENG Qing-mei, MA Yan-fei

(School of Resources and Environmental Engineering, Shandong University of Technology, Zibo 255049, China)

Through simulating biodegradation experiment in soil contaminated by petroleum hydrocarbon, the researchers discovered that the biodegradation rate of mutant PS 2 was much higher than its wild strain SY-02. The influence of indigenous microorganisms, water content, inoculation amount and dispersant on bioremediation was also studied. The optimal water content and inoculation amount for bioremediation were 20% to 25% and 200 mL in simulating soil. The increase of dispersant can obviously enhance the biodegradation rate,and the simulation experiments showed that the petroleum hydrocarbon biodegradation rate of four kind of dispersant was higher than the soil (control) in beaker. When rice husk was treated as dispersant, its degradation rate was highest,and the final degeneration rate was 93.1%. The results can provide a reference and theoretical basis for the application of bioremediation in petroleum hydrocarbon-contaminated soil.

petroleum hydrocarbon; degrading strain PS 2;bioremediation of soil

2016-09-22

山東省自然科學基金項目(ZR2012DL05)

張子間，男，zhangzijian1116@163.com

1672-6197(2017)04-0001-04

X172

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